Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Özet

Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Özet

Birçok biyolojik ve klinik çalışmalar, hücresel seviyede çözünürlük ile morfoloji ve fonksiyon uzunlamasına bir çalışma ve analiz gerektirir. Geleneksel olarak, birden fazla deneyler, ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi için sıralı zaman noktalarında çalışma kaldırılır bireysel örnekleri ile paralel olarak işletiliyor. Konfokal, multiphoton ile birkaç intravital teknikleri geliştirdi ve ikinci harmonik mikroskopi yerinde ¹ görüntüleme için kullanılacak yeteneklerini gösteren edilmiştir. Ancak, bu sistemler, gerekli altyapı, lazer tarama sistemleri ve kompleks ışık kaynakları içeren karmaşık ve pahalı. Burada 5.000 ABD $ altında-raf kapalı bileşenleri kullanarak bir gün içinde inşa edilebilir, yüksek çözünürlüklü bir mikroendoskop tasarım ve montaj için bir protokol mevcut. Platformu görüntü çözünürlüğü açısından esneklik sunar, alan görüntüsü, ve işletim dalga boyu, ve biz bu parametreler son kullanıcının özel ihtiyaçlarını karşılamak için kolaylıkla değiştirilebilir nasıl açıklar.

Biz ve diğerleri eksize ⁶ ve yaşayan hayvan dokularının ^2,5, ve in vivo ^2,7 insan dokularında yüksek çözünürlüklü mikroendoskop (HRME), in vitro hücre kültürü ^2-5 incelemiş bulunuyoruz. Kullanıcılar proflavine ^2-4, benzoporphyrin türev monoacid halkası (BPD-MA) ^5, ve fluoroscein ^6,7, tam almış olan, ya da FDA investigational onayı da dahil olmak üzere birçok farklı floresan kontrast ajanların kullanımı, bildirdin İnsan denekler üzerinde kullanmak için. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi, burada açıklanan formu, temel ve klinik bilimleri alanında çalışan araştırmacıların geniş bir itiraz edebilir. Bu teknik, kullanıcıya yüksek çözünürlüklü, in situ uzunlamasına görüntüleme gerçekleştirmek için sağlayarak, geleneksel masa üstü mikroskopi tamamlar, etkin ve ekonomik bir yaklaşım sunuyor.

Protokol

1. Mikroendoskopa Meclisi

Burada açıklanan (şekil 1a) yüksek çözünürlüklü mikroendoskop montaj ve uygulama mümkün çeşitli varyasyonlar ile bir temel yapılandırma olarak kabul edilmelidir. Biz burada ayrıntılı platform floresan bir kontrast madde olarak proflavine ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmış bir somut bir şekilde açıklamaktadır. Proflavine parlak bir nükleer sırasıyla 445 nm ve 515 nm absorpsiyon ve emisyon dalga boylarında pik ile leke. Diğer kontrast ajanların kullanımı, kullanıcı uyarma, emisyon ve dikroik filtreleri uygun seçmek için gerekecektir. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskop çeşitli unsurları genel ve birden çok tedarikçiden temin edilebilir. Örneğin, optomechanical konumlandırma bileşenleri, diğerleri arasında Thorlabs, Newport, Linos mevcuttur. Kompakt CCD kameralar Point Gri Araştırma, Prosilica ve Retiga dahil şirketler mevcuttur; kamera hassasiyeti kullanılmak üzere fluorofor parlaklık yanı sıra istenilen kare hızı dikkate alınarak seçilmelidir. Yüksek güçlü ışık yayan diyot (LED), diğerlerinin yanı sıra Luxeon, Cree, Nichia elde edilebilir. Fiber-optik demetleri, Sumitomo, Fujikura ve Schott mevcuttur. Belirli bir uygulama için bileşenler seçerken, kullanıcı, aydınlatma yoğunluğu, kamera hassasiyeti, kazanç ve maruz kalma süresi photobleaching, floresan mikroskopi fluorofor konsantrasyonu arasında yer doğasında olan ilişkileri göz önünde bulundurmalıdır.

