مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

Summary

وقد أنشئت انطباق مقايسة لتقييم جدوى مولد الرمع الإنجابية لأكثر من 50 عاما. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خلايا ملتصقة.

Abstract

تم تأسيس (أو تشكيل مستعمرة) مولد الرمع مقايسة لأكثر من 50 عاما ، وقد نشرت الورقة الأصلية التي تصف هذه التقنية في عام 1956 ^1. وبصرف النظر عن توثيق الأسلوب ، ولدت في دراسة المعالم الأولية أول منحنى الاستجابة للجرعة الاشعاع بالأشعة السينية المشع خلايا (هيلا) الثدييات في الثقافة ^1. في الأساس ، وفحص مولد الرمع تمكن من إجراء تقييم للاختلافات في البقاء الإنجابية (قدرة الخلايا على إنتاج ذرية ، أي خلية واحدة لتشكيل مستعمرة من 50 أو أكثر من الخلايا) بين الخلايا والخلايا غير المعالجة السيطرة التي خضعت العلاجات المختلفة مثل التعرض والإشعاع المؤين ، والمركبات الكيميائية المختلفة (وكلاء السامة للخلايا ، مثلا) أو في الحالات الأخرى التلاعب الجيني. أصبح مقايسة التقنية الأكثر قبولا في البيولوجيا الإشعاعية واستخدمت على نطاق واسع لتقييم مدى حساسية الإشعاع من خطوط مختلفة من الخلايا. كذلك ، يستخدم عادة لفحص مولد الرمع لرصد فعالية مركبات تعديل والإشعاع لتحديد تأثيرات العوامل السامة للخلايا وغيرها من العلاجات المضادة للسرطان على قدرة تشكيل مستعمرة ، في خطوط مختلفة من الخلايا. وبقاء مولد الرمع نموذجية التجربة باستخدام الخلايا الملتصقة خطوط ينطوي على ثلاثة عناصر متميزة ، 1) معالجة المونولاير خلية في قوارير زراعة الأنسجة ، 2) إعداد تعليق خلية واحدة والطلاء عدد مناسب من الخلايا في أطباق بتري و 3) تحديد وتلطيخ المستعمرات بعد فترة حضانة ذات الصلة ، والتي يمكن أن تتراوح بين 1-3 أسابيع ، اعتمادا على خط الخلية. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خطوط الخلايا الملتصقة مع استخدام لخلد الإنسان خط خلية خلية كيراتينية (FEP - 1811) ^2. أيضا ، ويهدف لدينا هي لوصف الخصائص المشتركة للالمقايسات مولد الرمع بما في ذلك حساب الكفاءة والطلاء والكسور البقاء بعد التعرض للإشعاع من الخلايا ، ومثالا على التعديل استجابة للإشعاع مع استخدام صيغة الطبيعية المضادة للأكسدة.

Protocol

1. الثقافة الخلية وتعيين ما يصل التجريبي

1. تمسك الكيراتينية monolayers الإنسان كما في 75 سم ² القوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 15 مل من SFM - خلية كيراتينية (K - SFM) المتوسط ​​(GIBCO والمصل خالية متوسطة) تستكمل مع الجلوتامين L - (2 ملم) ، وعامل نمو البشرة (5 نانوغرام / مل) ، واستخراج الغدة النخامية البقري (40 ميكروغرام / مل) و 20 جنتاميسين ملغ / مل. تزرع الخلايا في بيئة ترطيب 5 ٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية.
2. والخلايا في المصنف 12 × 25 سم ² القوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5 مل من K - SFM المتوسط.

مستعدون تعليق خلية واحدة بواسطة trypsinization. تغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة وحضنت مع الحل التربسين / EDTA 0.05 ٪ لمدة 5-10 دقائق. عندما تبدأ الخلايا لتصبح مستديرة ومنفصلة ~ 30 ٪ ، يضاف 3 مجلدات متوسطة Dulbecco لتعديل النسر يحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني لتحييد التربسين. يتم فصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا (20 مرات). يتم عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

والأرقام المصنفة الخلية المناسبة وفقا للوقت مضاعفة خط الخلية (حوالي 20 ساعة من أجل الإنسان الكيراتينية - 1811 FEP). الهدف هو تحقيق 90 ٪ confluency ~ (~ 10 ⁶ خلايا في قارورة) في يوم من التجربة.

تجربة تتألف من 12 قوارير هو الأمثل لفحص مولد الرمع احد (ستة السيطرة غير المشع وستة قوارير المشع) والتي يمكن الانتهاء منه في أربع ساعات تقريبا.

2. والعلاج بالإشعاع

1. علاج الخلايا لفترة مناسبة مع مجمع الإشعاع تعديل الخلايا ذات الصلة ، وفضح للإشعاع المؤين إما γ الإشعاع أو الأشعة السينية.

