Характеризуя Бактериальные Летучие использованием вторичного Электроспрей ионизации масс-спектрометрия (СЕСИ-MS)

Резюме

Вторичные электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (СЕСИ-MS) позволяет обнаружения летучих органических соединений (ЛОС), без необходимости каких-либо предварительной обработки образцов. Этот протокол содержит инструкции по быстрому (в течение нескольких минут) характеристика бактериальных ЛОС использованием СЕСИ-МС.

Аннотация

Вторичные электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (СЕСИ-МС) является метод, разработанный для быстрого обнаружения летучих соединений, без необходимости предварительной обработки образцов. Этот метод был впервые описан Фенн и его коллеги ¹ и была применена к обнаружению незаконного оборота наркотиков и взрывчатых веществ ^{2 3-4,} характеристики кожи летучих ⁵ и анализа дыхания ^6-7.

СЕСИ ионизация происходит путем переноса протона реакции между раствором электрораспылением и летучих аналита, и поэтому подходит для анализа гетеро-органические молекулы, как и в традиционных ионизации электрораспылением (ESI). Однако, в отличие от стандартных ESI, процесс переноса протона из СЕСИ происходит в паровой фазе, а не в растворе (рис. 1), и, следовательно, СЕСИ лучше всего подходит для обнаружения органических летучих веществ и аэрозолей.

Мы расширяем использование СЕСИ-MS для выявления бактериальных летучих как метод бактериального идентификация и характеристика ^8. Мы показали, что СЕСИ-МС летучих отпечатков пальцев в сочетании с методом статистического анализа, может быть использован для отличать бактериальных родов, видов и смешанных культур в различных питательных сред. ⁸ Здесь мы предлагаем шаги для получения бактериальной летучих отпечатки пальцев использованием СЕСИ -MS, в том числе инструментальные параметры, которые должны быть оптимизированы, чтобы обеспечить надежную бактериальных идентификация и характеристика.

протокол

Рисунок 1. Схема для СЕСИ-МС анализа бактериальной летучих. Свободном пространстве бактериальной культуры, перемещенных в результате CO ₂ (1) в камеру СЕСИ реакции (2). Как летучие пройти камеры СЕСИ реакции они проходят через облака и электрораспылением ионизируются (3). После ионизируется, летучие тянут в масс-спектрометр для анализа (4). Избыточный газ-носитель и непрореагировавшего бактериальных летучих пропускаются через фильтр 0,22 мкм (5), в качестве дополнительной меры защиты, и выбрасывается в химической капотом. Врезка: игла СЕСИ электрораспылением является кварцевую капиллярную (40 мкм ID) с заостренным кончиком иглы.

В качестве демонстрации использования СЕСИ-МС для характеристики бактериальной летучих веществ, E. палочки K12 и П. палочки PAO1 культивировали аэробно в течение 24 ч в 50 мл LB-Леннокс при 37 ° С и СЕСИ-МС спектры летучих свободном пространстве собраны в 2 минуты. Углекислый газ (99,99%) при расходе 2 л / мин, используется в качестве газа-носителя для доставки летучих в реакционную камеру. Камера СЕСИ реакция была специально построена и установлена ​​на API-3000 (Sciex), заменив первоначальный источник ионов электрораспылением. Спектры собранных в режиме положительного иона с помощью 0,1% муравьиной кислоты, 5,0% метанола и воды 94,9% (об. / об), а электрораспылением решение, сделанное на 5 нл / с через непроводящие кварцевую капиллярную с заостренным кончиком иглы (40 мкм ID). Приложенное напряжение 2,5 кВ. Аналитик 1.4.2 программного обеспечения (Applied Biosystems) используется для сбора данных со следующими параметрами: 20 - 500 Da, MCA режиме, 40 сканирует, 3 с / сканирование, и 2 мин общего времени анализа.

