تميز باستخدام مواد متطايرة الجرثومي الثانوي قداس الطيف Electrospray التأين (سيسي - MS)

Heather D. Bean; Jiangjiang Zhu; Jane E. Hill

doi:10.3791/2664

Summary

التأين مطياف الكتلة الثانوية electrospray (سيسي - MS) تمكن من الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة من دون الحاجة إلى أي معالجة مسبقة العينة. هذا البروتوكول يوفر إرشادات لتوصيف (في غضون دقائق) السريع للبكتيريا باستخدام المركبات العضوية المتطايرة سيسي - MS.

Abstract

التأين مطياف الكتلة الثانوية electrospray (سيسي - MS) هو طريقة تم تطويرها للكشف السريع للمركبات طيارة ، من دون الحاجة إلى المعالجة العينة. وكان أول وصف للطريقة التي فين وزملاؤه ¹ و تم تطبيقه على الكشف عن المخدرات والمتفجرات غير المشروعة ^{2 3-4} ، وتوصيف المواد المتطايرة الجلد ⁵ ، وتحليل النفس ^6-7.

سيسي التأين يحدث من خلال ردود الفعل نقل بروتون بين الحل وelectrospray الحليلة المتقلبة ، وبالتالي فهي مناسبة لتحليل الجزيئات العضوية مغاير ، كما هو الحال في التأين electrospray التقليدية (ESI). لكن ، خلافا ESI القياسية ، فإن عملية نقل بروتون من سيسي يحدث في مرحلة البخار بدلا من الحل (الشكل 1) ، وبالتالي سيسي هو الانسب للكشف عن المواد المتطايرة العضوية والهباء الجوي.

نحن الآن بصدد توسيع استخدام سيسي - MS للكشف عن المواد المتطايرة البكتيرية كوسيلة لتحديد وتوصيف ⁸ البكتيرية. لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام MS - سيسي البصمات متقلبة ، جنبا إلى جنب مع طريقة التحليل الإحصائي ، لتمييز الأجناس البكتيرية ، والأنواع والثقافات المختلطة في مجموعة متنوعة من وسائط النمو. نقدم هنا ⁸ خطوات للحصول على بصمات الأصابع باستخدام بكتيريا متقلبة سيسي - MS ، بما في ذلك معلمات الفعال الذي يجب أن يكون الأمثل لضمان تحديد البكتيريا قوية والتوصيف.

Protocol

figure-protocol-65
الشكل 1. تخطيطي لسيسي - MS تحليل المواد المتطايرة البكتيرية. غير المشردين فراغ الرأس من ثقافة البكتيرية التي CO ₂ (1) في دائرة رد الفعل سيسي (2). كما المتطايرة اجتياز دائرة رد الفعل سيسي أنها تمر من خلال سحابة electrospray وتصبح مؤينة (3). المؤينة مرة واحدة ، يتم سحبها من المواد المتطايرة في مطياف الكتلة لتحليل (4). يتم تمرير الغاز الناقل الزائدة والمواد المتطايرة البكتيرية غير المتفاعل من خلال مرشح 0.22 ميكرون (5) ، وكتدبير إضافي للحماية ، وإعادتها إلى غطاء الكيميائية. أقحم : الإبرة electrospray سيسي هو السيليكا الشعرية (40 معرف ميكرون) مع طرف الإبرة شحذ.

كدليل على استخدام سيسي - MS لتوصيف المواد المتطايرة البكتيرية ، E. القولونية K12 و P. تستزرع PAO1 الزنجارية هوائيا لمدة 24 ساعة في 50 مل لينوكس في LB - 37 درجة مئوية ويتم جمع أطياف سيسي MS - المتطايرة من فراغ الرأس في 2 دقيقة. ويستخدم غاز ثاني أكسيد الكربون (99.99 ٪) بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة والغاز الناقل عن تسليم متقلبة إلى دائرة رد الفعل. كان رد فعل الغرفة المخصصة سيسي بناء وتركيب لAPI - 3000 (SCIEX) ، ليحل محل أيون electrospray الأصلي المصدر. يتم جمع الأطياف في وضع ايون ايجابية باستخدام حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، والميثانول 5.0 ٪ ، والمياه 94.9 ٪ (V / V) كحل electrospray ، ألقاه في 5 NL / ثانية من خلال السيليكا غير موصل الشعرية مع طرف الإبرة شحذ (40 معرف ميكرون). التيار الكهربائي المطبق هو 2.5 كيلو فولت. يستخدم المحلل 1.4.2 البرمجيات التطبيقية (النظم البيولوجية) لجمع البيانات مع المعلمات التالية : 2-50 دا ، MCA واسطة ، وبفحص 40 ، 3 ق / المسح الضوئي ، و 2 من الوقت دقيقة التحليل الكلي.

