Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l'aide d'ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

Résumé

Secondaire ionisation par électronébulisation spectrométrie de masse (SESI-MS) permet la détection de composés organiques volatils (COV) sans avoir besoin d'aucune préparation d'échantillons. Ce protocole fournit des instructions pour le rapide (quelques minutes) la caractérisation des COV bactériennes utilisant le SESI-MS.

Résumé

Secondaire ionisation par électronébulisation spectrométrie de masse (SESI-MS) est une méthode développée pour la détection rapide de composés volatils, sans la nécessité pour le prétraitement de l'échantillon. La méthode a été décrite par Fenn et ses collègues ¹ et a été appliquée à la détection de drogues illicites et d'explosifs ^{2 3-4,} la caractérisation de ^cinq volatiles peau, et l'analyse de souffle ^6-7.

Ionisation SESI produit par des réactions de transfert de protons entre la solution d'électronébulisation et de l'analyte volatiles, et est donc adapté à l'analyse de l'hétéro-molécules organiques, comme dans d'ionisation électrospray traditionnelle (ESI). Cependant, contrairement à ESI standard, le processus de transfert de protons du SESI survient dans la phase vapeur plutôt que dans la solution (Fig. 1), et donc le SESI est le mieux adapté pour la détection de substances organiques volatiles et les aérosols.

Nous élargissons l'utilisation de la SESI-MS pour la détection de substances volatiles bactériennes comme une méthode pour l'identification bactérienne et la caractérisation ^8. Nous avons démontré que le SESI-MS empreintes volatiles, combiné avec une méthode d'analyse statistique, peut être utilisé pour différencier les genres bactériens, des espèces et des cultures mixtes dans une variété de milieux de croissance. ⁸ Ici, nous fournir les étapes pour l'obtention d'empreintes digitales bactérienne volatiles en utilisant le SESI -MS, y compris les paramètres instrumentaux qui devrait être optimisé pour assurer robustes identification bactérienne et de caractérisation.

Protocole

Figure 1. Schéma de SESI-MS analyse des composés volatils bactérienne. L'espace libre de la culture bactérienne est déplacé par CO ₂ (1) dans la chambre de réaction SESI (2). Comme les volatiles traversent la chambre de réaction SESI ils passent à travers le nuage électronébulisation et devenir ionisé (3). Une fois ionisé, les volatiles sont tiré dans le spectromètre de masse pour l'analyse (4). L'excès de gaz porteur et n'ayant pas réagi volatiles bactériennes sont transmises à travers un 0,22 um (5) du filtre, comme une mesure supplémentaire de protection, et ventilé à une hotte chimique. Encart: L'aiguille d'électronébulisation SESI est un capillaire de silice (40 um ID) avec une pointe d'aiguille aiguisée.

Comme une démonstration de l'utilisation du SESI-MS pour la caractérisation des composés volatils bactériennes, E. coli K12 et P. PAO1 aeruginosa sont cultivées en aérobiose pendant 24 h dans 50 ml LB-Lennox à 37 ° C et les spectres SESI-MS des composés volatils headspace sont collectées en 2 minutes. Le dioxyde de carbone (99,99%) à un débit de 2 L / min est utilisé comme gaz transporteur pour livraison volatiles pour la chambre de réaction. La chambre de réaction SESI a été construite et équipée d'une API-3000 (SCIEX), en remplacement de la source originale électronébulisation d'ions. Les spectres sont collectés dans le mode d'ions positifs en utilisant 0,1% d'acide formique, méthanol 5,0%, et 94,9% d'eau (v / v) comme la solution d'électronébulisation, livré à 5 Nl / s grâce à une silice non-conducteur capillaire avec une aiguille aiguisée (40 um ID). La tension appliquée est de 2,5 kV. Analyste 1.4.2 du logiciel (Applied Biosystems) est utilisé pour la collecte de données avec les paramètres suivants: 20 - 500 Da, MCA mode, 40 scans, 3 s / scan, et 2 min de temps d'analyse total.

1. Système de culture

1. Choisissez le navire approprié pour la croissance de votre culture, compte tenu des exigences de croissance de l'espèce dans votre expérience (par exemple, l'aération, de lumière, température, etc), ainsi que la prestation efficace des substances volatiles au spectromètre de masse. Les flacons de culture nous choisissons d'utiliser en standard de 100 ml en pyrex bouteilles des médias munis d'un bouchon fileté qui ont au moins deux ports Luer. Une ligne d'entrée est insérée dans un port Luer pour la livraison de gaz porteur jusqu'à la bouteille d'échantillonnage et d'une ligne de sortie est inséré par un autre port pour la livraison de COV dans l'instrument (Figure 1). Toute ports supplémentaires sont branchés.
2. Avant de cultiver les échantillons, pressuriser les vaisseaux et les plonger dans de l'eau pour vérifier les fuites. Les fuites de gaz sont la principale cause de résultats atypiques en forme de faiblesse ou l'absence de signaux d'ions volatil.

