고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

요약

그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

초록

많은 생물 학적 및 임상 연구는 세포 수준의 해상도와 형태와 기능의 종단 연구와 분석을 필요로합니다. 전통적으로 여러 실험은 빛의 현미경에 의해 평가를위한 연속적인 시간 지점에서 연구에서 제거 각각의 샘플과 함께 병렬로 실행됩니다. 여러 intravital 기술은 공촛점, multiphoton와 함께 개발하고, 둘째 고조파 현미경은 모든 현장 ¹ 영상에 사용될 자신의 능력을 입증했습니다. 이러한 시스템으로, 그러나 필요한 인프라는 스캐닝 레이저 시스템 및 복잡한 광원을 포함한, 복잡하고 비싼 것입니다. 여기 우리는 5000 미국 $ 이하 부품 - 더 - 선반이 꺼져 사용하여 하루에 만들 수 있습니다 고해상도 microendoscope의 설계 및 조립을위한 프로토콜을 제시한다. 플랫폼은 이미지 해상도 측면에서 유연성을 제공 뷰 필드 및 운영 파장, 우리는 이러한 매개 변수가 쉽게 최종 사용자의 특정 요구를 충족하기 위해 수정할 수있는 방법을 설명합니다.

우리와 다른 excised ⁶ 살아있는 동물의 조직 ^2,5, 그리고 생체내 ^2,7 인간의 조직에서 체외 세포 배양 ^{2-5에서에서} 고해상도 microendoscope (HRME)의 사용을 살펴 보았다. 사용자 proflavine ^2-4, benzoporphyrin - 유도체 monoacid 반지 (럴 - MA) ^5, fluoroscein ^6,7, 전체를받은 모든 중, 또는 FDA의 investigational 승인 등 여러 가지 형광 대비 요원의 사용을보고 인간의 과목에서 사용하십시오. 고해상도 microendoscopy는 형태로 여기서 설명에 기본 및 임상 과학에서 근무하는 연구자의 다양한 관심을 끌 수 있습니다. 기술은 사용자가 고해상도, 원위치에 세로 이미징을 수행함으로써, 기존의 benchtop 현미경을 보완 효과적이고 경제적인 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

1. Microendoscope 어셈블리

(그림 1A) 여기에 설명된 고해상도 microendoscope은 어셈블리 및 응용 프로그램의 가능한 여러 형태를 기본 구성으로 간주되어야합니다. 우리는 여기서 자세히 형광등 대비 에이전트로 proflavine와 함께 사용하도록 설계되었습니다 플랫폼의 구현에 대해 설명합니다. Proflavine는 각각 445 nm의와 515 nm의 흡수 피크의 및 방출 파장과 얼룩 밝은 핵입니다. 다른 대비 요원의 사용은 사용자가 적절하게 여기, 배출하고, 이색성 필터를 선택할 수 있어야합니다. 고해상도 microendoscope 몇 가지 요소는 일반적이며, 여러 공급 업체에서 구할 수 있습니다. 예를 들어, optomechanical 위치 구성 요소는 다른 사람들과 Thorlabs, 뉴 포트, Linos에서 사용할 수 있습니다. 소형 CCD 카메라는 포인트 그레이 리서치, Prosilica 및 Retiga를 포함하여 기업에서 사용할 수있는, 카메라 감도는 사용할 형광단의 밝기뿐만 아니라 원하는 프레임 속도의 고려와 함께 선택한다. 하이 파워 발광 다이오드 (LED가) 다른 사람 사이에 Luxeon, 크리어하고, Nichia에서 구할 수 있습니다. 광섬유 번들 스미토모, 후지 쿠라, 그리고 쇼트에서 사용할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 대한 구성 요소를 선택하는 사용자는, 조도, 카메라 감도, 이득 및 노출 시간을 photobleaching, 형광단 농도 사이의 형광 현미경에 관련된 고유한 관계를 고려해야한다.