1. نظام زراعة

اختيار السفينة المناسبة لنمو الثقافات الخاص ، والنظر في متطلبات نمو الأنواع في تجربتك (مثل التهوية والضوء والحرارة وغيرها) ، فضلا عن كفاءة في توفير المواد المتطايرة في مطياف الكتلة. الزجاجات الثقافة نختار لاستخدام القياسية 100 مل بيركس زجاجات وسائل الاعلام مزودة القبعات الخيوط التي لديها ما لا يقل عن اثنين من الموانئ luer. يتم إدراج خط مدخل من خلال منفذ واحد للتسليم الغاز luer الناقل للزجاجة العينة ويتم إدخال خط مخرج من خلال منفذ آخر للتسليم المركبات العضوية المتطايرة في الصك (الشكل 1). أي منافذ إضافية موصولة.
قبل زرع العينات ، الضغط على السفن وتغرق في المياه لفحص للكشف عن التسربات. تسرب الغاز هي السبب الرئيسي للنتائج شاذة في شكل إشارات ضعيفة أو غائبة ايون المتقلبة.

2. البيولوجية التجربة : انشاء واعتبارات السلامة

تنمو الثقافات الخاص في الظروف الملائمة لفرضية الخاص. فمن المستحسن أن اثنين على الأقل يعيد البيولوجي ، مع اثنين من كل تقنية متماثلة ، تستخدم لكل متغير.
إعداد فارغة لكل حالة الثقافة (متوسطة ، والمضادات الحيوية وغيرها) واحتضان فارغة تحت نفس الشروط العينات الخاصة بك.
توظيف احتياطات السلامة التي هي مناسبة للعوامل البيولوجية التي تستخدمها ، مع الأخذ بعين الاعتبار مستوى السلامة الحيوية (ق) من الأنواع.
لمنع التلوث من الصك الخاص وخطوط نقل الغاز مع عوامل بيولوجية قابلة للحياة ، تثبيت الفلاتر حجم المسام المناسبة في الخط الناقل للغاز. سوف لا تتداخل مع المرشحات نقل المواد المتطايرة إلى دائرة رد الفعل سيسي ، ولكن قد تؤثر قليلا كفاءة نقل الهباء الجوي. ⁶
استخدام الاحتواء الثانوي أو خزانة للسلامة الأحيائية عندما ربط غطاء زجاجة نقل الغاز الى ثقافتك لضمان احتواء مناسب في حالة تسرب مواد بيولوجية.
بدء وإنهاء الناقل تدفق الغاز الى زجاجة عينتك بطريقة لن تبني الضغط داخل زجاجة.

3. صك التحسين

ملاحظة : تم تصميمه خصيصا سيسي - MS لعينة المتطايرة ، والحد من ذلك استخدام عبق مواد العناية الشخصية (على سبيل المثال ، وكولونيا ، الفم ، والمستحضرات ، المنقي النسيج) والصمغ ، والسجائر ، وما إلى ذلك قبل استخدام الأداة. غطاء محكم جميع المواد الكيميائية المتطايرة في المختبر ، والمراقبة الجوية مسودات أكبر قدر ممكن من خلال الاختبار.

سوف المعلمات التالية مفيدة ، والتي تؤثر على جميع شدة الإشارة والاستقرار ، والحاجة إلى أن يكون الأمثل لجهازك والتجربة.

