ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Summary

في كثير من الحالات السريرية والبيولوجية وأنه من المفيد لدراسة العمليات الخلوية لأنها تتطور في المكروية وطنهم. نحن هنا وصف التجمع ، واستخدام المجهر الألياف البصرية المنخفضة التكلفة التي يمكن أن توفر الوقت الحقيقي التصوير في خلية ثقافة والدراسات الحيوانية ، والدراسات السريرية المريض.

Abstract

كثير من الدراسات السريرية والبيولوجية وتتطلب دراسة وتحليل طولية الشكل والوظيفة لقرار المستوى الخلوي. تقليديا ، يتم تشغيل تجارب متعددة في موازاة ذلك ، مع إزالة عينات فردية من هذه الدراسة في وقت نقاط متتابعة لتقييم بواسطة المجهر الضوئي. وقد تم تطوير تقنيات intravital عدة ، مع مبائر ، multiphoton ، والفحص المجهري التوافقي second يتظاهرون جميع قدرتهم على استخدامها في التصوير في الموقع ^1. مع هذه الأنظمة ، ومع ذلك ، فإن البنية التحتية المطلوبة هي عملية معقدة ومكلفة ، والتي تشمل نظم الليزر والمسح الضوئي ومصادر الضوء المعقدة. هنا نطرح على بروتوكول لتصميم وتجميع لmicroendoscope ذات الدقة العالية التي يمكن أن تبنى في يوم واحد باستخدام الجاهزه - مكونات تحت 5،000 دولار أمريكي. منصة يوفر مرونة من حيث دقة وضوح الصورة ، الحقل من رأي ، وتعمل الطول الموجي ، ونحن تصف كيف يمكن تعديل هذه المعلمات بسهولة لتلبية الاحتياجات المحددة للمستخدم النهائي.

لقد اكتشفنا وغيرهم على استخدام microendoscope عالية الدقة (HRME) في المختبر في زراعة الخلايا ^2-5 ، في ⁶ استئصاله والأنسجة الحية الحيوانية ^2،5 ، والأنسجة البشرية في الجسم الحي ^2،7. وأفاد شاهد على استخدام عدة عوامل التباين الفلورسنت مختلفة ، بما في ذلك بروفلافين ^2-4 ، benzoporphyrin المشتقة خاتم monoacid A ⁵ (BPD - MA) ، و ^6،7 fluoroscein ، والتي تلقى كامل ، أو موافقة من ادارة الاغذية والعقاقير الفحص لاستخدامها في البشر. عالية الدقة microendoscopy ، في شكل الموصوفة هنا ، قد نداء الى مجموعة واسعة من الباحثين العاملين في مجال العلوم الأساسية والسريرية. هذه التقنية تتيح مقاربة فعالة واقتصادية ، التي تكمل التقليدية المجهري الفوق ، من خلال تمكين المستخدم من أداء عالية الدقة ، والتصوير الطولي في الموقع.

Protocol

1. Microendoscope الجمعية

ينبغي النظر في microendoscope عالية الدقة الموصوفة هنا (الشكل 1A) ، وتكوين قاعدة ممكنة مع وجود اختلافات عدة في التجمع والتطبيق. نحن تصف بالتفصيل هنا تجسيدا للمنصة التي صممت ليتم استخدامها مع بروفلافين كعامل النقيض من الفلورسنت. بروفلافين النووية هو مشرق وصمة عار على امتصاص موجات الذروة والانبعاثات من 445 نانومتر و 515 نانومتر على التوالي. واستخدام عوامل التباين الأخرى تتطلب من المستخدم لتحديد الإثارة ، والانبعاثات ، ومرشحات مزدوج اللون مناسب. عدة عناصر من microendoscope عالية الدقة والنوعية ، ويمكن الحصول عليها من بائعين متعددين. على سبيل المثال ، والمكونات الميكانيكية المواقع المتوفرة من Thorlabs ، نيوبورت ، ينوس بين الآخرين. كاميرات CCD المدمجة المتوفرة من الشركات بما في ذلك نقطة رمادية البحوث وProsilica وRetiga ؛ ينبغي اختيار حساسية الكاميرا مع النظر في سطوع fluorophore لاستخدامها ، وكذلك معدل الإطار المطلوب. ويمكن الحصول على الطاقة العالية الثنائيات الخفيفة (المصابيح) من Luxeon ، كري ، وNichia من بين آخرين. الألياف البصرية وتتوفر باقات من سوميتومو ، فوجيكورا ، وشوت. في اختيار مكونات لتطبيق معين ، يجب على المستخدم النظر في العلاقات الملازمة لالمجهري مضان بين تركيز fluorophore ، photobleaching وشدة الإضاءة ، وحساسية الكاميرا ، والكسب ، ومدة التعرض.