1. 7.5의 한 쌍의 형태로, 케이지 막대 "1.5 케이지 막대"6 연결 "긴 막대합니다. 접어 미러 장치 중 하나가 얼굴에 다음 봉을 보자. 0.5 나사"반대로 얼굴로 막대합니다. 구멍을 통해 낮은 두 통해 케이지 막대에 케이지 큐브 슬라이드. 케이지 큐브 (그림 1B)의 측면 얼굴에 2 "봉을 나사.
2. SM1 어댑터 C - 마운트를 사용하여 케이지 접시에 카메라를 연결합니다. 0.5 "케이지 막대에있는 새장 판을 확보, 접이식 미러 유닛의 얼굴을 잔뜩.
3. 3 "긴 렌즈 튜브로"튜브 "렌즈를 삽입하고 유지 반지와 렌즈를 안전하게. 투영 때 렌즈의 초점 거리는 광섬유 번들의 코어가 적어도 두 개의 픽셀 샘플되는 등 선택해야합니다 카메라에. 필터 제조 업체로 표시. 측면에 렌즈 튜브를 스크류 첫 유지 반지의 상단에있는 튜브에 방출 필터를 드롭하고, 장소에 필터를 보호하는 또 다른 반지를 추가합니다. 필터 방향 대회를 관찰 케이지 큐브 CCD 카메라에 가까운. 그림 1C,이 렌즈와 필터의 지혜로움에 대해 3 "렌즈 튜브없이 표시됩니다.
4. 컴퓨터에 카메라를 연결하고 화면에 이미지를 볼 수 있습니다. 먼 물체에서 케이지 어셈블리를 직접하고 이미지가 초점이 나타날 때까지 레일 따라 케이지 큐브를 슬라이드. 이 위치에있는 케이지 큐브를 닫으세요. (이것은 무한 - 정정 목적 렌즈와 결합되면 튜브 렌즈가 초점을 맞춘 이미지를 형성 있도록 한 간단한 방법입니다.)
5. 케이지 큐브에서 45 °에있는 홀더와 장소에 이색성 거울을 넣습니다.
6. 튜브 렌즈 홀더 반대 케이지 큐브의 얼​​굴에, SM1 스레드 어댑터에 RMS 및 조정 렌즈 튜브를 통해 객관적인 렌즈를 나사. Z - 번역자가 쉽게 초점을위한 조정 렌즈 튜브 대신에 사용할 수 있습니다. 케이지 접시에 SMA 커넥터 나사 약 목적 렌즈의 작동 거리에서 막대에 이것을 탑재합니다.
7. 마운트 2의 끝 부분에 케이지 플레이트와 슬라이드에 LED '봉. 0.5 렌즈 추가 "이 튜브는 케이지 큐브의 측면에 실수를하면 그것이 LED의 이미지를 형성 이러한 렌즈 튜브 그 목적 렌즈의 조리개를 다시 채웁니다. 이 (콜러 조명) 구성은 광섬유 번들의 근위 얼굴이 균일하게 조명 있는지 확인합니다. 0.5 "렌즈 관으로 여기 필터를 추가하고 유지 반지 (그림 1C)와 장소에서 보안.
8. 광섬유 번들에 SMA 커넥터를 연결합니다. 케이지 막대에 장착된 SMA의 콘센트에 SMA connectorized 번들 보자. 광대역 광원 (형광등 조명이 충분)으로 번들의 말초 끝을 직접 CCD 카메라에 번들 근위 얼굴의 이미지를 관찰합니다. 섬유 번들 이미지가 초점이 나타날 때까지 케이지 큐브의에서 떨어지거나 밖으로 목적 렌즈의 위치를​​ 조정합니다. 개별 코어 (그림 2) 명확하게 표시해야합니다.

