A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

Resumen

Se describe un método simple, rápido y robusto para la formación de Candida albicans Biofilms de 96 placas de microtitulación bien y su utilidad en las pruebas de sensibilidad antifúngica de las células dentro de los biofilms.

Resumen

Candida albicans es la causa más frecuente de las infecciones por hongos en una creciente población de pacientes inmunocomprometidos y la candidiasis es ahora la tercera enfermedad más común en los hospitales de los EE.UU.. Diferentes manifestaciones de la candidiasis se asocia con la formación de biofilm, tanto en los tejidos del huésped y / o dispositivos médicos (catéteres es decir). Formación de biopelículas lleva consecuencias negativas en la clínica, como las células dentro de los biofilms están protegidos de las respuestas inmunitarias del huésped y de la acción de los antifúngicos. Hemos desarrollado un modelo simple, rápido y robusto in vitro para la formación de C. biofilms albicans de 96 y placas microtiter, que también puede ser utilizado para las pruebas de bio-película de sensibilidad antifúngica. La lectura de este ensayo es colorimétrico, basado en la reducción de XTT (una sal de tetrazolio) por las células metabólicamente activas biopelículas fúngicas. Un experimento típico dura aproximadamente 24 horas para la formación de biofilm, con un adicional de 24 horas para las pruebas de sensibilidad antifúngica. Debido a su simplicidad y el uso de materiales de laboratorio comúnmente disponibles y el equipo, esta técnica democratiza la investigación del biofilm y representa un paso importante hacia la normalización de las pruebas de sensibilidad antifúngica de las biopelículas fúngicas.

Protocolo

1. Preparación de C. albicans

C. albicans es un microorganismo del grupo de riesgo 1/BSL1. Recuerde siempre que un buen uso de las técnicas de asepsia / estéril para trabajar con este microorganismo y seguir los procedimientos institucionales para la eliminación apropiada de tales materiales.

1. Preparar un cultivo de una noche de C. albicans en YPD (levadura peptona dextrosa) medio líquido mediante la inoculación de una sola colonia de C. albicans en 25 ml de YPD.
2. Incubar la cultura en un agitador orbital (180 rpm) a 30 ° C durante la noche. La mayoría de C. albicans cepas crecerá a medida que las células de levadura bajo estas condiciones.
3. Centrifugar los cultivos durante la noche (alrededor de 3.000 rpm, 5-10 minutos), lavar las células dos veces con PBS estéril, y resuspender el precipitado final en unos 20-25 ml de medio RPMI 1640 tamponado con 165 mM de ácido morpholinepropanesulfonic a pH 7,0 y pre-calentado a 37 ° C (a partir de ahora este medio se conoce simplemente como "RPMI 1640").
4. Recuento de células con un hemocitómetro. Después de contar, preparar una suspensión de células a una densidad final de 1,0 x 10 ⁶ células / ml en RPMI 1640.
   Nota: Dado que las células tienen una tendencia a agregarse, es importante agitar vigorosamente entre los lavados y antes de pipetear.

2. Instalación de la placa de 96 pocillos de microtitulación para la formación del biofilm

1. Con una pipeta multicanal añadir 100 ml de C. albicans suspensión en los pozos seleccionados de la placa de 96 pocillos de microtitulación (-s). No agregar celdas a los pozos en la columna 12, ya que estos sirven como controles negativos.
2. Cubrir la placa de microtitulación de todo con su tapa original, sellado con parafilm, colocarlo dentro de una incubadora y se incuba durante 24 horas a 37 ° C. La duración de la incubación se puede adaptar al diseño experimental específico. Por ejemplo, es posible examinar la cinética de formación del biofilm en un período de 24 a 48 horas en la siembra y el procesamiento de múltiples placas de cada plato en diferentes puntos temporales (es decir, 2, 4, 8, 12, 24 y 48 horas)
3. Después de la formación del biofilm, usando una pipeta multicanal aspirar el medio con cuidado de no tocar y alterar las biopelículas que se forman en cada uno de los pozos.
4. Utilizando una pipeta multicanal placas se lavan tres veces en PBS estéril (200 l por pocillo). Por otra parte, el uso de una lavadora automática de placas de microtitulación. Entre los mismos, y sobre todo después del último lavado, la fuga de las placas en posición invertida por secante con toallas de papel para quitar cualquier residuo de PBS. En este punto, los biofilms formados en el fondo de los pozos deben ser claramente visibles incluso a simple vista y también se puede visualizar mediante un microscopio invertido (Figura 1). Los biofilms son ahora listo para ser procesado por las pruebas de sensibilidad antifúngica ensayos.
   (Si el objetivo principal del experimento es evaluar el grado de formación del biofilm, las placas están listas para ser procesadas por el método colorimétrico. Para ello, el reactivo XTT / menadiona (ver paso 3) se pueden agregar y el color resultante leer con un lector de placas de microtitulación).