1. توصيل 6 "قضبان القفص إلى 1.5" قضبان القفص ، لتشكيل زوج من 7.5 "قضبان طويلة. برغي هذه القضبان في وجه واحد من وحدة المرآة أضعاف. برغي 0.5" قضبان في وجه الآخر. الشريحة المكعب على قضبان القفص قفص ، عن طريق خفض اثنين من خلال الثقوب. المسمار 2 "في وجه قضبان الجانب من المكعب قفص (1B الشكل).
2. نعلق الكاميرا إلى لوحة قفص باستخدام C - جبل لمحول SM1. تأمين لوحة قفص على قضبان القفص 0.5 "، تدفق مع وحدة مواجهة مرآة أضعاف.
3. إدراج "أنبوب" العدسة في 3 "أنبوب عدسة طويلة وتأمين العدسة مع الاحتفاظ حلقة ، وينبغي تحديد البعد البؤري للعدسة بحيث يتم أخذ عينات من النوى من حزمة من الألياف البصرية من قبل اثنين على الاقل من المتوقع عندما بكسل على الكاميرا. إسقاط مرشح الانبعاثات في الأنبوب على الجزء العلوي من الحلقة الأولى الاستنادية ، وإضافة حلقة أخرى لضمان التصفية في المكان. الالتزام باتفاقية اتجاه تصفية من قبل الشركة المصنعة أشارت التصفية. برغي أنبوب العدسة إلى جانب قفص مكعب أقرب إلى الكاميرا CCD. 1C لاحظ أنه في الشكل ، وتظهر هذه العدسة والفلتر دون أنبوب العدسة 3 "للوضوح.
4. توصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر وعرض الصور على الشاشة. المباشرة الجمعية الكائن في قفص بعيد وحرك المكعب القفص على طول القضبان حتى يظهر في صورة التركيز. تأمين المكعب قفص في هذا الموقع. (وهذا هو طريقة بسيطة لضمان أن أنبوب العدسة وتكوين صورة مركزة عند دمجها مع عدسة اللانهاية لتصحيح الهدف).
5. إدراج مزدوج اللون في مرآة ومكان حامل في 45 درجة في المكعب القفص.
6. المسمار العدسة الهدف ، عبر RMS إلى محول الصفحات SM1 وأنبوب العدسة قابل للتعديل ، في وجه من المكعب قفص قبالة أنبوب حامل العدسة. ويمكن استخدام Z - مترجم بدلا من أنبوب العدسة قابل للتعديل لتسهيل التركيز. المسمار موصل SMA إلى لوحة القفص ويشن هذا على القضبان ، وعلى مسافة نحو العمل للعدسة الهدف.
7. شن LED على طبق من القفص والانزلاق على نهاية 2 "قضبان. إضافة إلى عدسة 0.5" أنبوب العدسة بحيث عندما يتم شد هذا الأنبوب الى جانب من المكعب القفص ، فإنه سيتم تشكيل صورة LED الذي يملأ الفتحة الخلفية للعدسة الهدف. وهذا التكوين (كولر الإضاءة) ضمان مضاءة بشكل موحد لمواجهة القريبة من حزمة من الألياف البصرية. إضافة الإثارة إلى تصفية الانبوب 0،5 عدسة "وآمنة في مكان مع الاحتفاظ حلقة (الشكل 1C).
8. إرفاق موصل SMA إلى حزمة من الألياف البصرية. المسمار حزمة SMA connectorized في وعاء SMA محمولة على قضبان القفص. المباشرة في نهاية البعيدة للحزمة النطاق العريض نحو مصدر الضوء (الإضاءة الفلورسنت تكفي) ومراقبة صورة الوجه حزمة الداني على الكاميرا CCD. ضبط موضع العدسة الهدف من خلال الشد داخل أو خارج القفص حتى المكعب صورة حزمة الألياف يظهر في التركيز. ينبغي أن النوى الفردية تكون مرئية بشكل واضح (الشكل 2).