حل Electrospray ومعدل التدفق : اختيار الحل المناسب لelectrospray فئة من الجزيئات التي ترغب في استهدافها ، مع الأخذ بعين الاعتبار قطبية أداة التشغيل (الوضع إيجابية أو سلبية ايون) وحرف الجزيئي للمركبات الهدف. في هذه التجربة هو الحل electrospray حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، والميثانول 5.0 ٪ ، 94.9 ٪ ماء (V / V) ، والذي يعزز من قوة إشارة الجزيئات القطبية أقل whilه توفير الاستقرار إشارة جيدة. يتم تسليم الحل بمعدل تدفق 5 NL / ثانية.
معدل تدفق الغاز الناقل : إن معدل تدفق الغاز الناقل يمكن أن تؤثر على الاستقرار electrospray وكثافة الإشارة. ويستخدم ثاني أكسيد الكربون ₂ (≥ 99.99 ٪) بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة هنا.
شكل إبر وموقف : شكل إبر وموقف الطرف تؤثر بقوة على كثافة إشارة والاستقرار. عند تثبيت إبرة جديدة ، يجب أن يكون الأمثل للموقف إبرة لخلق توازن بين خلفية منخفضة ، وارتفاع كثافة إشارة الحليلة ، والاستقرار الإشارة. من أجل التكاثر سيسي أطياف بعد تغيير إبرة ، فمن الضروري لجمع أطياف دوريا كما يمكنك ضبط موضع الإبرة حتى تكون قادرة على المباراة الطيف لوحظ أن السجلات الخاصة بك. والمسافة من طرف الإبرة electrospray إلى فوهة تكون المواصفات الشامل 1-5 ملم.
الجهد المطبقة : إن الجهد الذي يتم تطبيقه على نظام يؤثر على كثافة الأيونات إشارة واستقرار المخروط electrospray تايلور. بالإضافة إلى ذلك ، الجهد الأمثل يعتمد على حل electrospray الخاص وشكل غيض الإبرة. في بداية سلسلة من التجارب الخاصة بك ، وتحديد الجهد يمكن أن ينتج الطيف الأمثل والاستقرار إشارة للنظام الخاص بك ، ومن ثم استخدام هذا الجهد لجميع التجارب اللاحقة. لنظامنا ، الفولتية المطبقة من 2،0-5،0 كيلوفولت تقديم الأمثل كثافة إشارة والاستقرار electrospray. عن هذه التجربة ويستخدم 2.5 كيلو فولت.

4. تشغيل وتوليف سيسي - MS للتحليل

تبدأ عن طريق ضمان أن يتم تشغيل التيار الكهربائي وإيقاف العرض الذي تبرأ من نظام الكهرباء. القيام بذلك عن طريق 1) ضمان أضواء المؤشر في امدادات التيار الكهربائي يتم إيقاف ، 2) ضمان الجهد على المتعدد هو صفر ، و 3) ويؤدي التأريض الكهربائي.
تثبيت الحل المناسب لelectrospray تجربتك.
بدوره على الغاز الناقل وضبط تدفق إلى السعر المناسب للتجربتك.
ممارسة الضغط على الخزان electrospray للشروع في إنجاز الحل electrospray إلى دائرة رد الفعل.
بدوره على توفير الجهد وضبط الجهد إلى قيمة مناسبة لإجراء التجارب الخاصة بك.

ملاحظة : عند هذه النقطة السطوح المعدنية من مصدر التأين قادرة على توصيل صدمات خطيرة. ممارسة قدر كبير من الحذر عند العمل حول صك مرة واحدة وقد تم تشغيل التيار الكهربائي عن إمداد.

إنشاء طريقة ضبط لرصد الطيف سيسي - MS حين جعل صقل تعديلات على الجهد تطبيقها. استخدام المعلمات اقتناء أن يكون لديك الأمثل للنظام الخاص بك وتجربتك. مسح اقتناء قناة متعددة (MCA) خانة الاختيار (إن وجد) بحيث ينتج كل مسح الطيف مستقلة ، ضبط الوقت اقتناء إلى 10 -- 15 دقيقة ، والبدء في عملية الاستحواذ. وينبغي الآن أطياف الخلفية الناقل للغاز يمكن ملاحظتها.
جعل صقل تعديلات على تطبيق الجهد للحصول على مجموع مستقرة chromatogram ايون (TIC) ومسح استنساخه التي تطابق CO ₂ بمسح لتجاربك السابقة. بمجرد أن يتم إجراء التعديلات الجهد ، ومواصلة جمع أطياف وTIC ألف لمدة خمس دقائق لضمان استقرار هذا الصك.
بمجرد ضمان استقرار أساسي ، وإعداد الأسلوب المناسب لاقتناء والعينات الخاصة بك وضبط الوقت اقتناء ، ومجموعة البيانات ، واختيار MCA حسب الحاجة. خلفية جمع الغاز الطيف الناقل عن السجلات الخاصة بك.

