Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Résumé

Dans de nombreuses situations cliniques et biologiques, il est avantageux d'étudier les processus cellulaires à mesure qu'ils évoluent dans leur microenvironnement natale. Nous décrivons ici le montage et l'utilisation d'un faible coût par fibre optique de microscope qui peut fournir l'imagerie en temps réel dans la culture cellulaire, les études animales et des études cliniques sur le patient.

Résumé

De nombreuses études biologiques et cliniques nécessitent l'étude longitudinale et l'analyse de la morphologie et la fonction avec une résolution au niveau cellulaire. Traditionnellement, les multiples expériences fonctionnent en parallèle, avec des échantillons individuels retirés de l'étude à des temps séquentiels pour l'évaluation par microscopie optique. Plusieurs techniques ont été développées intravitale, avec confocale, multiphotonique, microscopie et deuxième harmoniques toutes démontrant leur capacité à être utilisé pour l'imagerie dans ^une situ. Avec ces systèmes, cependant, l'infrastructure nécessaire est complexe et coûteuse, impliquant des systèmes de balayage laser et les sources de lumière complexes. Nous présentons ici un protocole pour la conception et l'assemblage d'un microendoscope haute résolution qui peut être construite en un jour à l'aide off-the-shelf composants pour moins de 5000 $ US. La plateforme offre une grande flexibilité en termes de résolution d'image, le champ de vision, et l'exploitation d'onde, et nous décrivons comment ces paramètres peuvent être facilement modifiés pour répondre aux besoins spécifiques de l'utilisateur final.

Nous et les autres ont exploré l'utilisation de l'microendoscope haute résolution (HRME) en culture cellulaire in vitro ^2-5, en ⁶ excisée et les tissus des animaux qui vivent ^2,5, et dans les tissus humains in vivo ^2,7. Les utilisateurs ont rapporté l'utilisation de plusieurs agents de contraste fluorescents, y compris proflavine ^2-4, anneau de monoacide benzoporphyrine dérivés A ⁵ (BPD-MA), et ^6,7 fluorescéine, qui ont tous reçu plein, ou l'approbation d'investigation de la FDA pour une utilisation chez des sujets humains. Haute résolution microendoscopy, sous la forme décrite ici, peut faire appel à un large éventail de chercheurs travaillant dans le domaine des sciences fondamentales et cliniques. Cette technique offre une approche efficace et économique qui complète la microscopie traditionnelle paillasse, en permettant à l'utilisateur d'effectuer à haute résolution, imagerie longitudinales in situ.

Protocole

1. Assemblée Microendoscope

Le microendoscope haute résolution décrit ici (figure 1a) devrait être considéré comme une configuration de base avec plusieurs variations possibles dans l'assemblage et l'application. Nous décrivons en détail ici une réalisation de la plate-forme qui est conçu pour être utilisé avec proflavine comme agent de contraste fluorescents. Proflavine est une brillante tache avec nucléaires pic d'absorption et d'émission de longueurs d'onde de 445 nm et 515 nm, respectivement. L'utilisation d'agents de contraste d'autres auront besoin de l'utilisateur de sélectionner l'excitation, d'émission, et des filtres dichroïques de manière appropriée. Plusieurs éléments de l'microendoscope haute résolution sont génériques et peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs. Par exemple, les composants opto-mécaniques de positionnement sont disponibles à partir Thorlabs, Newport, Linos, entre autres. Compact caméras CCD sont disponibles auprès de sociétés telles que Point Grey Research, Prosilica, et Retiga; sensibilité de la caméra doit être choisi en tenant compte de la luminosité du fluorophore à être utilisé, ainsi que la cadence désirée. Haute puissance des diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être obtenus à partir de Luxeon, des Cris et Nichia, entre autres. Fibre optique faisceaux sont disponibles auprès de Sumitomo, Fujikura, et Schott. Dans la sélection des composants pour une application spécifique, l'utilisateur devrait considérer les relations inhérentes à la microscopie par fluorescence entre la concentration de fluorophore, photoblanchiment, intensité de l'illumination, sensibilité de la caméra, le gain et le temps d'exposition.

