La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

Resumen

Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) permite la detección de compuestos orgánicos volátiles (COV), sin necesidad de ningún tratamiento previo de la muestra. Este protocolo proporciona instrucciones para la rápida (en minutos) caracterización de compuestos orgánicos volátiles bacteriana con el SESI-MS.

Resumen

Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) es un método desarrollado para la rápida detección de compuestos volátiles, sin necesidad de pretratamiento de la muestra. El método fue descrito por primera vez por Fenn y colegas ¹ y se ha aplicado a la detección de drogas ilícitas ² y explosivos ^3.4, la caracterización de los ^cinco compuestos volátiles de piel, y el análisis de aliento ^6-7.

Ionización SESI se produce por las reacciones de transferencia de protones entre la solución de electrospray y la sustancia volátil, y por tanto es adecuado para el análisis de los hetero-moléculas orgánicas, así como en la ionización por electrospray tradicionales (ESI). Sin embargo, a diferencia de ESI estándar, el proceso de transferencia de protones del SESI se produce en la fase de vapor en lugar de en la solución (Fig. 1), y por lo tanto, el SESI es el más adecuado para la detección de compuestos volátiles orgánicos y aerosoles.

Estamos ampliando el uso de SESI-MS para la detección de compuestos volátiles de bacterias como un método para la identificación y caracterización bacteriana ^8. Hemos demostrado que el SESI-MS huellas volátiles, combinado con un método de análisis estadístico, se puede utilizar para diferenciar los géneros de bacterias, especies y cultivos mixtos en una variedad de medios de cultivo. ⁸ A continuación presentamos los pasos para la obtención de huellas digitales si se usan bacterias SESI -MS, incluyendo los parámetros instrumentales que deben ser optimizados para asegurar la identificación y caracterización bacteriana resistente.

Protocolo

Figura 1. Esquema de SESI-MS análisis de compuestos volátiles de bacterias. El espacio libre del cultivo bacteriano es desplazado por el CO ₂ (1) en la cámara de reacción del SESI (2). Como los compuestos volátiles atravesar la cámara de reacción SESI pasan a través de la nube de electrospray y se ionizan (3). Una vez ionizados, los volátiles son introducidos en el espectrómetro de masas para el análisis (4). El exceso de gas portador y que no ha reaccionado volátiles bacterias se transmiten a través de un filtro de 0,22 micras (5), como una medida adicional de protección y ventilación a una campana química. Recuadro: La aguja electrospray SESI es un capilar de sílice (40 micras ID) con una punta de aguja afilada.

Como una demostración de la utilización de SESI-MS para la caracterización de compuestos volátiles de bacterias, E. coli K12 y P. PAO1 aeruginosa son cultivadas aeróbicamente durante 24 horas en 50 ml de LB-Lennox a 37 ° C y los espectros de SESI-MS de los volátiles del espacio de cabeza se recogen en 2 minutos. El dióxido de carbono (99,99%) con un caudal de 2 l / min se usa como gas de transporte para la entrega de volátiles a la cámara de reacción. La cámara de reacción SESI fue construida y equipada a un API-3000 (Sciex), en sustitución de la fuente de electrospray ión original. Los espectros se recogen en el modo de iones positivos con 0,1% de ácido fórmico, el 5,0% de metanol, y el 94,9% de agua (v / v) como la solución electrospray, entregado en 5 nl / s a ​​través de un contenido de sílice no conductora capilar con una punta de aguja afilada (40 micras ID). El voltaje aplicado es de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) se utiliza para la recolección de datos con los siguientes parámetros: 20 - 500 Da, MCA modo, 40 escáneres, 3 s / escaneo, y 2 min de tiempo total de análisis.

1. Sistema de cultivo

1. Elegir el recipiente adecuado para el crecimiento de sus cultivos, teniendo en cuenta las necesidades de crecimiento de la especie en el experimento (por ejemplo, la aireación, luz, temperatura, etc), así como la prestación eficiente de los volátiles que el espectrómetro de masas. Los frascos de cultivo que optar por utilizar son estándar de 100 ml Pyrex botellas de los medios de comunicación equipados con tapas de rosca que tienen al menos dos puertos luer. Una línea de entrada se inserta a través de un puerto luer para la entrega de gas portador de la botella de muestra y una línea de salida se inserta a través de otro puerto para la entrega de VOC en el instrumento (Figura 1). Cualquiera de los puertos adicionales están conectados.
2. Antes de que el cultivo de las muestras, presionar a los vasos y se sumergen en el agua para detectar fugas. Las fugas de gas son la principal causa de los resultados atípicos en forma de señales de iones débil o ausente volátiles.