5. الحصول على بصمات الأصابع المتطايرة من ثقافتك البكتيرية

لجمع طائفة فارغة ، توجيه تدفق الغاز عبر خطوط الناقل الالتفافية ، ونعلق ثم عينة فارغة (الصمامات المغلقة) لخطوط نقل الغاز من الصك.
فتح الصمامات لزجاجة العينة ، وإغلاق الصمامات من الخطوط الالتفافية.
السماح للنظام للتوازن لمدة 30 ثانية ، وخلال الوقت الذي الرطوبة في دائرة رد الفعل هو الاستقرار. هذه الفترة من موازنة أمر ضروري للحصول على الأطياف استنساخه. للتأكد من أن النظام هو المتوازنة ، قد ترغب في مراقبة تيك ، والتي سوف تتغير خلال فترة موازنة ، وتحقيق الاستقرار بعد ذلك.
مرة واحدة في النظام معايرتها ، والشروع في جمع الطيف.
بعد جمع الطيف ، وإزالة زجاجة عينة عن طريق فتح لأول مرة تجاوز خطوط ناقلة الغاز ، ثم إغلاق الصمامات العينة ، وأخيرا إزالة زجاجة العينة. مطاردة النظام مع الغاز الحامل لمدة 2 -- 4 دقائق ، وإزالة الرطوبة والمواد المتطايرة كثف من خطوط النقل ، والوقاية من عينة إلى عينة المرحلة.
كرر الخطوات من 5،2-5،5 لكل عينة جرثومية ، وجمع أطياف متقطع فارغة إضافية لضمان الطرح فارغة شامل. والطرح فارغة ناقصة تؤدي إلىظهور قمم الخلفية الكيميائية في الطيف الخاص المعالجة التي هي مشتركة بين الغلاف الجوي التأين تقنيات الضغط ، (على سبيل المثال ، الفثالات ، السيليكون ، الخ.) ⁹
عند جمع أطياف الخاص ، وضمان أن الإشارات ايون لا تتجاوز حدود الكشف عن وثيقة خطية الخاص ، على النحو الذي يحدده TIC وشدة أقصى الحدود القصوى للفرد. الأيونات يمكن تجاوز حدود العلوي من كشف الصك الخاص توليد قمم القطع الأثرية التي لا ممثل عينتك.

6. ممثل النتائج

كمثال على ذلك يمكن للأطياف سيسي - MS التي يمكن الحصول عليها عن المتطايرة البكتيرية ، ووضع بصمات ايون متقلبة إيجابية لE. القولونية وP. الزنجارية نمت هوائيا في لينوكس - LB لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وتظهر (الشكل 2). وهاء ويهيمن طيف القولونية المتقلبة الإندول في 118 = م / ض ، الذي يعطي E. ثقافات القولونية رائحة مميزة لها ، في حين أن الطيف P. الزنجارية يحتوي على أكبر مجموعة متنوعة من قمم protonatable.

يرجى ملاحظة أن كثافة نسبية من قمم في الطيف متقلبة تعتمد على المعلمات مفيدة وصفها في القسم 3. يجب أن تكون هذه المعلمات لرقابة مشددة من تجربة إلى تجربة من أجل الحصول على أطياف استنساخه.

figure-protocol-11427
الشكل 2 فارغة ، طرح النمط ايون ايجابية سيسي MS - الأطياف (20 -- 150 م / ض). إ. القولونية K12 و P. الزنجارية PAO1 المتطايرة بعد نمو 24 ساعة الهوائية في لينوكس - LB في 37 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول القمم التي لوحظت في أطياف سيسي ، يرجى الرجوع إلى تشو ، وآخرون ^8.