2. Expérimentation biologique: set-up et des considérations de sécurité

1. Faites pousser vos cultures dans les conditions appropriées à votre hypothèse. Il est recommandé qu'au moins deux biologiques répliques, chacune avec deux techniques répliques, sont utilisés pour chaque variable.
2. Préparer un blanc pour chaque condition de culture (milieu, antibiotiques, etc) et incuber le vide sous les mêmes conditions que vos échantillons.
3. Employer les précautions de sécurité qui sont appropriées pour les agents biologiques que vous utilisez, en tenant compte du niveau de biosécurité (s) de l'espèce.
4. Pour éviter la contamination de votre instrument et les lignes de transfert de gaz avec des agents biologiques viables, installer des filtres de la taille des pores dans la ligne appropriée de gaz porteur. Les filtres ne pas interférer avec le transfert de substances volatiles à la chambre de réaction SESI, mais peut légèrement l'impact de l'efficacité du transfert de aérosol. ⁶
5. Utiliser un confinement secondaire ou une enceinte de biosécurité lors de la fixation du bouchon de transfert du gaz à votre flacon de culture pour assurer le confinement adéquat dans le cas de déversement d'agents biologiques.
6. Initier et mettre fin à des flux de gaz porteur jusqu'à votre bouteille d'échantillon d'une manière qui ne sera pas augmenter la pression dans la bouteille.

3. L'optimisation des instruments

REMARQUE: SESI-MS est spécifiquement conçu pour volatils de l'échantillon, afin de limiter l'utilisation des articles de soins personnels parfumés (par exemple, eau de Cologne, rince-bouche, les lotions, assouplissant), gomme, cigarettes, etc avant d'utiliser l'instrument. Étroitement bouchon tous les produits chimiques volatiles dans le laboratoire, et l'air de contrôle rédige autant que possible pendant les tests.

Les paramètres suivants instrumentale, qui affectent tous intensité du signal et de la stabilité, aura besoin d'être optimisé pour votre instrument et d'expérimenter.

1. Solution électronébulisation et de débit: Choisir la solution d'électronébulisation appropriée pour la classe de molécules que vous souhaitez cibler, en tenant compte de la polarité instrument de fonctionnement (mode positif ou négatif-ion) et le caractère moléculaire des composés cibles. Dans cette expérience, la solution d'électronébulisation est de 0,1% d'acide formique, méthanol 5,0%, 94,9% d'eau (v / v), ce qui améliore l'intensité du signal des molécules moins polaires while assurer la stabilité du signal est bonne. La solution est livrée à un débit de 5 nL / s.
2. Débit gaz vecteur: Le débit de gaz porteur peut affecter la stabilité électrospray et l'intensité du signal. CO ₂ (≥ 99,99%) à un débit de 2 L / min est utilisée ici.
3. La forme et la position de l'aiguille: La forme et la position de pointe de l'aiguille affectent fortement l'intensité du signal et la stabilité. Lorsque vous installez une nouvelle aiguille, la position de l'aiguille doit être optimisée afin de créer un équilibre entre le fond bas, haut intensité du signal d'analyte et la stabilité du signal. Afin de reproduire les spectres SESI après un changement d'aiguille, il est nécessaire de recueillir périodiquement des spectres que vous ajuster la position de l'aiguille jusqu'à ce que vous êtes en mesure d'égaler le spectre observé à vos dossiers. La distance de la pointe d'aiguille à spectrométrie de masse electrospray orifice sera de 1 - 5 mm.
4. Tension appliquée: La tension qui est appliquée au système affecte l'intensité du signal d'ions et de la stabilité du cône electrospray Taylor. En outre, la tension optimale dépend de votre solution d'électronébulisation et la forme pointe de l'aiguille. Au début de votre série d'expériences, de déterminer la tension qui donne le spectre du signal et une stabilité optimales pour votre système, et ensuite utiliser cette tension pour toutes les expériences ultérieures. Pour notre système, les tensions appliquées de 2,0 - 5,0 kV de fournir une intensité de signal optimale et la stabilité électrospray. Pour cette expérimentation 2,5 kV est utilisé.