2. 미소 렌즈 조립

microendoscope의 공간적 해상도는 섬유 번들의 말초 팁로 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 부착 증가 수 있습니다. 이러한 광학되므로 빛을 - GUID에 의해 부과된 공간적 샘플링 주파수를 증가하는 대신 직접 조직에 번들 팁을 배치의 팁이 demagnification로 조직 표면에 몇 군데는 그러한 구성섬유 번들의 주입 코어. demagnification의 정도 뷰 필드에 비례 감소에 공간적 해상도에서 동시에 증가에 해당합니다. 그라데이션 지수 (미소) 렌즈 구성 요소는 섬유 - 광학과 호환되며 다른 사람들과 GrinTech, NSG, 쇼트에서 사용할 수 있으며, 직접 섬유 번들의 말초 팁에 접착 수 있습니다.

1. 응용 프로그램의 원하는 배율과 작동 거리와 함께 미소 렌즈를 선택합니다. 렌즈의 직경은 당신이 작업 계획 광섬유 번들의를 초과되었는지 확인합니다. 우리는 섬유 번들과 미소 렌즈가 결합 이전에 정확하게 정렬을위한 저전력 현미경이나 입체경에 따라 별도의 3 축 수동 위치 단계에 장착하는 것이 좋습니다.
2. 렌즈 또는 번들 얼굴 하나에 광학 접착제 (예 : 노르 랜드 자외선 경화 접착제)의 한 방울을 넣으십시오. 매뉴얼 positioners를 사용하여 연락처에 두 구성 요소를 가져와. 제조 업체에서 권장 복용량을 위해 자외선에 인터페이스를 노출.
3. 미소 렌즈와 보세 인터페이스, 알루미늄 모세관 튜브 (소형 부품 주식 회사)의 짧은 길이를 보호하기 위해 공동을 묶으하는 데 사용할 수 있습니다. 에폭시와 함께 장소에 공동 및 보안을 통해 튜브 슬라이드. 열 수축 튜브는 조립을 완료하는 데 사용할 수 있습니다.

3. Microendoscope 이미징

1. 몇 군데있을 수있는 세포 또는 조직에 대비 에이전트를 적용합니다. proflavine (0.01 % PBS에 W / V)로, 문화에 세포의 체외 이미징에서 간단한 부화 (<1 분) 및 rinsing 철저히하여 수행할 수 있습니다. 예 생체내 조직 표본이나 생체내 조직의 이미징은 염색 가능한 다음과 같은 국소 응용 프로그램입니다. 이러한 조건 하에서 proflavine의 이해는 몇 초 몇 분 동안 지속 내에서 가능한 이미지와 거의 즉각적인 것으로 발견되었습니다.
2. 몇 군데있을 수있는 샘플과 빛의 접촉 광섬유 번들 놓습니다. 문화 또는 전직 생체내 조직 표본의 경우 이미징 세포, 우리는 영상 중 안정성 XYZ 도끼에 수동 위치 단계와 보안 고정물에 섬유 번들의 말초 끝에 장착하는 것이 좋습니다.

4. 대표 결과 :

제대로 조립하면 microendoscope는 일관된 광섬유 다발을 통해 릴레이 에피 형광 현미경로 작동합니다. 최적의 이미징 결과를 얻으려면,주의는 세 가지 핵심 조건이 충족되는 보장에 지불되어야합니다