بين ستة قوارير بمثابة كفاءة الطلاء (غير المعالجة) والضوابط المخدرات فقط. والمشع الستة الأخرى القوارير.

في هذا المثال تعامل الإنسان مع التركيز الكيراتينية مختلف PF Cinnulin (CPF ؛ المغذيات النزاهة الدولية ، ربيع هيل ، تينيسي ، الولايات المتحدة ؛ بيانات تمثيلية للهو مبين 20 ميكروغرام / مل أدناه) ، وهو صياغة للذوبان في الماء الطبيعية المضادة للأكسدة ، لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. هي الخلايا المشع مع 4 غراي باستخدام مصدر سيزيوم ¹³⁷ (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، ON ، كندا ؛ 1.6 غراي / دقيقة).

3. تصفيح

1. بعد العلاج ، ويتم الحصول على تعليق خلية واحدة كما هو موضح سابقا.
2. يتم حساب عدد الخلايا في كل عينة باستخدام بعناية عدادة الكريات والمخففة هي المصنفة بحيث أعداد الخلايا المناسبة في أطباق بتري (خمسة مكررات كل الأطباق في 15 ملم).
   وينبغي توقع الطلاء الكفاءة و / أو كسر قيد الحياة عند البت في عدد من الخلايا على البذور في لوحة. الهدف هو تحقيق مجموعة من بين 20-150 المستعمرات.

يتم ترتيب أطباق بتري في مربع الاستنساخ البلاستيك ترطيب والمحتضنة في بيئة 5 ٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية لتشكيل مستعمرة.

فترة حضانة لتشكيل مستعمرة يختلف من 1-3 أسابيع لخطوط مختلفة من الخلايا ، ومن المتفق عليه أن الوقت يجب أن يكون معادلا لانقسامات الخلية لا يقل عن ستة. في هذا المثال ، وأطباق لمراقبة الكيراتينية البشرية تتطلب ثمانية أيام لتشكيل استنساخ كبيرة بما فيه الكفاية التي تتكون من 50 أو أكثر من الخلايا.

4. تحديد ويلطخ المستعمرات

أكمل الخطوات التالية في غطاء الدخان.

1. إزالة بلطف وسائل الإعلام من كل من الصفائح التي كتبها الطموح.
2. يغسل كل لوحة المالحة مع 5 مل 0.9 ٪.
3. إصلاح المستعمرات مع 5 مل من حل 10 ٪ محايدة الفورمالين مخزنة عن 15-30 دقيقة.
4. وصمة عار مع 5 مل من الكريستال البنفسجي 0.01 ٪ (W / V) في DH ₂ O ل 30-60 دقيقة.
5. يغسل مع فائض البنفسجي الكريستال درهم ₂ O والسماح الأطباق لتجف.

5. مستعمرة العد

Stereomicroscope

1. يتم عد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلايا فردية باستخدام stereomicroscope.

التصوير الرقمي والتصوير العد باستخدام البرمجيات

1. ويتم الحصول على الصور الرقمية من المستعمرات باستخدام الكاميرا أو جهاز المسح الضوئي
2. يتم عد المستعمرات التصوير باستخدام حزم برمجيات التحليل على النحو المبين أدناه.

عد الخلايا باستخدام ImageJ (فيجي الإصدار 1.44a)

1. فتح ملف الصورة في فيجي ، انتقل إلى ملف --> فتح.
2. إذا اقتضى الأمر تحويل الصورة إلى تنسيق 8 بت ، انتقل إلى الصورة --> ضبط...-> عتبة.
3. ضبط عتبة للحد من مستويات غير محددة الخلفية بحيث يتم الكشف عنها فقط في المستعمرات.
4. عدد المستعمرات باستخدام ما يلي : اذهب إلى عملية --> ثنائي --> البحث عن ماكسيما.

صورة لهذا الشكل ، يمكن تعيين التسامح الضوضاء إلى 0. تأكد من أن الخيار تكتك الخلفية الخفيفة ومعاينة ماكسيما الكشف للتأكد من أن تم الانتهاء من جميع المستعمرات الخلية مسجلة بشكل صحيح.

Discussion

في هذا المثال تم علاج الإنسان FEP - 1811 الكيراتينية بتركيزات مختلفة تصل الى 100 ميكروغرام / مل CPF ؛ تظهر البيانات لمدة 20 ميكروغرام / مل CPF لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. وكانت الخلايا المشع بعد العلاج مع 4 غراي باستخدام مصدر سيزيوم ¹³⁷ (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، O...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI Supplies	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon Instruments		Used to count colonies consisting of >50 cells.