4. Activation et réglage du SESI-MS pour l'analyse

1. Commencez par vous assurer que la tension d'alimentation est éteint et que le système est déchargé de l'électricité. Pour ce faire, 1) assurer le voyant sur la tension d'alimentation sont hors service, 2) assurer la tension sur le multimètre est nul, et 3) mise à la terre les fils électriques.
2. Installez la solution appropriée électronébulisation pour votre expérience.
3. Allumez le gaz porteur et de régler le débit à la vitesse appropriée pour votre expérience.
4. Appliquer une pression vers le réservoir électronébulisation pour initier la livraison de la solution d'électronébulisation à la chambre de réaction.
5. Tournez sur la tension d'alimentation et d'ajuster la tension à une valeur appropriée pour vos expériences.

REMARQUE: À ce point les surfaces métalliques de la source d'ionisation sont capables de délivrer un choc dangereux. Une grande prudence lorsque l'on travaille autour de l'instrument une fois la tension d'alimentation a été activée.

6. Mettre en place une méthode de réglage pour la surveillance du spectre SESI-MS tout en faisant affiné ajustements à la tension appliquée. Utiliser les paramètres d'acquisition que vous avez optimisé pour votre système et votre expérience. Effacer l'acquisition multiple canaux case à cocher (MCA) (le cas échéant) afin que chaque scan produit un spectre indépendante, réglez le temps d'acquisition à 10 - 15 min, et lancer l'acquisition. Spectres de l'arrière-plan de gaz porteur devrait maintenant être observées.
7. Faire affiné ajustements à la tension appliquée pour obtenir un chromatogramme d'ions stables total (CIT) et scans reproductibles qui correspondent le CO ₂ scans pour vos expériences précédentes. Une fois les réglages de tension ont été faites, continuer à recueillir des spectres et TIC pendant cinq minutes pour s'assurer que l'instrument est stabilisé.
8. Une fois la stabilité instrumentale est assurée, mis en place la méthode d'acquisition en fonction de vos échantillons, en ajustant le temps d'acquisition, plage de données, et la sélection du MCA, au besoin. Recueillir un spectre de fond du gaz porteur pour vos dossiers.

5. Obtention d'une empreinte digitale volatiles de votre culture bactérienne

1. Pour collecter un spectre blanc, de diriger le flux de gaz porteur à travers les lignes de dérivation, puis attacher l'échantillon blanc (vannes fermées) pour les lignes de transfert de gaz de l'instrument.
2. Ouvrir les vannes de la bouteille d'échantillon, et fermer les vannes des lignes de dérivation.
3. Laisser le système s'équilibrer pendant 30 secondes, période pendant laquelle l'humidité dans la chambre de réaction se stabilise. Cette période d'équilibrage est essentiel pour obtenir des spectres reproductibles. Pour s'assurer que le système est équilibré, vous pouvez surveiller les TIC, ce qui va changer au cours de la période d'équilibration, et de stabiliser par la suite.
4. Une fois que le système est équilibré, amorcer la collecte de spectre.
5. Après le spectre est recueilli, retirer la bouteille en ouvrant d'abord les lignes transporteur de gaz de dérivation, puis la fermeture des vannes de l'échantillon, et enfin enlever la bouteille d'échantillonnage. Rincez le système avec le gaz porteur pour 2 - 4 min, retirer l'humidité et les volatiles adsorbées à partir des lignes de transfert, la prévention de l'échantillon à l'échantillon de report.
6. Répétez les étapes 5.2 à 5.5 pour chaque échantillon bactérien, par intermittence collecte supplémentaires spectres vide pour assurer approfondie vierge soustraction. Incomplet vierge soustraction mènera à laapparition de pics de fond chimiques dans votre spectre traité qui sont communes à l'atmosphère des techniques d'ionisation à pression (par exemple, les phtalates, les silicones, etc.) ⁹
7. Lorsque la collecte de vos spectres, s'assurer que les signaux d'ions ne dépassent pas les limites de détection linéaire de votre instrument, tel que déterminé par les TIC et l'intensité maximale des pics individuels. Ions dépasser les limites supérieures de détecteur de votre instrument peut générer des pics artefact qui ne sont pas représentatifs de votre échantillon.