1. Branchez le 6 "tiges cage pour les 1,5" tiges cage, pour former une paire de 7.5 "de longues tiges. Vissez ces tiges dans une face de l'unité de miroir pli. Visser le 0,5" tiges dans la face opposée. Faites glisser le cube cage sur les tiges de la cage, en passant par les deux inférieurs à travers les trous. Vissez les deux "tiges dans la face latérale du cube cage (figure 1b).
2. Fixez la caméra sur une plaque de la cage en utilisant une monture C à l'adaptateur SM1. Fixez la plaque sur la cage de 0,5 tiges cage », affleure la face de l'unité de miroir pli.
3. Insérez le «tube» dans une lentille de 3 "lentille de tube long et sécuriser l'objectif avec une bague de retenue. La longueur focale de l'objectif doit être choisie de telle sorte que les noyaux du faisceau de fibres optiques sont échantillonnés par au moins deux pixels lors de la projection sur la caméra. Déposer le filtre d'émission dans le tube au-dessus du premier anneau de retenue et ajouter une autre bague pour fixer le filtre en place. Respectez la convention d'orientation du filtre indiqué par le fabricant du filtre. Vissez la lentille de tube sur le côté de la cube de la cage la plus proche de la caméra CCD. Notez que dans la figure 1c, cette lentille et le filtre sont présentés sans le tube 3 lentilles "pour plus de clarté.
4. Connectez l'appareil à un ordinateur et afficher l'image sur l'écran. Diriger l'ensemble cage à un objet lointain et faites glisser le cube en cage le long des rails jusqu'à une image apparaît au point. Verrouiller le cube en cage à cet endroit. (Ceci est une méthode simple de s'assurer que la lentille de tube forment une image focalisée lorsqu'il est combiné avec l'infini-corrigés objectif).
5. Insérez le miroir dichroïque dans le support et le lieu à 45 ° dans le cube en cage.
6. Vissez la lentille de l'objectif, via une RMS pour SM1 adaptateur de filetage et d'un tube lentille réglable, à la face du cube en cage en face de la porte-lentille de tube. Un z-traducteur peut être utilisé à la place du tube de lentille réglable pour faciliter la mise au point. Vis un connecteur SMA dans une plaque de cage et de monter ce sur les tiges, approximativement à la distance de travail de l'objectif.
7. Monter une LED sur une plaque en cage et glisser sur la fin de la 2 "barres. Ajouter une lentille à un 0,5" tube d'objectif tel que, lorsque ce tube est vissé dans le côté du cube en cage, il va former une image de la LED qui remplit l'ouverture arrière de l'objectif. Cette configuration (éclairage de Köhler) fera en sorte que la face proximale du faisceau de fibres optiques est uniformément éclairé. Ajouter le filtre d'excitation dans le tube 0,5 lentilles "et fixer en place avec un anneau de retenue (figure 1c).
8. Attachez un connecteur SMA à un faisceau de fibres optiques. Vissez le bundle SMA connectorisés dans le réceptacle de SMA montés sur les tiges de la cage. Direct de l'extrémité distale du faisceau vers une source lumineuse à large bande (éclairage fluorescent suffira) et d'observer l'image du visage bundle proximale sur la caméra CCD. Ajustez la position de la lentille de l'objectif en vissant ou en dehors du cube cage jusqu'à ce que l'image apparaît dans faisceau de fibres de discussion. Les noyaux individuels devraient être clairement visibles (figure 2).

2. Assemblée Objectif GRIN

La résolution spatiale de l'microendoscope peut être augmentée en ajoutant un micro-lentille ou d'assemblage de lentilles à l'extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurés de telle sorte que, au lieu de placer la pointe bundle directement sur le tissu, la pointe est reflétée sur la surface du tissu avec démagnification, augmentant ainsi la fréquence d'échantillonnage spatiales imposées par le GUID lumièreING noyaux du faisceau de fibres. Le degré de démagnification correspond à l'augmentation de la résolution spatiale, et dans le même temps, à une diminution proportionnelle dans le champ de vision. Composants lentilles à gradient d'indice (GRIN) sont compatibles avec la fibre optique et sont disponibles à partir GrinTech, NSG, Schott, entre autres, et peut être directement lié à l'extrémité distale d'un faisceau de fibres.

1. Sélectionnez une lentille GRIN avec le grossissement désiré et la distance de travail pour votre application. S'assurer que le diamètre de la lentille est supérieure à celle du faisceau de fibres que vous prévoyez de travailler avec. Nous recommandons que le faisceau de fibres et de lentilles GRIN être monté sur 3 axes séparés platines de positionnement manuel sous un microscope de faible puissance ou stéréoscope pour un alignement précis avant le collage.
2. Déposer une goutte de colle optique (par exemple, Norland adhésifs UV) sur la lentille ou le visage bundle. Apportez les deux composantes en contact en utilisant les positionneurs manuel. Exposer l'interface à la lumière UV pour la dose recommandée par le fabricant.
3. Pour protéger la lentille GRIN et l'interface collés, une courte longueur de tube d'aluminium capillaire (petites pièces Inc) peut être utilisé pour enfermer l'articulation. Faites glisser le tube sur le joint et fixer en place à l'époxy. Gaine thermorétractable peut être utilisée pour terminer l'assemblage.