2. غرين لنس الجمعية

ويمكن زيادة هذا القرار المكاني للmicroendoscope عن طريق ربط عدسة الصغيرة أو التجميع العدسة إلى الطرف البعيد من حزمة من الألياف. تم تكوين هذه البصريات مثل أنه بدلا من وضع ربطة طرف مباشرة على الأنسجة ، والتقط طرف على سطح الانسجة مع demagnification ، وبالتالي زيادة وتيرة أخذ العينات المكانية التي تفرضها GUID الخفيفجي النوى من حزمة من الألياف. درجة demagnification يتوافق مع الزيادة في القرار المكانية ، وفي الوقت نفسه ، إلى انخفاض متناسب في مجال الرؤية من. عدسة مكونات مؤشر الانحدار (غرين) متوافقة مع الألياف البصرية وتتوفر من GrinTech ، NSG ، شوت ، من بين أمور أخرى ، ويمكن المستعبدين مباشرة إلى الطرف البعيد من حزمة من الألياف.

1. حدد عدسة غرين مع التكبير والمسافة المطلوبة للعمل التطبيق الخاص بك. تأكد من أن قطره يفوق العدسة للحزمة الألياف كنت تخطط للعمل مع. نوصي بأن يتم تنظيمها حزمة الألياف وعدسة غرين على 3 محاور منفصلة مراحل لتحديد المواقع دليل تحت المجهر منخفضة الطاقة أو المجسام للمحاذاة دقيقة قبل الرابطة.
2. وضع قطرة من مادة لاصقة البصرية (مثل العلاج بالأشعة فوق البنفسجية لاصقة نورلاند) على عدسة أو مواجهة حزمة. جعل هذين العنصرين في اتصال باستخدام positioners اليدوي. يعرض واجهة لضوء الأشعة فوق البنفسجية للجرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
3. وسعها لحماية العدسة غرين واجهة المستعبدين ، وطولها أقل من أنابيب الألومنيوم الشعرية (شركة أجزاء صغيرة) يمكن استخدامها لإحاطة مشتركة. الشريحة أكثر من الأنبوب المشترك وآمنة في مكان مع الايبوكسي. ويمكن استخدام أنابيب الحرارة يتقلص إلى الانتهاء من التجميع.

3. Microendoscope التصوير

1. تطبيق عامل على النقيض من الخلايا أو الأنسجة ليمكن تصوير. مع بروفلافين (0.01 ٪ W / V في برنامج تلفزيوني) ، يمكن التصوير في المختبر من الخلايا في الثقافة ستؤديها حضانة قصيرة (<1 دقيقة) وشامل الشطف. التصوير عينات الأنسجة الحية أو السابقين في أنسجة الجسم الحي هو ممكن التطبيق الموضعي التالية للصباغة. تم العثور على امتصاص بروفلافين في ظل هذه الظروف أن تكون شبه فورية ، والتصوير ممكنا في غضون بضع ثوان ودائم لعدة دقائق.
2. وضع حزمة من الألياف البصرية في ضوء الاتصال مع عينة ليمكن تصوير. التصوير الخلايا عندما تكون في الثقافة أو السابقين عينات الأنسجة الحية ، نوصي تصاعد نهاية البعيدة للحزمة الألياف لاعبا اساسيا في تأمين مراحل مع تحديد المواقع دليل على محاور XYZ لتحقيق الاستقرار أثناء التصوير.

4. ممثل النتائج :

عند تجميعها بشكل صحيح ، سوف تعمل كما microendoscope مجهرا برنامج التحصين الموسع ومضان ، نقلت من خلال حزمة من الألياف البصرية متماسكة. من أجل تحقيق النتائج المثلى التصوير ، ينبغي إيلاء الاهتمام لضمان تلبية ثلاثة شروط رئيسية هي :