6. Les résultats représentatifs

Comme un exemple des spectres SESI-MS qui peut être obtenue pour volatiles bactérienne, les empreintes positives mode ion volatiles pour E. coli et P. aeruginosa culture aérobie dans LB-Lennox de 24 h à 37 ° C sont représentées (fig. 2). Le E. spectre coli volatile est dominée par l'indole à m / z = 118, ce qui donne E. coli cultures de leur odeur caractéristique, tandis que le spectre de P. aeruginosa contient une grande variété de pics protonable.

S'il vous plaît noter que les intensités relatives des pics dans le spectre volatiles sont dépendantes des paramètres instrumentaux décrits dans la section 3. Ces paramètres doivent être étroitement contrôlé d'une expérience à afin d'obtenir des spectres reproductibles.

Figure 2-vierge soustraite des ions positifs en mode SESI-spectres SM (20 - 150 m / z). De E. coli K12 et P. aeruginosa PAO1 volatils après 24 h de croissance aérobie dans LB-Lennox à 37 ° C. Pour plus de détails sur les pics observés dans les spectres du SESI, s'il vous plaît se référer à Zhu, et al. ^8.

Discussion

Les bactéries produisent différentes combinaisons de substances volatiles, qui peuvent être utilisés pour l'identification bactérienne ^10-12 et l'évaluation de l'état métabolique. La méthode SESI-MS décrit ici fournit un moyen de caractériser rapidement volatiles bactérienne (en deux minutes ou moins), sans aucune préparation d'échantillon, générant un bactériennes «empreinte digitale» pour l'identification de l'espèce. ⁸ Dans les dernières décennies ionisation d'autres la pression atmosphérique techniques de SM ont été appliquées à la caractérisation de composés volatils, y compris les tubes de flux d'ions sélectifs (FIPD) et la réaction de transfert de protons (PTR) spectrométrie de masse. L'avantage distinctif qui SESI fournit plus de ces méthodes d'ionisation d'autres, c'est qu'il est possible de pics de fragments spécifiques (à condition que le type approprié de spectromètre de masse a été adapté pour le SESI), qui est un outil important pour l'identification composé. Nous n'avons pas abordé la fragmentation de pointe dans le protocole ci-dessus, mais pour des exemples de la façon dont les informations de fragmentation peut être utilisé dans la caractérisation des composés volatils bactériennes, s'il vous plaît se référer à Zhu, et al. ⁸

SESI-MS a une application directe de la détection in situ des infections pulmonaires bactériennes via l'analyse d'haleine, mais peut aussi être appliqué à n'importe quel décor dans lequel l'échantillonnage volatile est possible. Par exemple, les analyses de composés volatils dans l'urine, le sang et le souffle, qui sont pertinents pour le diagnostic des troubles métaboliques, les maladies gastro-intestinales, le cancer et l'exposition environnementale, sont bien adaptés pour le SESI-MS. ^13,14 SESI-MS a également un large éventail de non-applications cliniques empreintes de COV, y compris l'analyse rapide des aliments pour les volatiles caractéristique associée à la maturation, le vieillissement, ou gâter. ^15-18

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du produit	Tapez	Société	Catalogue #	Commentaire
API-3000 triple quadripôle	Instrument	SCIEX		Acheté avec analyste 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI Ion Source	Instrument			Sur mesure; Voir référence 6
Débitmètre gaz	Équipement	Cole-Parmer	EW-03217-74
Le dioxyde de carbone	Équipement	Airgas	CD I300	≥ pur à 99,99%
D'azote	Équipement	Airgas	NI UHP300	Ultra haute pureté
100 ml bouteilles en verre des médias	Équipement	VWR	89012-114	GL45 filetage
Capsules de bouteilles avec des ports Luer	Équipement	Bio Chem Fluidique	00945T-3	Cap Assemblée
Luer le port fiches	Équipement	Bio Chem Fluidique	009LP	Cap Assemblée
Tube 1 / 4 "(DO) x 1 / 8" (ID)	Équipement	Cole-Parmer	EW-95875-02	Cap assemblage et les lignes de transfert de gaz
Tube 1 / 8 "(DO) x 1 / 16" (ID)	Équipement	Cole-Parmer	EW-06605-27	Cap Assemblée
Vannes à deux voies	Équipement	Cole-Parmer	07391-04	Cap Assemblée
Filtre, Grade AAQ	Équipement	Filtres Balston	9922-05
Acide formique, LC / MS de grade	Réactifs	Fisher	A117-05AMP	Solution électronébulisation
Le méthanol, LC / MS de grade	Réactifs	Fisher	A456-500	Solution électronébulisation
Eau, LC / MS de grade	Réactifs	Fisher	W6-500	Solution électronébulisation