3. Imagerie Microendoscope

1. Appliquer l'agent de contraste pour les cellules ou les tissus à imager. Avec proflavine (0,01% p / v dans du PBS), dans l'imagerie in vitro des cellules en culture peut être effectuée par une brève incubation (<1 minute) et un rinçage complet. Imagerie des spécimens de tissus ex vivo ou in vivo dans les tissus est possible après l'application topique de la teinture. L'absorption de proflavine dans ces conditions, a été trouvé pour être quasi instantanée, avec l'imagerie possible en quelques secondes et durable pendant plusieurs minutes.
2. Placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l'échantillon à imager. Lorsque les cellules d'imagerie dans la culture ou ex vivo des échantillons de tissus, nous recommandons le montage de l'extrémité distale du faisceau de fibres dans un dispositif de sécurité avec des étapes de positionnement manuel sur les axes XYZ pour la stabilité pendant l'imagerie.

4. Les résultats représentatifs:

Une fois assemblé correctement, le microendoscope fonctionnera comme un microscope à épifluorescence, relayée par une stratégie cohérente de fibre optique bundle. Pour des résultats optimaux d'imagerie, l'attention devrait être accordée pour s'assurer que trois conditions principales sont remplies:

1. La face proximale du faisceau de fibres devrait être imagés sur la caméra CCD sans défocalisation, afin de parvenir à la résolution complète du système. Figure 2a, b, c montrent une partie d'un faisceau de fibres imagé avec un accent pauvres, défocalisation légère, et se concentrer bonne, respectivement. L'accent est optimale en ajustant la position axiale de la lentille de l'objectif relativement à la face bundle.
2. La face proximale du faisceau de fibres doivent être uniformément éclairée sur son plein diamètre (champ de vision). Comme décrit dans le texte du Protocole (1,7), ceci est réalisé en configurant l'optique d'illumination pour l'éclairage de Kohler. Figure 2D montre une image acquise lors d'un échantillon homogène fluorescente est illuminé dans cette configuration préférée, avec la figure 2e démontrant le résultat correspondant sous un éclairage critique. Dans ce dernier cas, la structure de la LED est reflétée sur le visage faisceau de fibres, résultant en l'apparition de ce modèle indésirables superposée à la structure de l'échantillon vrai.
3. Les deux visages proximales et distales du faisceau de fibres doit être propre et exempt de rayures et de copeaux. Figure 2f démontre la présence de débris attachée à la face bundle, avec des dégâts sous la forme d'une petite puce à 5 heures sur le périmètre de la fibre. Les débris peuvent être retirés de la liasse des visages par le nettoyage de la même façon que conventionnelles connecteurs à fibres optiques, avec du papier d'objectif et l'isopropanol, ou des outils standard de nettoyage de fibre optique. Si l'une des extrémités du faisceau de fibres est rayé ou ébréchées, ou si le faisceau des pauses le long de sa longueur, le visage peut être poli à plat par manuel standard, ou des techniques de polissage mécanique. Nous vous recommandons de 12-15 um clapotis de papier pour un poli initial grossier, avec un vernis final sur du papier de 0.5 à 1.0 um.

La figure 3a montre l'imagerie de 1483 cellules in vitro, après marquage avec le placement proflavine et la lumière du faisceau de fibres nues sur l'échantillon. Figure 3b montre l'amélioration de la résolution spatiale et la réduction du champ de vision fourni par une lentille GRIN 2.5x collée à l'extrémité bundle. Film 1 montre l'imagerie in vivo de la plaquette mammaires de graisse dans un modèle murin. Ici, un faisceau de fibres avec 0,5 mm de diamètre extérieur (330 um champ de vue) a été passé à travers une aiguille de calibre 21 et avancé dans le tissu. Les cellules adipeuses sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque apparente dans cette acquisition à 15images par seconde. La figure 3c montre l'imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain sain, en utilisant cette fois un ensemble plus large en fibre avec 1,5 mm de diamètre extérieur (1,4 mm champ de vue). Dans tous les exemples présentés, proflavine a été utilisé comme un agent de contraste marquage nucléaire fluorescent.

Figure 1. Assemblage du microendoscope haute résolution (HRME). Schéma (a) du système HRME. (B) de l'Assemblée de la structure de soutien optomécanique principal. (C) l'ajout d'éléments optiques, éclairage LED, et une caméra CCD. (D) photographie du système HRME, emballé dans un 10 "x 8" x 2,5 "enclos.