1. وينبغي تصوير الوجه القريبة من حزمة من الألياف على الكاميرا CCD دون يزيل التباؤر ، من أجل تحقيق حل كامل للنظام. الشكل 2A ، ب ، ج يبرهن على وجود جزء من حزمة من الألياف تصوير مع تركيز الفقراء ، ويزيل التباؤر طفيفة ، والتركيز جيدا على التوالي. تم العثور على التركيز الأمثل عن طريق ضبط الموقف المحوري للعدسة الهدف النسبي لمواجهة حزمة.
2. وينبغي مواجهة القريبة من حزمة ألياف ضوئية بشكل منتظم على طول قطرها الكامل (حقل من رأي). كما هو موضح في نص البروتوكول (1.7) ، ويتم تحقيق هذا عن طريق تكوين البصريات إنارة لإضاءة كوهلر. ويبين الشكل 2D صورة مضيئة المكتسبة عند عينة موحدة فلوري في هذا التكوين المفضل ، مع 2E الشكل يدل على نتيجة المقابلة تحت الإضاءة الحرجة. في الحالة الأخيرة ، يتم تصوير هيكل الصمام على وجه حزمة الألياف ، مما أدى إلى ظهور هذا النمط غير المرغوب فيه فرضه على هيكل العينة الحقيقية.
3. يجب على وجوه القريبة والبعيدة من حزمة من الألياف تكون نظيفة وخالية من الخدوش ورقائق البطاطس. الرقم 2F يوضح وجود الحطام التي تعلق على وجه حزمة ، مع الضرر في شكل شريحة صغيرة في 5:00 على محيط من الألياف. يمكن إزالة الحطام من حزمة يواجه عن طريق تنظيف في نفس منوال موصلات الألياف البصرية التقليدية ، مع ورقة العدسة والأيزوبروبانول ، أو معيار أدوات تنظيف الألياف البصرية. إذا خدش طرفي حزمة الألياف أو متكسرة ، أو إذا كانت حزمة فواصل على طوله ، ويمكن مصقول الوجه المسطح بواسطة دليل القياسية ، أو تلميع التقنيات الميكانيكية. نوصي 12-15 ميكرومتر اللف ورقة لتلميع an الخشنة الأولية ، مع تلميع النهائي على الورق 0،5-1،0 ميكرون.

يوضح الشكل 3A التصوير من 1483 الخلايا في المختبر ، وبعد وضع العلامات مع التنسيب وبروفلافين ضوء حزمة الألياف عارية على العينة. الرقم 3B يدل على تحسن في القرار المكانية وانخفاض في مجال الرؤية من توفرها العدسة 2.5x غرين المستعبدين الى الطرف ملزمة. 1 يوضح الفيلم في التصوير المجراة من منصة الدهون الثدي في نموذج الفأر. هنا ، تم تمرير حزمة من الألياف مع قطر 0.5 مم الخارجي (330 ميكرون حقل من رأي) من خلال إبرة عيار 21 ومتقدمة في الأنسجة. الخلايا الدهنية تكون مرئية بشكل واضح ، مع الحركة نظرا لدورة القلب الظاهر في هذه الصفقة في 15لقطة في الثانية. يوضح الشكل 3C التصوير من الغشاء المخاطي للفم في المتطوعين الأصحاء الإنسان ، وهذه المرة باستخدام حزمة أكبر من الألياف مع قطر 1.5 مم الخارجي (1،4 مم حقل من رأي). في جميع الأمثلة المعروضة ، كان يستخدم كعامل بروفلافين العلامات النقيض الفلورسنت النووية.

الشكل 1. تجميع وmicroendoscope عالية الدقة (HRME). (أ) رسم تخطيطي لنظام HRME. (ب) الجمعية العامة لهيكل الدعم الميكانيكية الرئيسية. (ج) إضافة العناصر البصرية ، وإنارة LED ، وكاميرا CCD. (د) من نظام تصوير HRME ، وتعبئتها في 10 "× 8" الضميمة س "2.5.

الشكل 2. إعداد HRME. أمثلة من التصوير مع حزمة من الألياف البصرية في التركيز الفقراء (أ) و (ب) على مقربة من التركيز جيدا ، (ج) التركيز المثالية. في (د) ، يتم تصوير هدف موحد الفلورسنت في ترجيح كفة حزمة من القاصي تحت الإضاءة (موحد) كولر. (ه) وتصوير هدف موحد تحت الإضاءة الفلورسنت حرجة ، مع بنية مصدر الظاهر على الكائن. (و) يمكن قطع الأنسجة والخلايا التمسك مواجهة حزمة الألياف ، التي هي أيضا عرضة لاضرار طفيفة في محيطه.

الشكل 3. التصوير مع HRME. (أ) 1483 الخلايا في المختبر ، التقط مع حزمة الألياف العارية (IGN-08/30) بعد وضع العلامات مع 0.01 ٪ بروفلافين (ث / ت). (ب) ونفس الثقافة خلية 1483 كما هو مبين في الفقرة (أ) ، تصوير مع مجموعة من الألياف مع 2.5x عدسة غرين المرفقة. (ج) صورة طبيعية عن طريق الفم المخاطية الإنسان في الجسم الحي ، وبعد التطبيق الموضعي لل0.01 ٪ بروفلافين (ث / ت).