1. 섬유 번들의 근위 얼굴은 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해, defocus없이 CCD 카메라에 몇 군데해야합니다. 그림 2A, B, C는 각각, 가난한 중심으로 몇 군데 섬유 번들의 일부 약간 defocus, 좋은 초점을 보여줍니다. 최적의 초점은 번들 얼굴에 상대적인 목적 렌즈의 축 위치를 조정하여 발견된다.
2. 섬유 번들의 근위 얼굴이 균일의 전체 직경 (뷰 필드)을 통해 조명되어야합니다. 프로토콜 텍스트 (1.7)에 설명한 바와 같이, 이것은 콜러 조명을위한 조명 광학을 구성하여 이루어진다. 그림 2D는 균일한 형광 샘플이 중요한 조명 아래에 해당하는 결과를 보여주는 그림 2E로이 선호하는 구성에서 조명 때 얻은 이미지를 보여줍니다. 후자의 경우, LED의 구조는 실제 샘플의 구조에 따라 겹쳐이 원치 않는 패턴의 모양에 결과 섬유 번들 얼굴에 몇 군데 있습니다.
3. 섬유 번들의 근위 및 말초 얼굴 모두 깨끗하고 긁힌 자국과 칩을 무료로해야합니다. 그림 2 층 섬유 경계 5 시에는 작은 칩 형태의 손상과 함께 번들 얼굴에 연결된 파편의 존재를 보여줍니다. 데브리는 렌즈 종이와 이소프로판올, 또는 표준 광섬유 청소 도구, 기존의 광섬유 커넥터와 같은 방식으로 청소하여 얼굴 번들에서 제거할 수 있습니다. 섬유 번들 중 하나 끝 긁힌이나 빠졌거나 번들의 길이를 따라 나면 얼굴 표준 수동 또는 기계적 연마 기술에 의해 평면 광택 수있다면. 우리는 0.5-1.0 μm의 용지에 최종 폴란드어와 초기 거친 폴란드어에 대한 논문을 래핑 12-15 μm의를 권장합니다.

그림 3A는 샘플에 베어 섬유 번들의 proflavine 가벼운 위치와 라벨 다음, 체외에서 세포의 1,483 이미징을 보여줍니다. 그림 3B는 공간 해상도 및 번들 팁에 보세 2.5x 미소 렌즈가 제공하는 뷰 필드에있는 감소에있는 개선을 보여줍니다. 영화 1은 마우스 모델에서 내유 지방 패드의 생체내 이미징에서 보여줍니다. 여기, 0.5 mm 외경 (330 μm의 뷰 필드)와 섬유 묶음은 21 게이지 바늘을 통과하여 조직으로 고급되었습니다. 지방세포는 15에서이 인수의 명백한 심장주기에 의한 움직임과 함께, 명확하게 볼 수 있습니다초당 프레임. 그림 3C는 건강한 인간 자원 봉사자의 구강 점막의 이미징, 1.5 mm 외경 (1.4 mm 뷰 필드)과 큰 광섬유 번들을 사용하여이 시간을 보여줍니다. 표시된 모든 예제에서는 proflavine은 핵 라벨 형광등 대비 에이전트로 사용되었다.

그림 1. 고해상도 microendoscope (HRME)를 조립. HRME 시스템 (A) 도식 다이어그램. 주요 optomechanical 지원 구조 (B) 조립. (C) 광학 요소의 추가는, 조명 LED 및 CCD 카메라. 10 "X 8"X 2.5 "인클로저에 패키지 HRME 시스템 (D) 사진.

그림 2. HRME을 설정합니다. (A) 불쌍한 초점 광섬유 번들과 영상의 예, (B) 좋은 초점 가까이 (C) 이상 중점을두고 있습니다. 년 (D), 번들의 말초 팁에서 균일한 형광 대상은 콜러 (교복) 조명 아래에 몇 군데 있습니다. (E) 균일한 형광 목표는 개체에 대한 명백한 소스 구조, 중요 조명 아래에 몇 군데. (F) 느슨한 조직과 세포는 또한 주변에 약간의 손상하는 경향이있는 섬유 번들 얼굴에 붙어 있습니다.

그림 3. HRME와 이미징. (A) 체외에서 1,483 세포는 proflavine 0.01 % (W / V)와 레이블 아래 노출된 광섬유 번들 (IGN-08/30)와 몇 군데. (B)와 같이 동일한 1,483 세포 배양은 (A), 2.5x 미소 렌즈가 붙어있는 섬유 번들로 몇 군데. proflavine 0.01 %의 국소 응용 프로그램 (W / V) 다음과 같은 생체내 정상적인 인간의 구강 점막 (C) 이미지.