1. 7.5 bir çift oluşturmak için, kafes çubukları "1.5 kafes çubukları" 6 Bağlan "uzun çubuklar kat ayna ünitesi biri yüzüne bu çubuklar Vidalı 0.5 Vida" çubuklar ters yüzüne. Deliklerden düşük iki üzerinden, kafes kafes çubuklar üzerine küp kaydırın. Kafes küp (Şekil 1b) yan yüzüne 2 "çubuklar vidalayın.
2. C-mount SM1 adaptörü kullanarak bir kafes plaka kamera takın. 0.5 "kafes çubuklar kafes plaka Güvenli, yüz kat ayna ünitesi ile yıkayın.
3. 3 "uzun objektif tüp içine yerleştirin ve" boru "lens lens istinat halka ile güvenli. Öngörülen zaman lensin odak uzaklığı fiber-optik paket çekirdek, en az iki piksel numune böyle seçilmelidir kamera üzerine, filtre üreticisi tarafından belirtilen yan içine lens tüp Vida ilk istinat halka üstüne tüpe Bırak emisyon filtresi ve filtre güvence altına almak için başka bir halka eklemek filtre yönlendirme kuralını dikkate alınmalıdır. kafes küp CCD kamera yakın Şekil 1c, bu objektif ve filtre netlik için 3 "objektif tüpü olmadan gösterilmiştir.
4. Kamerayı bir bilgisayara bağlayın ve ekrandaki görüntüyü. Doğrudan uzak bir nesneye kafesinin montaj ve raylar boyunca kafes küp bir görüntü odak görünene kadar kaydırın. Bu yerde kafes küp kilitleyin. (Bu sonsuza düzeltilmiş objektif lens ile kombine edildiğinde tüp lens odaklanmış bir görüntü oluşturacaktır sağlanması basit bir yöntem).
5. Dikroik ayna kafes küp 45 ° 'de yer tutucu ve içine yerleştirin.
6. Tüp lens sahibinin karşısında kafes küp yüzüne, SM1 konu adaptörü RMS ve ayarlanabilir bir objektif tüpü ile, objektif lens vidalayın. A z-çevirmen, kolay odaklama için ayarlanabilir lens tüp yerine kullanılan olabilir. Bir kafes plaka içine bir SMA konnektör Vida ve yaklaşık objektif lens çalışma mesafesi, çubuklar bu monte.
7. Dağı bir 2 ucuna bir kafes plaka ve slayt LED "çubuklar bir lens, 0.5" bu tüp kafes küpün yan vidalanıyor olduğunda, LED bir görüntü oluşturacak şekilde lens tüp objektif lens arka diyafram doldurur. Bu (Kohler aydınlatma) yapılandırma fiber optik demet proksimal yüzü düzgün aydınlatılmış olmasını sağlayacaktır. 0.5 "objektif tüp eksitasyon filtresi ekleyin ve istinat halkası (Şekil 1c) ile güvenli.
8. SMA konnektör, fiber-optik paket takın. SMA Konnektörlü paket kafes çubuklar üzerine monte SMA yuvasına vidalayın. Doğrudan paket distal ucunu geniş bantlı bir ışık kaynağı (floresan aydınlatma yeterli olacaktır) doğru ve CCD kamera paket proksimal yüz görüntü gözlemleyebilirsiniz. Elyaf demeti görüntüsü odak görünene kadar kafes küp vidalama veya objektif lens pozisyonu ayarlayın. Bireysel çekirdek (Şekil 2) açıkça görülebilir olmalıdır.

2. GRIN Lens montaj

Mikroendoskop mekansal çözünürlükte bir mikro lens veya lens montaj elyaf demeti ucuna takarak artırılabilir. Bu optik ve böylece ışık-guid dayattığı uzamsal örnekleme frekansı artan doğrudan doku demeti ucu yerleştirme yerine, ucu demagnification ile doku yüzeyine imaged olduğu gibi yapılandırılmışelyaf demeti ing çekirdek. Demagnification derecesi orantılı bir alan görünümünde azalma mekansal çözünürlükte ve aynı zamanda artış, karşılık gelir. Gradient indeksi (GRIN) lens bileşenleri, fiber optik ile uyumlu ve diğerleri arasında GrinTech, NSG, Schott, mevcuttur, ve doğrudan bir elyaf demeti ucuna bağlanmış olabilir.

1. Uygulamanız için istenen büyütme ve çalışma mesafesi ile GRIN objektif seçin. Objektif çapı ile çalışmayı planlıyoruz elyaf demeti daha fazla olduğundan emin olun. Biz elyaf demeti ve GRIN objektif bağı önce doğru uyum için düşük güçlü bir mikroskop veya Stereoskop altında, 3-eksen ayrı manuel konumlandırma aşamaları üzerine monte edilmesi önerilir.
2. Lens veya paket yüz ya da bir damla optik yapıştırıcı (örn. Norland UV yapıştırıcı) yerleştirin. Manuel pozisyoner ile temas iki bileşenden getirin. Üretici tarafından önerilen doz UV ışık arabirimi göstermelidir.
3. GRIN lens ve gümrüklü arayüzü, alüminyum kapiller tüp (Küçük Parça A.Ş.) kısa bir uzunluğu korumak için eklem içine kullanılabilir. Epoksi ile ortak ve güvenli üzerinden boru kaydırın. Isı shrink boru montaj bitirmek için kullanılabilir.