الفيلم 1. التصوير لوحة الدهون من الثدي ماوس عبر ادراج 450 ميكرومتر الخارجي قطرها حزمة الألياف داخل تجويف إبرة عيار 21 تمريرها إلى الأنسجة. وتم تسليم بروفلافين 0.01 ٪ (W / V) إلى موقع التصوير من خلال إبرة نفسه قبل الإدراج من الألياف التصوير. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

Discussion

وصف microendoscopy تقنية عالية القرار ينص هنا الباحثين في مجالات البحوث الطبية الحيوية الأساسية والسريرية مع طريقة مرنة وقوية وفعالة من حيث التكلفة لتصور بالتفصيل الخلوية في الموقع. وقد وصفت لدينا بروتوكول لتجميع نظام التصوير وأظهر استخدامها في زراعة الخلايا في المختبر ، والحيوان ، والأنسجة البشرية في الجسم الحي. في حين أن نتائج التصوير المقدمة هنا تستخدم بروفلافين كعامل النقيض الفلورسنت ، وقد أثبتت جماعات أخرى إصدارات نظام الإضاءة LED مع موجات والمرشحات المختارة لمباراة الإثارة / الانبعاثات أطياف الأصباغ الأخرى ^5-7.

في البداية يتم تحديد القرار والنظر في الميدان من جانب تباعد الأساسية إلى النواة وقطرها التصوير من حزمة من الألياف البصرية. وقد استخدمنا حزم مع ما يقرب من 4 تباعد الجوهرية الأساسية ميكرون ، وبأقطار من 330 ميكرومتر التصوير (فيلم 1) ، 720 ميكرون (الشكل 2 ، الشكل 3A ، ب) ، و 1400 ميكرون (الشكل 3C). يمكن أن ينتقل عن طريق حزم أصغر الإبر أضيق قياس وبشكل ملحوظ أكثر مرونة من أكبر الألياف. نحن وآخرون ⁸ ، في بعض الحالات ، لاحظت ظهور انبعاثات تألق ذاتي من ألياف الحزمة نفسها. عند محاولة لإثارة موجات الأشعة فوق البنفسجية في fluorophores ، أو جمع الانبعاثات في النطاق الطيفي حمراء ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى مستوى تألق ذاتي حزمة الألياف المساهمة في إشارة الشاملة قياسه.

في حين أن معظم أعمال microendoscopy عالية الدقة وذكرت إلى الآن لم تستخدم حزمة الألياف العارية ، يمكن تقديم التكبير إضافية عن طريق استخدام العدسات غرين المستعبدين إلى الطرف البعيد. العدسات غرين توفر وسيلة مباشرة واقتصادية لزيادة دقة المكاني ، على الرغم من الاعتراف أيضا تعرضها للالانحرافات البصرية وNA محدودة. يمكن إذا غرين الأداء عدسة غير كافية لتطبيق معين ، غرين الهجين / الأهداف عدسة كروية مصغرة ⁹ أو التجمعات عدسة يكون الهدف العاملين ^10-11.

وصف microendoscope عالية الدقة هنا أساسا تعمل بوصفها ومضان المجهر البرنامج الموسع للتمنيع واسعة المجال ، وبالتالي لا sectioning البصري (كما في المجهر مبائر أو غير الخطية) ليكون هو متوقع. في تجربتنا ، وذلك باستخدام 455 نانومتر ضوء الإثارة وبروفلافين موضعي كعامل النقيض من ذلك ، يتم جمعها في المقام الأول من الضوء على عمق المقابلة لطبقات الخلايا قليلة.

يجب على هذا البروتوكول لتمكين القارئ لتجميع microendoscope عالية الدقة على الفوق ، مع مساحة صغيرة من 10 "× 8". إذا رغبت في ذلك ، قد يتم تضمينه في النظام في خانة والمكونات الكهربائية (الصمام والكاميرا) مدعوم من البطارية (1D الشكل). يمكن أن تعمل بالطاقة العديد من الكاميرات المدمجة التي IEEE - 1394 (السلك الناري) ومنافذ USB لجهاز الكمبيوتر المضيف.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)