3. Pruebas de sensibilidad antifúngica de las biopelículas

1. A partir de soluciones madre o el polvo, preparar una solución de trabajo en medio RPMI 1640 de cada uno de antimicóticos para ser probado. Las concentraciones típicas de alta son 1.024 mg / ml para fluconazol, y 16 mg / ml tanto para la anfotericina B y caspofungina. Otras concentraciones pueden ser utilizados para los diferentes agentes.
2. Con una pipeta multicanal, 200 l de la alta concentración de trabajo de antimicóticos para los pozos correspondientes en la columna 1 de cada placa de microtitulación que contienen las biopelículas fúngicas.
3. Añadir 100 ml de RPMI 1640 a cada pocillo de las columnas 2 a 10.
4. Añadir 100 ml de RPMI 1640 a los pozos en la columna 11.
5. Eliminar 100 L de agente antifúngico de los pozos de la columna 1 y añadir a los pozos adyacentes en la columna 2 (ya que contiene 100 l de media).
6. Mezclar el contenido y pipeteando arriba y abajo para realizar una dilución doble de serie, y eliminar las puntas.
7. Repita el movimiento a la derecha hasta los pozos de la columna 10, después de lo cual se descarta la final de 100 l de volumen de los pozos de la columna 10 después de la mezcla. De esta manera, una serie de diluciones al doble de su agente (-s) de interés se han creado a partir de la mayoría concentrados en los pozos de la columna 1, por lo que se concentró en los pozos de la columna 10. Biofilms sin respuesta en la columna 11 servirán como controles positivos, y los pozos se agotan en la columna 12 servirán como controles negativos.
8. Se cubren las placas con sus tapas, sello con parafilm y se incuba durante 24 -48 horas a 37 ° C.
9. Después del período de incubación, lavar los platos como en el Paso 2.4 antes (3 x PBS).
10. Con una pipeta multicanal añadir 100 ml de XTT / menadiona solución a cada pocillo que contenga un biofilm pre-lavado, así como a los pozos de control negativo para la medición de la X de fondoTT-colorimétrico los niveles.
    1. La XTT se prepara como una solución saturada a 0,5 g / L de lactato de Ringer estéril, PBS o solución salina, que debe ser esterilizada por filtración, con un 0,22 micras de poro del filtro de tamaño. La solución XTT es sensible a la luz, por lo que se debe cubrir con papel de aluminio durante la preparación. Una vez preparada y esterilizada por filtración, alícuota en 10 ml de volumen de trabajo, y guardar a -70 ° C. Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio. Descongele sólo como tubos que sean necesarias para un experimento en particular antes de su uso.
    2. Menadiona se prepara como una solución de 10 mM de valores en acetona al 100%, alícuotas en volúmenes más pequeños (unos 50 l) y almacenados a -70 ° C. Prepare la solución XTT / menadiona antes de su uso, mediante la adición de 1 l de la solución madre de menadiona con un tubo que contiene 10 ml de la solución XTT descongelado.
11. Se cubren las placas en papel de aluminio y se incuban en la oscuridad durante 2 horas a 37 ° C.
12. Descubrir las placas. Con una pipeta multicanal eliminar el 80 l del sobrenadante resultante de color de cada pozo y la transferencia en los pocillos correspondientes de una nueva placa de microtitulación.
13. Leer la placa (-s) en un lector de placas microtiter a 490 nm.
14. Calcular la concentración inhibitoria mínima sésiles SMIC50 y SMIC80, que son las concentraciones de antifúngicos en el que se detecta una disminución del 50% o 80% en las lecturas colorimétricas en comparación con el control de biofilms formados en la ausencia de medicamentos antifúngicos (en este caso los valores de la columna 11 , recuerda también a restar los valores de los controles negativos de los pozos en la columna 12 contiene sólo XTT). Resultados SMIC se puede presentar como una tabla (es decir, múltiples aislamientos contra varios antifúngicos) o, alternativamente, los resultados de cada individuo aislado de hongos contra hongos pueden ser presentados en forma de gráfico mediante el trazado de la inhibición por ciento frente a la concentración de antimicóticos.

