De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Resumen

En muchas situaciones clínicas y biológicas es conveniente estudiar los procesos celulares a medida que evolucionan en su microambiente nativa. A continuación se describe el montaje y el uso de un bajo costo de fibra óptica de microscopio que puede ofrecer imágenes en tiempo real en el cultivo celular, los estudios en animales y estudios clínicos del paciente.

Resumen

Muchos estudios biológicos y clínicos requieren el estudio longitudinal y el análisis de la morfología y función de la resolución a nivel celular. Tradicionalmente, los múltiples experimentos se ejecutan en paralelo, con muestras individuales retirados del estudio en los puntos de tiempo secuencial para la evaluación por microscopía de luz. Varias técnicas de intravital se han desarrollado, con confocal, multifotónica, y la microscopía segundo armónico todos los que demuestren su capacidad de ser utilizado para obtener imágenes in situ ^1. Con estos sistemas, sin embargo, la infraestructura necesaria es complejo y costoso, que implican un barrido láser y los sistemas complejos las fuentes de luz. Aquí se presenta un protocolo para el diseño y montaje de una microendoscope de alta resolución que puede ser construida en un día usando fuera de la plataforma de componentes de bajo EE.UU. $ 5.000. La plataforma ofrece flexibilidad en cuanto a resolución de la imagen, el campo de visión y de operación de longitud de onda, y se describe cómo estos parámetros se pueden modificar fácilmente para satisfacer las necesidades específicas del usuario final.

Nosotros y otros han explorado el uso de la microendoscope de alta resolución (HRME) en el cultivo celular in vitro ^2-5, en extirpado ⁶ y ^2,5 viven los tejidos animales, y en los tejidos humanos in vivo ^2,7. Los usuarios han reportado el uso de varios agentes de contraste fluorescentes, incluyendo proflavina ^2-4, benzoporfirina derivado monoácido anillo A ⁵ (BPD-MA), y ^6,7 fluoresceína, todos los cuales han recibido completo, o la aprobación de investigación de la FDA para su uso en seres humanos. De alta resolución microendoscopy, en la forma descrita aquí, puede apelar a una amplia gama de investigadores que trabajan en las ciencias básicas y clínicas. La técnica ofrece un método eficaz y económico que complementa la microscopía de sobremesa tradicionales, permitiendo al usuario realizar de alta resolución, imágenes longitudinal in situ.

Protocolo

1. Microendoscope Asamblea

El microendoscope de alta resolución se describe aquí (figura 1) debe ser considerado como una configuración de base con algunas variaciones posibles en el montaje y aplicación. Se describe en detalle la encarnación de la plataforma que está diseñada para ser utilizada con proflavina como un agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear es una brillante mancha con pico de absorción y emisión de longitudes de onda de 445 nm y 515 nm, respectivamente. El uso de otros agentes de contraste se requiere que el usuario seleccione la excitación, emisión y filtros dicroicos adecuadamente. Varios elementos de la microendoscope de alta resolución son de carácter genérico y se puede obtener de múltiples proveedores. Por ejemplo, los componentes óptico-mecánica de posicionamiento están disponibles en Thorlabs, Newport, Linos, entre otros. Compactas cámaras CCD están disponibles de compañías como Point Grey Research, Prosilica y Retiga; sensibilidad de la cámara deben ser elegidos de acuerdo a la luminosidad del fluoróforo que se utilizarán, así como el tipo de marco. De alta potencia de los diodos emisores de luz (LED) se puede obtener de Luxeon, cree, y Nichia, entre otros. De fibra óptica de paquetes están disponibles a partir de Sumitomo, Fujikura, y Schott. En la selección de componentes para una aplicación específica, el usuario debe considerar las relaciones inherentes a la microscopía de fluorescencia entre la concentración del fluoróforo, photobleaching, intensidad de la iluminación, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición.