3. Mikroendoskopa Görüntüleme

1. Yansıması veya doku hücreleri kontrast madde uygulayın. Proflavine (0.01 PBS içinde% w / v) ile in vitro kültür hücreleri görüntülemede kısa inkübasyon (<1 dakika) ve kapsamlı durulama yapılabilir. Görüntüleme, ex vivo doku örneklerinin ya da in vivo dokularda boya mümkün aşağıdaki topikal uygulama. Proflavine alımını bu koşullar altında, bir kaç saniye ve birkaç dakika süren içinde mümkün görüntüleme, yakın anlık olarak tespit edilmiştir.
2. Fiber optik demet ışık yansıması için örnek ile temas halinde yerleştirin. Kültür veya ex vivo doku örnekleri görüntüleme hücreleri, görüntüleme sırasında istikrar için XYZ eksenleri manuel konumlandırma aşamaları ile güvenli bir fikstür elyaf demeti distal ucu montaj önerilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Doğru monte edildiğinde mikroendoskop, epi-floresan mikroskop, tutarlı bir fiber-optik paket üzerinden geçirilmesine olarak çalışacak. , En iyi görüntüleme sonuçları için üç temel koşulların yerine getirilmesini sağlamak için, dikkat dikkat edilmelidir:

1. Sistemin tam çözünürlükte elde etmek için, lif demeti proksimal yüz bulanıklaştırma olmadan CCD kamera üzerine imaged olmalıdır. Şekil 2a, b, c, sırasıyla, yoksul odaklı görüntülü bir elyaf demeti kısmı, hafif bulanıklaştırma, ve iyi bir odak göstermektedir. Paket yüze göre objektif lens eksenel pozisyonunu ayarlayarak optimum odak bulundu.
2. Elyaf demeti proksimal yüzü düzgün tam çapı (alan görüş) üzerinden aydınlatılmış olmalıdır. Protokol Metin (1.7) de açıklandığı üzere, bu Kohler aydınlatma aydınlatma optik yapılandırarak elde edilir. Şekil 2d düzgün bir floresan örnek kritik aydınlatma altında ilgili sonuç gösteren Şekil 2e, bu tercih yapılandırmasında aydınlatılmış kazanılmış bir görüntü gösterir. İkinci durumda, LED yapısı, gerçek bir örnek yapısı üzerine bindirilmiş bu istenmeyen desen görünüm elyaf demeti yüzüne görüntülü.
3. Elyaf demeti proksimal ve distal yüzleri Her iki temiz ve çizik ve cips ücretsiz olmalıdır. Şekil 2f fiber çevre 05:00 küçük bir çip şeklinde hasar, paket yüz bağlı enkaz varlığını göstermektedir. Enkaz lens kağıt ve izopropanol, ya da standart fiber-optik temizleme araçları, geleneksel fiber optik konektörler gibi aynı şekilde temizlik yüzleri paket kaldırılabilir. Elyaf demeti her iki ucunda çizik veya yontulmuş, ya da paket uzunluğu boyunca bozulursa, yüz standart manuel veya mekanik parlatma teknikleri ile düz cilalı olabilir ise. 0.5-1.0 mikron kağıt üzerinde son bir cila ile, ilk bir kaba lehçe için kağıt alıştırma 12-15 mikron önerilir.

Şekil 3a, etiketleme aşağıdaki örnek üzerinde çıplak elyaf demeti proflavine ve ışık yerleştirme, 1483 hücreleri in vitro görüntüleme göstermektedir . Şekil 3b mekansal çözünürlükte ve paket ucuna bağlanmış bir 2.5x GRIN lens tarafından sağlanan alan görüş azalma iyileşme göstermektedir. Film 1 meme yağ yastığı bir fare modelinde in vivo görüntüleme göstermektedir. Burada, 21-gauge iğne ile 0.5 mm dış çapı (330 mikron alan-view) ile bir elyaf demeti geçti ve doku içine gelişmiş. Yağ hücreleri, 15 yaşında bu satın alma belirgin kalp döngüsü nedeniyle hareket ile, açıkça görülebilir.saniye başına kare. Şekil 3c, sağlıklı bir insan gönüllü olarak oral mukoza görüntüleme, 1.5 mm dış çapı (1.4 mm alan görüş) kullanarak bu kez daha büyük bir elyaf demeti göstermektedir. Gösterilen tüm örnekler, proflavine nükleer bir etiketleme floresan kontrast madde olarak kullanılmıştır.

Şekil 1 yüksek çözünürlüklü mikroendoskop (HRME) birleştirmek. (A) HRME sisteminin şematik diyagramı. (B) Meclis ana optomechanical destek yapısı. (C) optik elemanlar eklenmesi, LED aydınlatma ve CCD kamera. 10 "x 8" x 2.5 "muhafaza paketlenmiş HRME sistemi (d) Fotoğraf,.