Figure 2. Configuration du HRME. Des exemples de l'imagerie avec le faisceau de fibres optiques en (a) se concentrent pauvres, (b) à proximité de concentrer une bonne, (c) focalisation idéale. En (d), une cible homogène fluorescente à l'extrémité distale du bundle est imagé dans Kohler (uniforme) d'illumination. (E) un objectif uniforme fluorescente sous un éclairage critique imagée, avec la structure apparente de la source sur l'objet. (F) les tissus en vrac et les cellules peuvent se coller au visage faisceau de fibres, qui est également sujette à des dommages mineurs à sa périphérie.

Figure 3. Imagerie avec le HRME. (A) 1483 cellules in vitro, imagé avec un faisceau de fibres nues (IGN-08/30) suivant le marquage avec proflavine 0,01% (p / v). (B) Le même 1483 la culture de cellules, comme indiqué en (a), imagé avec un faisceau de fibres avec une lentille GRIN 2.5x ci-joint. (C) Image de la muqueuse buccale normale humains in vivo, après l'application topique de proflavine 0,01% (p / v).

Film 1. Imagerie mammaire de la plaquette en graisse d'un souris via l'insertion d'un diamètre de 450 um faisceau de fibres extérieures dans la lumière d'une aiguille de calibre 21 passés dans le tissu. Proflavine 0,01% (p / v) a été livré sur le site d'imagerie par la même aiguille avant l'insertion de la fibre d'imagerie. Cliquez ici pour visionner la vidéo

Discussion

La technique de haute résolution microendoscopy décrit fournit ici des chercheurs dans les domaines de la recherche biomédicale fondamentale et clinique avec une méthode flexible, robuste et rentable pour la visualisation de détails cellulaires in situ. Nous avons décrit un protocole pour l'assemblage du système d'imagerie et démontré son utilisation en culture cellulaire in vitro et chez l'animal, et les tissus humains in vivo. Bien que les résultats présentés ici imagerie utilisée proflavine comme agent de contraste fluorescents, d'autres groupes ont démontré les versions du système d'éclairage à LED longueurs d'onde et les filtres choisis pour correspondre à excitation / émission des spectres d'autres colorants ^5-7.

Résolution et champ de vue sont déterminés initialement par l'espacement des core-to-core et le diamètre de l'imagerie du faisceau de fibres optiques. Nous avons utilisé faisceaux avec environ 4 um core-core espacement, et des diamètres de 330 um d'imagerie (film 1), 720 um (figure 2, figure 3a, b), et 1400 um (figure 3C). Les faisceaux plus petits peut être transmis par des aiguilles de calibre étroit et sont nettement plus souples que les fibres plus grandes. Nous et les autres ⁸ ont, dans certains cas, a noté l'apparition d'émissions de l'autofluorescence de la fibre elle-même bundle. Lors d'une tentative pour exciter des fluorophores aux longueurs d'ondes UV, ou de collecter des émissions dans la gamme spectrale rouge, une attention devrait être portée au niveau de l'autofluorescence fibré contribuant à l'ensemble du signal mesuré.

Alors que la plupart des travaux à haute résolution microendoscopy rapporté à ce jour a utilisé un faisceau de fibres nues, un grossissement supplémentaire peut être fournie par l'utilisation de lentilles GRIN collée à l'extrémité distale. Lentilles GRIN offre un moyen simple et économique pour augmenter la résolution spatiale, bien que leur sensibilité aux aberrations optiques et limité NA est bien reconnu. Si les performances lentilles GRIN est insuffisante pour une application particulière, GRIN hybride / objectifs lentille sphérique ⁹ ou miniatures assemblées objectif ^10-11 peuvent être employées.

Le microendoscope haute résolution décrit ici essentiellement fonctionne comme un grand champ épifluorescence microscope; donc pas de sectionnement optique (comme en microscopie confocale ou non linéaire) est à prévoir. Dans notre expérience, en utilisant la lumière d'excitation 455 nm et proflavine actualité comme agent de contraste, la lumière est principalement recueillies à une profondeur correspondant à une des couches de cellules rares.

Ce protocole devrait permettre au lecteur de rassembler les microendoscope haute résolution sur la paillasse, avec un encombrement réduit de 10 "x 8". Si désiré, le système peut être enfermé dans une boîte et les composants électriques (LED et d'une caméra) alimenté par une batterie (figure 1d). Beaucoup de caméras compactes peuvent être alimentés par l'IEEE-1394 (Firewire) et des ports USB de l'ordinateur hôte.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)