1. Conecte el 6 "barras de la jaula a los 1,5" barras de la jaula, para formar un par de 7.5 "varas de largo. Tornillo de estas barras en una sola cara de la unidad de espejo doble. Tornillo de 0,5" barras en la cara opuesta. Deslice el cubo de la jaula en las barras de la jaula, a través de la parte inferior dos orificios pasantes. Tornillo de 2 "barras en la cara lateral del cubo de la jaula (fig. 1B).
2. Conecte la cámara a una placa de la jaula con un C-mount a un adaptador de SM1. Fije la placa de la jaula en el 0,5 barras de la jaula ", alineado con la cara de la unidad de espejo doble.
3. Inserte el "tubo" de la lente en un 3 "tubo de la lente de largo y asegurar el objetivo con un anillo de retención. La longitud focal de la lente debe ser seleccionado de tal manera que los núcleos del haz de fibra óptica se muestra por lo menos dos píxeles cuando se proyecta en la cámara. Coloque el filtro de emisiones en el tubo en la parte superior del primer anillo de contención, y añadir otro anillo para bloquear el filtro en su lugar. Tenga en cuenta las convenciones orientación filtro indicado por el fabricante del filtro. Atornille el tubo de la lente en el lado de la jaula de cubo más cercano a la cámara CCD. Tenga en cuenta que en la figura 1c, este objetivo y el filtro se muestran sin el tubo de la lente 3 "para mayor claridad.
4. Conecte la cámara a un ordenador y ver la imagen en la pantalla. Dirigir el montaje de la jaula en un objeto distante y deslice el cubo de la jaula a lo largo de los rieles hasta que aparece una imagen en foco. Bloquear el cubo de la jaula en este lugar. (Este es un método sencillo de asegurar que el lente del tubo se forma una imagen nítida cuando se combina con el infinito lente con corrección de objetivos).
5. Inserte el espejo dicroico en el soporte y el lugar 45 º en el cubo de la jaula.
6. Tornillo de la lente del objetivo, a través de un adaptador de rosca RMS a SM1 y un tubo de lente ajustable, en la cara del cubo de la jaula frente a la titular de la lente del tubo. Un z-traductor puede ser utilizado en lugar del tubo de lente ajustable para facilitar el enfoque. Tornillo de un conector SMA en una placa de montaje de la jaula y esta en las barras, aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente del objetivo.
7. Montar un LED en una placa de la jaula y deslizarse hacia el extremo de los dos "varas. Añadir una lente a un 0,5" tubo de la lente de tal manera que cuando este tubo se atornilla en el lado del cubo jaula, se forma una imagen del LED que llena la abertura posterior de la lente del objetivo. Esta configuración (Kohler iluminación) se asegurará de que la cara proximal del haz de fibra óptica es uniformemente iluminada. Añadir el filtro de excitación en el tubo de la lente de 0.5 "y seguro en su lugar con un anillo de retención (figura 1c).
8. Conecte un conector SMA a un paquete de fibra óptica. Atornille el conjunto SMA conectorizado en el receptáculo de SMA montados en las barras de la jaula. Dirigir el extremo distal del haz hacia una fuente de luz de banda ancha (iluminación fluorescente es suficiente) y observe la imagen de la cara proximal paquete de la cámara CCD. Ajustar la posición de la lente del objetivo por atornillado dentro o fuera del cubo de la jaula hasta que la imagen aparece un haz de fibras en el enfoque. Los núcleos individuales deben ser claramente visibles (Figura 2).

2. GRIN conjunto de la lente

La resolución espacial de la microendoscope se puede aumentar por colocar un objetivo de micro-o conjunto de la lente en la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas están configurados de tal manera que en lugar de colocar la punta del paquete directamente en el tejido, la punta se forma la imagen sobre la superficie del tejido con demagnification, lo que aumenta la frecuencia de muestreo espacial impuesta por la orientación de luzING núcleos del haz de fibras. El grado de demagnification corresponde al aumento de la resolución espacial, y al mismo tiempo, a una disminución proporcional en el campo de visión. Componentes del gradiente de índice (GRIN) son compatibles con lentes de fibra óptica y están disponibles en GrinTech, GSN, Schott, entre otros, y puede ser directamente unido a la punta distal de un haz de fibras.

1. Seleccione una lente GRIN con la ampliación deseada y la distancia de trabajo para su aplicación. Asegúrese de que el diámetro de la lente superior a la del haz de fibras va a trabajar. Recomendamos que el haz de fibras y el cristalino GRIN ser montado en distintos estadios de 3 ejes de posicionamiento manual bajo el microscopio estereoscópico de baja potencia o de una correcta alineación antes de la unión.
2. Coloque una gota de pegamento óptico (por ejemplo, UV Norland adhesivo de curado), tanto en la lente o en la cara paquete. Reunir a los dos componentes en contacto mediante el uso de los posicionadores manual. Exponer la interfaz a la luz ultravioleta de la dosis recomendada por el fabricante.
3. Para proteger la lente GRIN y al interfaz conjunto, una longitud de tubo de aluminio capilar (Small Parts Inc.) puede ser usado para encerrar la articulación. Deslice la tubería sobre la articulación y la seguridad en el lugar con epoxy. Tubería del encogimiento del calor se puede utilizar para terminar el montaje.