2. Biológica experimento: puesta a punto y de seguridad consideraciones

1. El crecimiento de su cultura en las condiciones adecuadas para su hipótesis. Se recomienda que al menos dos réplicas biológicas, cada uno con dos repeticiones técnica, se utilizan para cada variable.
2. Preparar un blanco de todas las condiciones de cultivo (medio, antibióticos, etc) e incubar el espacio en blanco en las mismas condiciones que sus muestras.
3. Emplear las medidas de seguridad que son apropiados para los agentes biológicos que está utilizando, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad (s) de la especie.
4. Para evitar la contaminación de su instrumento y las líneas de transferencia de gas con agentes biológicos viables, instalar filtros de tamaño de poro adecuado en la línea de gas portador. Los filtros no interfieren con la transferencia de compuestos volátiles de la cámara de reacción del SESI, pero poco puede afectar la eficiencia de la transferencia de aerosol. ⁶
5. Utilícese un envase secundario o un gabinete de bioseguridad cuando se conecta la tapa de transferencia de gas a su botella de la cultura de asegurar la contención adecuada en el caso de derrame de agentes biológicos.
6. Iniciar y terminar el flujo de gas portador a su botella de muestra de una manera que no va a construir la presión dentro de la botella.

3. Instrumento de optimización

NOTA: SESI-MS está diseñado específicamente para los volátiles de la muestra, por lo que limitar el uso de fragantes artículos de cuidado personal (por ejemplo, colonias, enjuagues bucales, lociones, suavizante de telas), goma de mascar, cigarrillos, etc antes de usar el instrumento. Bien colmo productos químicos volátiles en el laboratorio y de control de los borradores tanto como sea posible durante la prueba.

Los siguientes parámetros instrumentales, que afectan a la intensidad de la señal y la estabilidad, tendrá que ser optimizado para su instrumento y la experimentación.

1. Solución de electrospray y el caudal: Elegir la solución electrospray apropiado para la clase de moléculas que desea dirigirse, teniendo en cuenta la polaridad instrumento operativo (modo positivo o negativo de iones) y el carácter molecular de los compuestos de interés. En este experimento la solución electrospray es del 0,1% ácido fórmico, el 5,0% de metanol, el 94,9% de agua (v / v), lo que aumenta la intensidad de la señal de menos moléculas polares noce dar estabilidad buena señal. La solución se entrega con un caudal de 5 nL / s.
2. Velocidad del gas portador: El caudal del gas portador puede afectar la estabilidad de electrospray y la intensidad de la señal. CO ₂ (≥ 99,99%) con un caudal de 2 l / min se utiliza aquí.
3. Forma de aguja y posición: La forma de punta de la aguja y la posición afectan en gran medida la intensidad de la señal y la estabilidad. Al instalar una nueva aguja, la posición de la aguja debe ser optimizado para crear un equilibrio entre el fondo de baja y alta intensidad de la señal del analito, y la estabilidad de la señal. Con el fin de reproducir los espectros SESI después de un cambio de agujas, es necesario recoger periódicamente los espectros a medida que ajusta la posición de la aguja hasta que pueda para que coincida con el espectro observado a sus registros. La distancia desde la punta de la aguja a la masa electrospray orificio de especificaciones será de 1 - 5 mm.
4. Tensión aplicada: La tensión que se aplica en el sistema afecta a la intensidad de la señal de iones y la estabilidad del cono electrospray Taylor. Además, el voltaje óptimo depende de la solución de electrospray y la forma de punta de la aguja. Al inicio de su serie de experimentos, determine la tensión que produce el espectro óptimo y estabilidad de la señal para el sistema, y ​​luego utilizar esta tensión para todos los experimentos posteriores. Para nuestro sistema, voltajes aplicados de 2,0 a 5,0 kV proporcionar una intensidad de señal óptima y la estabilidad de electrospray. Para este experimento se utiliza 2,5 kV.