Şekil 2 HRME ayarlama. (A) yoksul odak fiber-optik paket ile görüntüleme örnekleri, (b) iyi bir odak yakın, (c) ideal bir odak. (D), paket distal ucunda tek tip bir floresan hedef Kohler (uniform) aydınlatma altında görüntülenmiş. (E) tek tip bir floresan hedef nesne üzerinde belirgin kaynak yapısı ile, kritik bir aydınlatma altında görüntülenmiş. (F) gevşek doku ve hücrelerin, aynı zamanda kendi çevresindeki ufak çaplı hasara yatkın elyaf demeti yüz, sopa olabilir.

Şekil 3 HRME ile Görüntüleme. (A) 1483 hücreleri, in vitro proflavine% 0,01 (w / v) ile etiketleme aşağıdaki çıplak fiber paket (IGN-08/30) ile görüntülenmiş. (B) 'de gösterildiği gibi aynı 1483 hücre kültürü (a), 2.5x GRIN lens takılı bir lif demeti ile görüntülenmiş. Proflavine% 0.01 'lik topikal uygulaması (w / v) aşağıdaki (c), in vivo olarak normal insan oral mukoza Görüntü, .

Film 1 Görüntüleme meme dokusu içine geçirilen bir 21-gauge iğne lümeni içinde 450 mikron dış çapı elyaf demeti ekleme ile bir fare yağ yastığı. Proflavine% 0,01 (w / v) görüntüleme fiber yerleştirilmesinden önce, aynı iğne ile görüntüleme siteye teslim edildi . videosunu izlemek için tıklayın

Tartışmalar

Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi tekniği, in situ hücresel detay görselleştirmek için, esnek, sağlam ve maliyet-etkin yöntemi ile temel biyomedikal ve klinik araştırma alanlarında araştırmacılar sağlar nitelendirdi. Görüntüleme sistemi montaj için bir protokol açıklanan ve in vitro hücre kültürü kullanımını gösterdi, ve in vivo hayvan ve insan dokuları var. Burada sunulan görüntüleme sonuçları floresan bir kontrast madde olarak kullanılan proflavine ederken, diğer gruplar, LED aydınlatma dalga boylarında ve filtreler ^ile 5-7 diğer boyaların uyarma / emisyon spektrumları maç için seçilen sistemi sürümleri göstermiştir .

Çözünürlük ve görüş alanında başlangıçta çekirdek-çekirdek aralığı ve fiber-optik paket görüntüleme çapı belirlenir. Biz yaklaşık 4 mikron çekirdek çekirdek aralığı ve 330 mikron (1 film), 720 mm (Şekil 2, Şekil 3a, b), 1400 mm (Şekil 3c) görüntüleme çapı demetleri kullanılır. Küçük demetleri dar göstergesi iğne geçirilir ve büyük liflerin önemli ölçüde daha esnek olabilir. Biz ve diğerleri ^8, bazı durumlarda, fiber otofloresans emisyonlarının görünümünü kendisi paket kaydetti. UV dalga boylarında fluorophores heyecanlandırmak, ya da kırmızı spektral aralıkta emisyon toplamak için çalışırken, dikkat elyaf demeti otofloresans genel ölçülen sinyal katkıda düzeyine dikkat edilmelidir.

Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi işin en güncel çıplak bir elyaf demeti kullanılır bildirilmiş olmasına rağmen, ek büyütme distal ucuna bağlanmış GRIN lenslerin kullanımı ile sağlanabilir. GRIN lensler, optik sapmaları ve sınırlı NA duyarlılık iyi tanınan olmasına rağmen, mekansal çözünürlüğü artırmak için basit ve ekonomik şekilde sunuyoruz. GRIN objektif performansı belirli bir uygulama, hibrid GRIN / küresel lens hedefleri ⁹ veya minyatür objektif lens meclisleri için yetersiz ise ^10-11 istihdam edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü mikroendoskop geniş bir alan epi-floresan mikroskop gibi çalışır aslında burada açıklandığı, bu nedenle herhangi bir optik kesit (konfokal veya doğrusal olmayan mikroskopi) beklenebilir. Bizim tecrübelerimize göre 455 nm uyarma ışık ve kontrast madde olarak topikal proflavine kullanarak, ışık, öncelikle bir kaç hücre tabakaları ile ilgili bir derinlik toplanır.

Bu protokol, 10 kompakt bir ayak izi okuyucu ile, masa üstü "x 8" yüksek çözünürlüklü mikroendoskop monte sağlamak için gereken. Eğer istenirse, sistem bir kutu içinde kapalı ve elektrik bileşenleri (LED ve kamera) bir pil (Şekil 1d) tarafından desteklenmektedir. Birçok kompakt fotoğraf makineleri, IEEE-1394 (Firewire) ve ana bilgisayar USB portu tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)