3. Microendoscope imágenes

1. Aplicar el agente de contraste a las células o tejido que se va a examinar. Con proflavina (0,01% w / v en PBS), en las imágenes in vitro de las células en cultivo puede realizarse mediante la incubación breve (<1 minuto) y enjuague. Imágenes de los especímenes de tejido ex vivo o in vivo en los tejidos es posible tras la aplicación tópica de la tintura. La captación de proflavina bajo estas condiciones se ha encontrado para ser casi instantánea, con las imágenes posible en unos pocos segundos y una duración de varios minutos.
2. Coloque el cable de fibra óptica en ligero contacto con la muestra que se va a examinar. Cuando las células de imagen en la cultura o la ex muestras de tejido vivo, se recomienda montar el extremo distal del haz de fibras en un dispositivo de seguridad con las etapas de la colocación manual de los ejes XYZ para la estabilidad durante la exploración.

4. Los resultados representativos:

Una vez montado correctamente, el microendoscope funcionará como un microscopio de epifluorescencia, transmitida a través de una política coherente de fibra óptica de conjunto. Para obtener unos resultados de imagen óptima, se debe prestar atención para asegurar que las tres condiciones clave que se cumplan:

1. La cara proximal del haz de fibras debe ser reflejado en la cámara CCD sin desenfoque, con el fin de lograr la resolución completa del sistema. Figura 2a, b, c muestran una parte de un haz de fibras imágenes con un enfoque pobres, desenfoque ligero, y un buen enfoque, respectivamente. El nivel óptimo de enfoque se encuentra ajustando la posición axial de la lente del objetivo relativo a la cara paquete.
2. La cara proximal del haz de fibras debe ser uniformemente iluminada sobre su diámetro total (campo de visión). Como se describe en el texto del Protocolo (1,7), esto se logra mediante la configuración de la óptica de iluminación para la iluminación de Kohler. La Figura 2d muestra una imagen adquirida en una muestra uniforme fluorescente se ilumina en esta configuración preferida, con la Figura 2e demuestra el resultado correspondiente bajo iluminación crítica. En este último caso, la estructura de los LED se crea una imagen en la cara del haz de fibras, lo que resulta en la aparición de este patrón no deseados superpone a la estructura de la muestra real.
3. Tanto las caras proximal y distal del haz de fibras debe estar limpia y libre de arañazos y patatas fritas. Figura 2f muestra la presencia de restos unida a la cara paquete, con un daño en la forma de un pequeño chip a las 5 en el perímetro de la fibra. Los escombros pueden ser retirados del paquete se enfrenta a la limpieza de la misma manera como convencionales conectores de fibra óptica, con el papel de la lente y el isopropanol, o fibra óptica estándar de herramientas de limpieza. Si cualquiera de los extremos del haz de fibras está rayado o astillados, o si el paquete se rompe a lo largo de su longitud, la cara puede ser pulido plana en el manual estándar, o las técnicas mecánicas de pulido. Recomendamos 12-15 micras lamiendo el papel de un esmalte grueso inicial, con un toque final en el papel 0.5-1.0 micras.

Figura 3a muestra imágenes de 1483 células in vitro, a raíz de etiquetado con la colocación proflavina y la luz del haz de fibras al descubierto en la muestra. Figura 3b muestra la mejora en la resolución espacial y la reducción del campo de visión proporcionada por una lente GRIN 2.5x unido a la punta del paquete. Película 1 muestra imágenes in vivo de la almohadilla de grasa mamaria en un modelo murino. Aquí, un haz de fibras con un diámetro exterior de 0,5 mm (330 micras campo de visión) fue aprobada a través de una aguja de calibre 21 y se dirigen hacia el tejido. Las células grasas son claramente visibles, con el movimiento por el ciclo cardíaco evidente en esta adquisición de 15fotogramas por segundo. La figura 3c muestra imágenes de la mucosa oral en voluntarios humanos sanos, esta vez usando un haz de fibras más grande con 1,5 mm de diámetro exterior (1,4 mm campo de visión). En todos los ejemplos mostrados, proflavina fue utilizado como un agente de contraste fluorescente etiquetado nuclear.

Figura 1. Montaje de la microendoscope de alta resolución (HRME). (A) Diagrama esquemático del sistema de HRME. (B) de la Asamblea de la estructura de soporte óptico-principal. (C) La adición de elementos de óptica, iluminación LED y una cámara CCD. (D) Fotografía del sistema HRME, envasado en un 10 "x 8" x 2,5 "caja.