4. Encendido y puesta a punto del SESI-MS para el análisis

1. Comenzar por asegurar que la tensión de alimentación está apagado y que el sistema está cargado de electricidad. Para ello, 1) asegurar que las luces indicadoras de la tensión de alimentación están apagados, 2) asegurar la tensión en el multímetro es cero, y 3) a tierra los cables eléctricos.
2. Instalar la solución de electrospray apropiado para su experimento.
3. Encienda el gas portador y establecer el flujo a la velocidad adecuada para su experimento.
4. Aplicar presión en el depósito de electrospray para iniciar la entrega de la solución de electrospray a la cámara de reacción.
5. Abra el suministro de tensión y ajustar el voltaje a un valor apropiado para sus experimentos.

NOTA: En este punto, las superficies metálicas de la fuente de ionización son capaces de entregar un choque peligroso. Tener mucho cuidado cuando se trabaja alrededor del instrumento una vez que la tensión de alimentación se ha activado.

6. Configuración de un método de ajuste para el monitoreo del espectro SESI-MS al tiempo que afinar los ajustes de la tensión aplicada. Use los parámetros de adquisición que se ha optimizado para su sistema y su experimento. Autorizar la adquisición de canales múltiples (MCA) casilla (si corresponde) a fin de que cada ciclo produce un espectro independiente, establecer el tiempo de adquisición de 10 - 15 min, y comenzar la adquisición. Espectros de los antecedentes del gas portador ahora deben ser observados.
7. Hacer ajustes ajustado a la tensión aplicada para obtener un cromatograma total de iones estables (TIC) y las exploraciones reproducible que coinciden con el CO ₂ analiza en busca de sus experimentos anteriores. Una vez que los ajustes de voltaje se han hecho, continuar recogiendo los espectros y un TIC durante cinco minutos para asegurar que el instrumento se estabilice.
8. Una vez que se garantiza la estabilidad fundamental, establecer el método de adquisición según sea apropiado para sus muestras, ajustar el tiempo de adquisición, el rango de datos, y la selección de MCA, según sea necesario. Recoger el gas portador del espectro de fondo para sus registros.

5. La obtención de una huella digital volátil de su cultivo bacteriano

1. Para recoger un espectro blanco, dirigir el flujo de gas portador a través de las líneas de derivación, y luego coloque la muestra en blanco (válvulas cerradas) a las líneas de transferencia de gas del instrumento.
2. Abrir las válvulas de la botella de muestra, y cerrar las válvulas de las líneas de derivación.
3. Deje que el sistema se equilibre durante 30 segundos, tiempo durante el cual la humedad en la cámara de reacción se está estabilizando. Este período de equilibrio es esencial para obtener espectros reproducibles. Para asegurar que el sistema está equilibrado, es posible que desee monitorear las TIC, que va a cambiar durante el período de equilibrio, y estabilizar a partir de entonces.
4. Una vez que el sistema está equilibrado, iniciar la recogida de espectro.
5. Después de que el espectro se recoge, retire la botella de muestra, en primer lugar la apertura de las líneas de gas portador de bypass, luego cerrar las válvulas de la muestra, y por último la eliminación de la botella de muestra. Lave el sistema con el gas portador de 2 a 4 min, la eliminación de la humedad y volátiles adsorbidos en las líneas de transferencia, la prevención de la muestra de la muestra de arrastre.
6. Repita los pasos 5,2 a 5,5 por cada muestra de bacterias, de forma intermitente recogida de espectros en blanco adicionales para asegurar una buena blanco resta. Incompleta en blanco resta dará lugar a laaparición de picos de fondo químico en el espectro de procesados ​​que son comunes a técnicas de presión atmosférica de ionización (por ejemplo, los ftalatos, siliconas, etc.) ⁹
7. Al recoger su espectro, asegúrese de que las señales de iones no son superiores a los límites de detección lineal de su instrumento, según lo determinado por las TIC y la máxima intensidad de los diferentes picos. Iones rebasen los límites superiores del detector de su instrumento puede generar picos de artefactos que no son representativos de la muestra.

6. Resultados representante

Como ejemplo de los espectros de SESI-MS que se pueden obtener de los volátiles de bacterias, las huellas dactilares de iones positivos modo volátil para E. coli y P. aeruginosa crecido en condiciones aeróbicas LB-Lennox durante 24 horas a 37 ° C se muestran (Fig. 2). La E. espectro coli volátiles está dominado por indol en m / z = 118, que ofrece E. culturas coli su olor característico, mientras que el espectro de la P. aeruginosa contiene una mayor variedad de picos protonatable.