1. Культивирование системы

1. Выберите подходящий сосуд для выращивания вашего культур, с учетом роста потребностей видов в эксперименте (например, аэрация, свет, температура и т. д.), а также эффективную доставку летучих на масс-спектрометре. Культуры бутылки мы решили использовать стандартные 100 мл Pyrex СМИ бутылки снабжены резьбовыми колпачками, которые имеют по крайней мере два Луер портов. Входной линии вводится через один порт Луер для газа-носителя доставки образцов бутылку и выходе линии вводится через другой порт для ЛОС доставки инструмента (рис. 1). Любые дополнительные порты подключены.
2. До культивирования образцов, давление на сосуды и погружаться в воду, чтобы проверить на наличие утечек. Утечки газа главной причиной атипичных результатов в виде слабых или отсутствует летучих сигналов иона.

2. Биологические эксперимент: настройка и соображения безопасности

1. Развивайте свой культур в условиях, соответствующих вашей гипотезы. Рекомендуется, чтобы по крайней мере два биологических реплицируется, каждый с двумя техническими повторяет, используются для каждой переменной.
2. Приготовьте чистый для каждой культуре условия (среда, антибиотики и др.) и инкубировать пустым при тех же условиях, что ваши образцы.
3. Применять меры предосторожности, которые подходят для биологических агентов, который вы используете, принимая во внимание уровень биобезопасности (ы) видов.
4. Для предотвращения порчи вашего инструмента и газа автоматических линий с жизнеспособными биологических агентов, устанавливать фильтры соответствующего размера пор в линию газа-носителя. Фильтры не будет вмешиваться в передачу летучих в камеру реакции СЕСИ, но может незначительно повлиять на эффективность переноса аэрозолей ^6.
5. Использование вторичного сдерживания или шкаф биобезопасности при подключении газовой шапки трансфер в культуре бутылки для обеспечения надлежащего сдерживания в случае разлива биологических агентов.
6. Инициирование и прекратить поток газа-носителя вашему образцу бутылки таким образом, что не будет строить давление внутри бутылки.

3. Инструмент оптимизации

ПРИМЕЧАНИЕ: СЕСИ-МС, специально предназначенные для образца летучих веществ, поэтому ограничить использование ароматных предметы личной гигиены (например, одеколон, жидкость для полоскания рта, лосьоны, кондиционер для белья), жевательная резинка, сигареты и т.д. Прежде чем использовать инструмент. Плотно крышки всех летучих химических веществ в лаборатории, и управления воздушным проектам как можно больше во время тестирования.

Следующие инструментальных параметров, которые влияют интенсивность сигнала и стабильности, должны быть оптимизированы для вашего инструмента и эксперимента.

1. Решение Электроспрей и расход: Выберите подходящее решение для электрораспылением класс молекул, вы хотите цели, с учетом полярности операционных инструмент (положительный или отрицательный ион-режиме) и молекулярного характера целевого соединения. В этом эксперименте электрораспылением решения составляет 0,1% муравьиной кислоты, 5,0% метанола, 94,9% воды (объем / объем), что увеличивает интенсивность сигнала менее полярных молекул whilэлектронной обеспечивая хорошую стабильность сигнала. Решение поставляется с расходом от 5 нл / с
2. Расход газа-носителя: поток газа-носителя ставка может повлиять на стабильность электрораспылением и интенсивность сигнала. CO ₂ (≥ 99,99%) при расходе 2 л / мин используется здесь.
3. Форма иглы и должность: форму кончика иглы и положение сильно влияет на интенсивность сигнала и стабильность. При установке новой иглой, положение иглы должны быть оптимизированы, чтобы создать баланс между низким уровнем фона, высокая интенсивность сигнала аналита и стабильность сигнала. Для того, чтобы воспроизвести СЕСИ спектров после иглы изменения, необходимо периодически собирать спектры, как вы регулируете положение иглы, пока вы не в состоянии соответствовать наблюдаемым спектром в своем архиве. Расстояние от кончика иглы электрораспылением в отверстие массы спецификации будет составлять 1 - 5 мм.
4. Под действием приложенного напряжения: напряжение, которое применяется к системе влияет на интенсивность сигнала ионов и стабильность электрораспылением конуса Тейлора. Кроме того, оптимальное напряжение зависит от вашего решения электрораспылением и форму кончика иглы. В начале вашей серии экспериментов, определить напряжение, которое дает оптимальный спектр и стабильность сигнала в вашей системе, а затем использовать это напряжение для всех последующих экспериментов. Для нашей системы, прикладные напряжением 2,0 - 5,0 кВ обеспечивают оптимальную интенсивность сигнала и электрораспылением стабильности. Для этого эксперимента 2,5 кВ используется.

4. Включение и настройка СЕСИ-MS для анализа

1. Начните, гарантируя, что напряжение питания выключен и что система освобождается от электричества. Для этого 1) обеспечение загорается индикатор напряжения питания не горят, 2) обеспечение напряжение на мультиметр равно нулю, и 3) заземления электрических проводов.
2. Установите соответствующее решение электрораспылением для вашего эксперимента.
3. Включите газ-носитель и установить поток со скоростью подходит для вашего эксперимента.
4. Подайте давление в резервуаре электрораспылением инициировать доставку электрораспылением решение реакционной камере.
5. Включить напряжение питания и регулировать напряжение на соответствующее значение для ваших экспериментов.

ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент металлические поверхности источника ионизации может стать источником опасного шока. Проявлять большую осторожность при работе вокруг инструмента один раз напряжения питания был включен.

6. Настройка настройка метод мониторинга СЕСИ-МС спектра, делая тонкой настройки корректировки приложенного напряжения. Используйте приобретение параметры, которые вы оптимизировали для вашей системы и вашего эксперимента. Очистить несколько канала Acquisition (MCA) флажок (если применимо), так что в каждом цикле производит независимую спектра, установить время обнаружения до 10 - 15 минут, и начать приобретение. Спектр фонового газа перевозчик должен теперь быть соблюдены.
7. Сделать тонкой настройки корректировки приложенного напряжения для получения стабильного общего ионная хроматограмма (TIC) и воспроизводимые сканирования, которые соответствуют CO ₂ сканирует ваши предыдущие эксперименты. Как только напряжение корректировки были сделаны, продолжают собирать спектры и TIC в течение пяти минут, чтобы обеспечить инструмент стабилизируется.
8. Как только инструментальную стабильность обеспечена, созданы приобретение метод подходит для ваших образцов, регулируя время захвата, диапазон данных, и MCA отбор по мере необходимости. Сбор фон газа-носителя спектра для ваших записей.

5. Получение летучих отпечатков пальцев вашей бактериальной культуры

1. Для сбора пустой спектр, прямой поток газа-носителя через обход линий, а затем присоединить пустой образца (клапаны закрыты) для газоперекачивающих линии инструмента.
2. Откройте клапаны на образец бутылки, и закрыть клапан обхода линий.
3. Разрешить системе, чтобы уравновесить в течение 30 секунд, в течение которых влажность воздуха в реакционной камере стабилизируется. Этот период равновесия имеет важное значение для получения воспроизводимых спектров. Чтобы убедиться, что система находится в равновесии, вы можете следить TIC, которая будет меняться в течение периода равновесия и стабилизации в дальнейшем.
4. Когда система находится в равновесии, инициировать спектр коллекции.
5. После спектр собирается, удалить образец бутылки, сначала открыв перевозчика газопроводов обход, то закрытие образца клапанов, и, наконец, удаление образца бутылку. Промыть систему с газа-носителя в течение 2 - 4 мин, удаление влаги и адсорбированных летучих из автоматических линий, предотвращая образца к образцу переноса.
6. Повторите шаги 5.2 - 5.5 для каждого бактериального образца, периодически собирать дополнительные пустые спектры для обеспечения тщательного пустым вычитанием. Неполное пустым вычитанием приведет кПоявление химических фоне пики в спектре обрабатываемых которые являются общими для атмосферных методы ионизации давлением (например, фталаты, силиконы и т.д.) ^9.
7. При сборе вашего спектров, убедитесь, что ионные сигналы не превышает линейные пределы обнаружения вашего инструмента, как это определено ТИЦ и максимальной интенсивности отдельных пиков. Ионы превысив верхний ограничения детектор Ваш инструмент может генерировать артефакт пики, которые не отражают вашего образца.

6. Представитель Результаты

В качестве примера СЕСИ-МС спектров, которые могут быть получены и для бактериальной летучие вещества, положительный ион режим летучих отпечатков пальцев для E. палочки и P. палочки выращивают аэробно в LB-Леннокс в течение 24 ч при 37 ° С, показали (рис. 2). E. кишечной летучих спектра доминирует индол на м / Z = 118, что дает Е. кишечной культур их характерным запахом, в то время как спектр P. палочки содержит большее разнообразие protonatable пиков.

Обратите внимание, что относительные интенсивности пиков в спектре летучих зависят от инструментальных параметрам, описанным в разделе 3. Эти параметры должны быть под жестким контролем от эксперимента к эксперименту с целью получения воспроизводимых спектров.

Рисунок 2 Бланк-вычитается положительный ион режиме СЕСИ-МС спектры (20 - 150 м / г). Е. палочки K12 и П. палочки PAO1 летучих после 24 ч роста в аэробных LB-Леннокс при температуре 37 ° C. Более подробную информацию о пиков, наблюдаемых в спектрах СЕСИ, пожалуйста, обратитесь к Чжу, и соавт. ^8.

Обсуждение

Бактерии производят различные комбинации летучих веществ, которые могут быть использованы для идентификации бактериальной ^10-12 и оценки метаболического статуса. СЕСИ-МС метод, описанный здесь, является средством быстрого характеризующие бактериальных летучих веществ (в две минуты или меньше) без пробоподготовки, генерируя бактериальной "отпечатки пальцев" для идентификации видов. ⁸ В последние несколько десятилетий других атмосферных ионизации давлением MS методы были применены к характеристике летучих соединений, в том числе селективные трубки потока ионов (SIFT) и реакции переноса протона (PTR) масс-спектрометрии. Отличительной преимущество, которое обеспечивает более СЕСИ эти другие методы ионизации в том, что можно фрагмент конкретных пиков (при условии соответствующего типа масс-спектрометра была адаптирована для СЕСИ), которая является важным инструментом для соединения идентификации. Мы не обращались пик фрагментации в протокол, перечисленные выше, но для примера того, как фрагментация информация может быть использована в характеристике бактериальных летучих веществ, пожалуйста, обратитесь к Чжу, и др. ^8.

СЕСИ-МС имеет прямое отношение к на месте обнаружения бактериальных инфекций легких с помощью анализа дыхания, но также может быть применен к любой обстановке, в которой летучие выборки возможно. Например, анализ летучих веществ в моче, крови и дыхания, которые имеют отношение к диагностике нарушений обмена веществ, желудочно-кишечных заболеваний, рака и окружающую среду, хорошо подходят для СЕСИ-МС. ^13,14 СЕСИ-МС также имеет широкий спектр доклинических ЛОС приложений отпечатков пальцев, в том числе экспресс-анализ пищевых продуктов для характерных летучих связаны с созревания, старения или порчи. ^15-18

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Материал Имя	Тип	Компания	Catalogue #	Комментарий
API-3000 Тройной квадрупольный	Инструмент	Sciex		Приобретение за Аналитик 1.4.2 (Applied Biosystems)
СЕСИ ионных источников	Инструмент			Изготовленные на заказ; см. ссылку 6
Метр потока газа	Оборудование	Коул-Пармер	EW-03217-74
Углекислый газ	Оборудование	Airgas	CD-I300	≥ 99,99%
Азот	Оборудование	Airgas	Н. И. UHP300	Ультра высокая чистота
100 мл стеклянной бутылки СМИ	Оборудование	VWR	89012-114	GL45 резьбой
Пробки для бутылок с Luer портов	Оборудование	Bio Chem Fluidics	00945T-3	Cap сборки
Луер порт пробки	Оборудование	Bio Chem Fluidics	009LP	Cap сборки
Трубы 1 / 4 "(ОД) х 1 / 8" (ID)	Оборудование	Коул-Пармер	EW-95875-02	Cap сборки и линий передачи газа
Трубы 1 / 8 "(ОД) х 1 / 16" (ID)	Оборудование	Коул-Пармер	EW-06605-27	Cap сборки
Два-ходовые клапаны	Оборудование	Коул-Пармер	07391-04	Cap сборки
Фильтр класса AAQ	Оборудование	Балстон Фильтры	9922-05
Муравьиная кислота, LC / MS класса	Реагент	Рыболов	A117-05AMP	Электроспрей решение
Метанол, LC / MS класса	Реагент	Рыболов	A456-500	Электроспрей решение
Вода, LC / MS класса	Реагент	Рыболов	W6-500	Электроспрей решение