Figura 2. Configuración del HRME. Ejemplos de imágenes con el paquete de fibra óptica en (a) La concentración pobre, (b) cerca de un buen enfoque, (c) enfoque ideal. En (d), un blanco uniforme fluorescente en el extremo distal del haz es reflejado en Kohler (uniforme) de iluminación. (E) Un blanco fluorescente uniforme imágenes bajo iluminación crítica, con la estructura aparente de la fuente en el objeto. (F) los tejidos y células sueltas se pueden pegar a la cara un haz de fibras, que también es propensa a daños menores en su periferia.

Figura 3. Imágenes con la HRME. (A) 1.483 células in vitro, con imágenes de un haz de fibras desnudas (IGN-08/30) después de marcar con proflavina 0,01% (w / v). (B) El mismo 1483 el cultivo de células como se muestra en (a), fotografiado con un haz de fibras con la lente de 2.5x GRIN adjunto. (C) de la imagen de la mucosa normal oral humana in vivo, tras la aplicación tópica de proflavina 0,01% (w / v).

Movie 1. Imagen de la almohadilla de grasa mamaria de un ratón a través de la inserción de un 450 micras de diámetro exterior de un haz de fibras dentro de la luz de una aguja de calibre 21 pasado en el tejido. Proflavina 0,01% (w / v) fue entregado en el lugar de imágenes con la misma aguja antes de la inserción de la fibra de imagen. Haga clic aquí para ver el video

Discusión

La técnica de alta resolución microendoscopy descrito aquí proporciona a los investigadores en las áreas de investigación biomédica básica y clínica con un método flexible, robusta y rentable para la visualización de detalles celulares in situ. Se ha descrito un protocolo para el montaje del sistema de imágenes y ha demostrado su uso en cultivo celular in vitro y en animales, y los tejidos humanos in vivo. Mientras que los resultados de las imágenes que aquí se presenta utiliza proflavina como un agente de contraste fluorescente, otros grupos han demostrado las versiones del sistema, con longitudes de onda de la iluminación LED y filtros elegido para que coincida con la excitación / emisión de los espectros de los colorantes ^5-7 otras.

Resolución y campo de visión-son inicialmente determinado por el espacio de núcleo a núcleo y el diámetro de imagen del haz de fibras ópticas. Hemos utilizado los paquetes con aproximadamente 4 micras núcleo central separación, y los diámetros de imagen de 330 micras (una película), 720 m (Figura 2, Figura 3a, b), y 1400 m (Figura 3c). Los paquetes más pequeños pueden pasar a través de agujas de calibre más estrecho y son mucho más flexibles que las fibras más grandes. Nosotros y otros ^ocho, en algunos casos, observó la aparición de las emisiones de autofluorescencia de la fibra sí mismo paquete. Cuando se trata de excitar fluoróforos en longitudes de onda UV, o recoger las emisiones en el rango espectral de color rojo, se debe prestar atención al nivel de la autofluorescencia de haces de fibras que contribuye a la señal total medida.

Mientras que la mayoría de los trabajos de alta resolución microendoscopy informó a la fecha ha utilizado un haz de fibras desnudas, ampliación adicional puede ser proporcionada por el uso de lentes GRIN unido a la punta distal. Lentes GRIN ofrecen una manera sencilla y económica para aumentar la resolución espacial, a pesar de su susceptibilidad a las aberraciones ópticas y NA limitada es bien reconocida. Si el rendimiento de la lente GRIN es inadecuada para una aplicación particular, GRIN híbrido / objetivos lente esférica ⁹ o en miniatura asambleas lente del objetivo ^10-11 puede ser empleado.

El microendoscope de alta resolución se describe aquí funciona básicamente como un gran campo epi-microscopio de fluorescencia, por lo tanto no seccionamiento óptico (como en la microscopía confocal o no lineal) es de esperar. En nuestra experiencia, con 455 nm de excitación y la luz proflavina actualidad como un agente de contraste, la luz se recopilan principalmente a una profundidad que corresponde a una pocas capas de células.

Este protocolo debe permitir al lector para montar el microendoscope de alta resolución en el laboratorio, con un tamaño compacto de 10 "x 8". Si lo desea, el sistema puede ser encerrado en una caja y los componentes eléctricos (LED y una cámara) alimentado por una batería (Figura 1d). Muchas cámaras compactas pueden ser alimentados por la IEEE-1394 (Firewire) y USB de la computadora host.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)