영화 1. 이미징 조직으로 전달 21 게이지 바늘의 루멘 이내에 450 μm의 외경 섬유 번들의 삽입을 통해 마우스의 내유 지방 패드. Proflavine 0.01 % (W / V)은 이전 이미지 섬유의 삽입에 같은 주사 바늘을 ​​통해 이미징 사이트에 전달했다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

토론

고해상도 microendoscopy 기술은 현재 현장에서 휴대 세부 시각화를위한 유연하고 강력하며 비용 효율적인 방법으로 기본적인 생물 의학 및 임상 연구 분야의 연구자를 제공합니다 설명했다. 우리는 이미징 시스템을 조립을위한 프로토콜을 설명하고 체외에서 세포 배양에의 사용을 시연하고, 생체내의 동물에서 인간 조직했습니다. 여기에 제시된 이미징 결과 형광등 대비 에이전트로 proflavine를 사용하는 동안, 다른 단체는 ^5-7 다른 염료의 여기 / 방출 스펙트럼과 일치하는 선택한 LED 조명 파장 및 필터 시스템의 버전을 증명하고있다.

해상도와 뷰 필드는 처음 코어로 코어 간격 및 광섬유 번들의 이미징 직경에 따라 결정됩니다. 우리는 약 4 μm의 코어 코어 간격, 그리고 330 μm의 (영화 1), 720 μm의 (그림 2, 그림 3A, B), 그리고 1400 μm의 (그림 3C)의 이미지 직경과 번들을 사용했습니다. 작은 번들은 좁아 게이지 바늘 통과하고 큰 섬유보다 훨씬 더 유연하실 수 있습니다. 우리와 다른 ^8, 어떤 경우에는, 섬유에서 배출 autofluorescence의 모양 자체가 번들 언급했습니다. UV 파장에 fluorophores을 자극하거나, 빨간 스펙트럼 범위에서 방사를 수집하려고하면, 관심은 전체 측정 신호에 기여 섬유 번들 autofluorescence의 수준으로 지급해야합니다.

고해상도 microendoscopy 작업 대부분의 최신은 노출된 광섬유 번들을 사용했다고 보도되지만, 추가적인 확대가 말초 팁에 보세 미소 렌즈의 사용에 의해 제공될 수 있습니다. 미소 렌즈는 광학 aberrations과 제한된 NA 그들의 자화율이 잘 인식에도 불구하고, 공간 해상도를 높이기 위해 간단한 경제적 방법을 제공합니다. 미소 렌즈 성능은 특정 응용 프로그램, 하이브리드 미소 / 구면 렌즈의 목표 ⁹ 미니어처 객관적인 렌즈 어셈블리에 대한 불충 분한 경우에는 ^10-11을 고용 수 있습니다.

고해상도 microendoscope은 넓은 분야 에피 형광 현미경으로 운영 근본적으로 여기서 설명하므로 더 광학 sectioning (그런 공촛점 또는 비선형 현미경)을 기대하는 것입니다 않습니다. 우리의 경험에서 455 나노미터 여기 가볍고 대비 요원으로 국소 proflavine를 사용하여 조명은 주로 몇 셀 레이어에 해당하는 깊이에서 수집됩니다.

이 프로토콜은 독자가 10의 소형 풋프린트 함께 benchtop에서 "X 8"고해상도 microendoscope 조립 수 있도록 해야지. 원하는 경우, 시스템은 상자에 동봉된 및 전기 부품 (LED와 카메라) 배터리 팩 (그림 1D)에 의해 구동 수 있습니다. 대부분의 컴팩트 카메라는 IEEE - 1394 (파이어 와이어)와 호스트 컴퓨터의 USB 포트에 의해 구동 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)