Tenga en cuenta que las intensidades relativas de los picos en el espectro de volatilidad dependen de los parámetros instrumentales se describe en la Sección 3. Estos parámetros deben ser estrictamente controlados de experimento en experimento con el fin de obtener espectros reproducibles.

Figura 2 en blanco sustracción de iones positivos modo SESI-MS espectros (20 - 150 m / z). De E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1 volátiles después de 24 h de crecimiento aeróbico en LB-Lennox a 37 ° C. Para más detalles sobre los picos observados en el espectro de SESI, por favor refiérase a Zhu, et al. ^8.

Discusión

Las bacterias producen diferentes combinaciones de sustancias volátiles, que pueden ser utilizados para la identificación bacteriana ^10-12 y la evaluación del estado metabólico. El método de SESI-MS descrito aquí proporciona un medio rápido de caracterización de compuestos volátiles de bacterias (en dos minutos o menos) sin ningún tipo de preparación de la muestra, lo que genera una infección bacteriana "huella digital" para la identificación de la especie. ⁸ En las últimas décadas ionización otros la presión atmosférica técnicas de MS se han aplicado a la caracterización de los compuestos volátiles, incluyendo el tubo de flujo de iones selectivos (SIFT) y la reacción de transferencia de protones (PTR) de espectrometría de masas. La ventaja diferencial que ofrece SESI sobre estos métodos de ionización es que esto es posible a los picos fragmento específico (siempre que el tipo apropiado de espectrómetro de masas se ha adaptado para SESI), que es una herramienta importante para la identificación de compuestos. No se refirió a la fragmentación de pico en el protocolo mencionado anteriormente, pero hay ejemplos de cómo la información de fragmentación se puede utilizar en la caracterización de los compuestos volátiles de bacterias, por favor refiérase a Zhu, et al ^8.

SESI-MS tiene aplicación directa en la detección in situ de las infecciones pulmonares bacterianas mediante análisis de aliento, pero también puede aplicarse a cualquier entorno en el que muestra volátil es posible. Por ejemplo, el análisis de compuestos volátiles en la orina, la sangre y la respiración, que son relevantes para el diagnóstico de trastornos metabólicos, enfermedades gastrointestinales, cáncer, y la exposición del medio ambiente, se adapta bien a SESI-MS. ^13,14 SESI-MS también ha una amplia gama de aplicaciones no clínicas huellas de COV, incluyendo un análisis rápido de los alimentos para los volátiles característicos asociados con la maduración, envejecimiento, o echar a perder ^15-18.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del Material	Tipo	Empresa	Catálogo #	Comentario
API-3000 triple cuadrupolo	Instrumento	Sciex		Adquiridos con el analista 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI fuente de iones	Instrumento			Hechos a medida; véase la referencia 6
Medidor de flujo de gas	Equipo	Cole-Parmer	EW-03217-74
Dióxido de carbono	Equipo	Airgas	CD I300	≥ 99,99% de pureza
Nitrógeno	Equipo	Airgas	NI UHP300	Pureza ultra alta
100 ml de vidrio de los medios de botellas	Equipo	VWR	89012-114	GL45 roscas
Tapas de las botellas con los puertos luer	Equipo	Bio Chem Fluidics	00945T-3	Cap de montaje
Luer del puerto se conecta	Equipo	Bio Chem Fluidics	009LP	Cap de montaje
Tubería de 1 / 4 "(OD) x 8.1" (ID)	Equipo	Cole-Parmer	EW-95875-02	Cap montaje y líneas de transferencia de gas
Tubería de 1 / 8 "(OD) x 1 / 16" (ID)	Equipo	Cole-Parmer	EW-06605-27	Cap de montaje
Válvulas de dos vías	Equipo	Cole-Parmer	07391-04	Cap de montaje
Filtro, Grado AAQ	Equipo	Balston Filtros	9922-05
Ácido fórmico, LC / MS de grado	Reactivo	Pescador	A117-05AMP	Electrospray solución
Metanol, LC / MS de grado	Reactivo	Pescador	A456-500	Electrospray solución
Agua, LC / MS de grado	Reactivo	Pescador	W6-500	Electrospray solución