Discussion

بكتيريا تنتج مجموعات مختلفة من المواد المتطايرة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا ^10-12 و تقييم حالة الأيض. الأسلوب سيسي MS - الموصوفة هنا يوفر وسيلة للتميز بسرعة المتطايرة البكتيرية (في دقيقتين أو أقل) من دون أي تحضير العينة ، وتوليد البكتيريا "بصمة" لتحديد الأنواع. ⁽⁸⁾ في العقود القليلة الماضية غيرها من الضغط الجوي التأين وقد طبقت تقنيات MS على توصيف مركبات طيارة ، بما في ذلك انتقائية أنبوب تدفق أيون (نخل) ونقل بروتون رد فعل (PTR) مطياف الكتلة. الميزة المميزة التي سيسي يوفر أكثر من هذه الأساليب التأين الأخرى هو أنه من الممكن أن القمم جزء معين (توفير النوع المناسب من مطياف الكتلة تم تكييفها لسيسي) ، الذي هو أداة مهمة لتحديد هوية المركبة. لم نكن معالجة التجزئة الذروة في البروتوكول المذكورة أعلاه ، ولكن للحصول على أمثلة للكيفية التي يمكن أن تستخدم المعلومات التجزئة في توصيف المواد المتطايرة البكتيرية ، يرجى الرجوع إلى تشو ، وآخرون. ⁸

سيسي - MS والتطبيق المباشر لفي الكشف الموقعي للالتهابات الرئة البكتيرية عن طريق تحليل النفس ، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على أي مكان في العينات التي من الممكن متقلبة. على سبيل المثال ، وتحاليل من المواد المتطايرة في البول والدم ، والتنفس ، والتي هي ذات الصلة لتشخيص الاضطرابات الأيضية ، وتلائم مرض معدي معوي ، والسرطان ، والتعرض لعوامل بيئية ، وسيسي - MS. ^13،14 سيسي كما MS - مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية غير البصمات المركبات العضوية المتطايرة ، بما في ذلك التحليل السريع للأغذية والمواد المتطايرة مميزة المرتبطة النضج ، والشيخوخة ، أو إفساد. ^15-18

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RR021905 P20 - 01 ، CF RPD STANTO07R0 منحة ، وناسا NNH09ZNE002C المنحة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم المادة	نوع	شركة	كتالوج #	تعليق
API - 3000 الثلاثي الرباعي	صك	SCIEX		شراؤها مع محلل 1.4.2 (النظم البيولوجية التطبيقية)
سيسي ايون المصدر	صك			حسب الطلب ، وانظر المرجع 6
تدفق الغاز متر	معدات	كول - Parmer	EW - 03217-74
ثاني أكسيد الكربون	معدات	Airgas	CD I300	≥ 99.99 ٪ نقية
نتروجين	معدات	Airgas	NI UHP300	نقاء عالية جدا
100 مل زجاج القناني وسائل الإعلام	معدات	VWR	89012-114	المواضيع المسمار GL45
قبعات زجاجة مع منافذ luer	معدات	علم الحيوي Fluidics	00945T - 3	غطاء التجمع
Luer ميناء المقابس	معدات	علم الحيوي Fluidics	009LP	غطاء التجمع
أنابيب 1 / 4 "(OD) × 1 / 8" (ID)	معدات	كول - Parmer	EW - 95875-02	غطاء التجميع وخطوط نقل الغاز
أنابيب 1 / 8 "(OD) × 1 / 16" (ID)	معدات	كول - Parmer	EW - 06605-27	غطاء التجمع
اتجاهين الصمامات	معدات	كول - Parmer	07391-04	غطاء التجمع
التصفية ، الصف آق	معدات	مرشحات Balston	9922-05
حمض الفورميك ، LC / MS الصف	الكاشف	الصياد	A117 - 05AMP	Electrospray الحل
الميثانول ، LC / MS الصف	الكاشف	الصياد	A456 - 500	Electrospray الحل
المياه ، LC / MS الصف	الكاشف	الصياد	W6 - 500	Electrospray الحل

References

Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).
Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs. Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).
Tam, M., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection. Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).
Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).
Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. On-line detection of human skin vapors. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).
Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).
Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).
Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).
Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. Pathogen detection using headspace analysis. , Department of the Air Force. 16-16 (2004).
Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study. Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).
Schulz, S., Dickschat, J. S. Bacterial volatiles: The smell of small organisms. Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).
Ligor, T. Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).
Cao, W. Q., Duan, Y. X. Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment. Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).
Law, W. S. Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).
Wu, Z. Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).
Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. Volatile organic compounds in foods: A five year study. J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).
Calkins, C. R., Hodgen, J. M. A fresh look at meat flavor. Meat Sci. 77, 63-80 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: