Clonogênica Ensaio: células aderentes

Resumo

A aplicabilidade do ensaio clonogênica na avaliação de viabilidade reprodutiva foi estabelecida há mais de 50 anos. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com células aderentes.

Resumo

O clonogênica ensaio (ou formadoras de colônia) foi estabelecida há mais de 50 anos; o papel original que descreve a técnica foi publicada em 1956 ^1. Além de documentar o método, o estudo marco inicial gerada a curva de resposta primeira dose de radiação de raios-X de mamíferos irradiados (HeLa) células em cultura ^1. Basicamente, o ensaio clonogênica permite uma avaliação das diferenças de viabilidade reprodutiva (capacidade das células de produzir descendentes, ou seja, uma única célula para formar uma colônia de 50 ou mais células) entre as células controle não tratadas e as células que sofreram vários tratamentos, como a exposição a radiação ionizante, vários compostos químicos (por exemplo, agentes citotóxicos) ou em outros casos, a manipulação genética. O ensaio tornou-se a técnica mais aceita na biologia de radiação e tem sido amplamente utilizada para avaliar a sensibilidade à radiação de linhas de células diferentes. Além disso, o ensaio clonogênica é comumente usado para monitorar a eficácia de compostos de radiação modificando e para determinar os efeitos de agentes citotóxicos e outros anti-câncer terapêuticas sobre a capacidade formadora de colônia, em linhas de células diferentes. A experiência de sobrevivência típico clonogênica usando linhas de células aderentes envolve três componentes distintos, 1) o tratamento da monocamada de células em frascos de cultura de tecidos, 2) a preparação de suspensões de células individuais e revestimento de um número adequado de células em placas de petri e 3) de fixação e coloração colônias após um período de incubação relevante, que pode variar de 1-3 semanas, dependendo da linha celular. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com linhas de células aderentes com o uso de uma linha celular imortalizada dos queratinócitos humanos (FEP-1811) ^2. Além disso, nossos objetivos são descrever características comuns de ensaios clonogênica incluindo o cálculo da eficiência revestimento e frações de sobrevivência após a exposição das células à radiação, e para exemplificar a modificação da radiação-resposta com o uso de uma formulação antioxidante natural.

Protocolo

1. Cultura de células e Experimental Set-up

1. Queratinócitos humanos são mantidos como monocamadas em 75 cm ² frascos de cultura de tecidos contendo 15 mL de queratinócitos-SFM (K-SFM), médio (GIBCO, sem soro médio) suplementada com L-glutamina (2 mM), fator de crescimento epidérmico (5 ng / mL), extrato de hipófise bovina (40 mg / mL) e 20 mg / mL de gentamicina. As células são cultivadas em um 5% CO ₂ umidificado ambiente a 37 ° C.
2. Células são semeadas em 12 x 25 cm ² frascos de cultura de tecidos contendo 5 mL de K-SFM médio.

Suspensões de células individuais são preparados por tripsinização. As células são lavadas com solução fisiológica tamponada e incubados com uma solução de tripsina 0,05% / EDTA por 5-10 minutos. Quando as células começam a se tornar arredondado e ~ 30% são individual, com 3 volumes de meio de Dulbecco modificado da águia contendo 10% de soro fetal bovino é adicionado para neutralizar o tripsina. As células são separadas por pipetagem cima e para baixo (20 vezes). As células são contadas usando um hemocitômetro.

Número de células apropriadas são semeados de acordo com o tempo de duplicação da linha celular (aproximadamente 20 horas para humanos FEP-1811 queratinócitos). O objetivo é alcançar a confluência ~ 90% (~ 10 ⁶ células por frasco) no dia do experimento.

Um experimento composto por 12 frascos é ideal para um ensaio clonogênica única (seis controle não irradiado e seis frascos irradiados), que pode ser concluído em aproximadamente quatro horas.

2. Tratamento e irradiação

1. Tratar células durante tempo suficiente com um composto de radiação de modificação relevante e expor as células à radiação ionizante ou radiação γ ou raios-X.

Tipicamente seis frascos servem como revestimento de eficiência (sem tratamento) e controles única droga. Os outros seis frascos são irradiados.

Neste exemplo queratinócitos humanos são tratados com a concentração de vários Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals Integrity International, Spring Hill, TN, EUA; dados representativos para 20 mcg / mL é mostrada abaixo), uma formulação hidrossolúvel antioxidante natural, por 1 hora a 37 ° C. Células são irradiados com 4 Gy usando uma fonte de ¹³⁷ Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min).

3. Galvanização

1. Após o tratamento, suspensões única célula são obtidas como descrito anteriormente.
2. O número de células em cada amostra são contados com cuidado utilizando um hemocitômetro e diluído de tal forma que o número de células apropriadas são semeados em placas de Petri (cinco repetições de cada um em 15 pratos mm).
   O revestimento de eficiência e / ou fração sobrevivente deve ser antecipado ao decidir o número de células de sementes por placa. O objetivo é alcançar uma faixa entre 20-150 colônias.

Placas de Petri são dispostos em uma caixa de clonagem umidificado plástico e incubadas em ambiente de 5% CO ₂ a 37 ° C para a formação de colônia.

O tempo de incubação para a formação de colônia varia de 1-3 semanas para as linhas de células diferentes, é aceito que o tempo deve ser equivalente a pelo menos seis divisões celulares. Neste exemplo, os pratos de controle para queratinócitos humanos exigem oito dias para formar clones suficientemente grande composta por 50 ou mais células.

4. Fixação e coloração Colônias

Conclua as seguintes etapas em uma capela.

1. Remova cuidadosamente os meios de comunicação de cada uma das placas por aspiração.
2. Lavar cada placa com 5 mL solução salina 0,9%.
3. Corrigir as colônias com 5 mL de solução-tampão de 10% de formalina neutra por 15-30 minutos.
4. Mancha com 5 mL de cristal violeta 0,01% (w / v) em dH ₂ O por 30-60 minutos.
5. Lavar o excesso de cristal violeta com dH ₂ O e permitir que os pratos para secar.

5. Contando colônia

Estereomicroscópio

1. Colônias com mais de 50 células individuais são contados em um estereomicroscópio.

Imagem digital e contando com software de imagem

1. Imagens digitais das colônias são obtidas usando uma câmera ou o dispositivo de digitalização
2. Colónias são contadas usando pacotes de software de análise de imagem, como descrito abaixo.

Contagem de células usando ImageJ (Fiji versão 1.44a)

1. Abra o arquivo de imagem em Fiji, vá ao menu Arquivo -> Open.
2. Se for necessário converter a imagem para 8 bits formato, vá para Image -> Adjust Threshold ...->.
3. Ajuste o limiar para reduzir os níveis de não-específico de fundo de modo que somente as colônias são detectados.
4. Contagem de colônias usando o seguinte: vá para Processo - Binary> -> Localizar maxima.

Para este formato de imagem, tolerância ao ruído pode ser definido como 0. Garantir que a opção luz de fundo está marcada e visualizar o maxima detectada para verificar se todas as colônias de células têm sido registrado corretamente.

Discussão

Neste exemplo humano FEP-1811 queratinócitos foram tratados com diferentes concentrações de até 100 mcg / mL CPF; dados são apresentados por 20 mcg / mL CPF para 1 hora a 37 ° C. Células após o tratamento foram irradiados com 4 Gy usando uma fonte de ¹³⁷ Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para o controle não tratado e de drogas tratamentos apenas 100 células foram semeadas em cada placa de Petri e 1000 células por placa foram banhados para as amo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI Supplies	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon Instruments		Used to count colonies consisting of >50 cells.