Ejemplo: Después de restar los valores en el control negativo, la densidad óptica promedio de las biopelículas de control formado en la columna 11 es 1,32. El SMIC50 es la concentración más baja antifúngico que conduce a la reducción de> 50% en las lecturas colorimétricas, en este caso menos de 1,32 x 50/100 = 0,66. Asimismo, el SMIC80 es la concentración más baja antifúngico con lo que disminuye> 80% en las lecturas colorimétricas, en este caso menos de 1,32 x 20/100 = 0.264.

4. Resultados representante

La figura 1 muestra una microfotografía de una C. albicans formación de biopelículas sobre el fondo de un pozo en una placa de microtitulación de 96 pocillos tomadas con un microscopio invertido. La figura 2 muestra XTT-colorimétrico lecturas (OD ₄₉₀ valores) para cada una de las biopelículas de 11 C. albicans cepa de tipo salvaje formado en cada una de las 8 líneas diferentes de la misma placa de 96 pocillo de microtitulación. La Figura 3 muestra la actividad de la anfotericina B en diferentes concentraciones en contra de C. albicans biopelículas, las flechas indican SMIC50 y SMIC80 valores.

Figura 1. (A) El panel A muestra una microfotografía tomada con una cámara conectada a un microscopio invertido de una C. albicans formación de biopelículas sobre el fondo del pozo después de la aspiración de medio RPMI y posteriores lavados con PBS. (B) Una micrografía de una típica C. albicans biofilm visualiza mediante microscopía electrónica de barrido. Las barras son 100 micras y 10 micras para los grupos A y B, respectivamente.

Figura 2. Formación de múltiples equivalentes C. albicans biopelículas en placas de 96 pocillos de microtitulación. lecturas colorimétricas (OD ₄₉₀ valores) de XTT de reducción de los ensayos de los biofilms formados por una C. albicans de tipo salvaje en los pozos de placas de microtitulación. Los valores son para el 11 de biofilms independiente formada en cada uno de 8 líneas diferentes de la misma placa de 96 pocillo de microtitulación. Los resultados de las diferentes filas se compararon mediante análisis de un solo sentido de varianza y el test de Bartlett para homogeneidad de varianzas y comparaciones múltiples de Bonferroni el post-test. No se observaron diferencias estadísticamente significativas se observaron al comparar todos los pares de filas entre sí (P> 0,05).

Figura 3. Los resultados típicos de las pruebas de sensibilidad antifúngica contra C. albicans biofilms. Gráfico que muestra los resultados típicos de la eficacia de diferentes concentraciones de anfotericina B contra las biopelículas de C. albicans cepa de tipo salvaje. Los valores se expresan como porcentaje medio de lecturas colorimétricas para los ensayos de reducción de XTT-en comparación con el control de los pozos. SMIC50 y SMIC80 valores se indican con flechas.

Discusión

A continuación se describe una forma simple, rápida, económica y altamente reproducible 96 modelo y placa de microtitulación para la formación de biopelículas de Candida, junto con un método colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células dentro del biofilm con XTT. Este modelo 96 y placas de microtitulación para la formación de biofilm fue desarrollado originalmente para C. albicans, pero se puede utilizar para otras especies de Candida. y fácilmente adaptable a otr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier