Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

Resumo

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) permite a detecção de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. Este protocolo fornece instruções para a caracterização (dentro de minutos) rápida de VOCs bacteriana usando SESI-MS.

Resumo

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) é um método desenvolvido para a rápida detecção de compostos voláteis, sem a necessidade de pré-tratamento da amostra. O método foi primeiramente descrita por Fenn e colaboradores ¹ e tem sido aplicada para a detecção de drogas ilícitas ² e explosivos ^3-4, a caracterização de compostos voláteis de pele ^5, ea análise de ar ^6-7.

SESI ionização ocorre por reações de transferência de prótons entre a solução eo analito electrospray volátil, e, portanto, adequado para a análise de hetero-moléculas orgânicas, assim como na ionização electrospray tradicionais (ESI). No entanto, ao contrário ESI padrão, o processo de transferência de prótons do SESI ocorre na fase vapor, em vez de em solução (Fig. 1), e, portanto, SESI é o mais adequado para a detecção de voláteis orgânicos e aerossóis.

Estamos expandindo o uso do SESI-MS para a detecção de compostos voláteis de bactérias como um método para a identificação e caracterização de bactérias ^8. Nós demonstramos que SESI-MS fingerprinting volátil, combinado com um método de análise estatística, pode ser usado para diferenciar gêneros de bactérias, espécies e culturas mistas em uma variedade de meios de crescimento. ⁸ Aqui nós fornecemos os passos para a obtenção de impressões digitais bacteriana voláteis usando SESI -MS, incluindo os parâmetros instrumentais que devem ser otimizados para garantir a identificação e caracterização de bactérias robusta.

Protocolo

Figura 1. Esquema SESI-MS análise de voláteis bacteriana. O headspace da cultura bacteriana é deslocado pelo CO ₂ (1) para a câmara de reação SESI (2). Como os voláteis atravessar a câmara de reação SESI eles passam através da nuvem electrospray e tornar-se ionizado (3). Uma vez ionizado, os voláteis são puxados para o espectrômetro de massa para análise (4). Transportadora de gás em excesso e não reagiu voláteis bacterianas são passados ​​através de um filtro de 0,22 mM (5), como uma medida adicional de proteção, e ventilado para um capuz químico. Detalhe: A agulha electrospray SESI é um capilar de sílica (40 ID mm) com uma ponta de agulha afiada.

Como uma demonstração da utilização do SESI-MS para a caracterização de compostos voláteis bacteriana, E. coli K12 e P. PAO1 aeruginosa são cultivadas em aerobiose durante 24 h em 50 mL de Lennox-LB a 37 ° C e os espectros SESI-MS do headspace voláteis são coletados em dois minutos. De dióxido de carbono (99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado como gás de transporte para entrega volátil para a câmara de reação. A câmara de reação SESI era costume construída e preparada para uma API-3000 (SCIEX), substituindo a fonte de íons originais electrospray. Os espectros são recolhidos no modo íon positivo usando 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, e 94,9% de água (v / v) como a solução electrospray, entregue em 5 nL / s através de uma sílica não-condutor capilar com uma ponta de agulha afiada (40 ID mm). A tensão aplicada é de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) é usado para a coleta de dados com os seguintes parâmetros: 20 - 500 Da, MCA modo, 40 scans, 3 s / scan, e 2 min tempo de análise total.

1. Sistema de cultivo

1. Escolha a embarcação apropriada para o cultivo de suas culturas, considerando as necessidades de crescimento da espécie em sua experiência (por exemplo, aeração, temperatura, luz, etc), bem como a prestação eficiente de voláteis para o espectrômetro de massa. As garrafas de cultura que escolhemos para uso são padrão de 100 ml frascos Pyrex mídia equipados com tampas de rosca que têm pelo menos duas portas luer. Uma linha de entrada é inserido através de uma porta luer para entrega transportadora de gás para o frasco da amostra e uma linha de saída é inserido através de outra porta para entrega de COV para o instrumento (Figura 1). Qualquer portas adicionais estão conectados.
2. Antes de cultivo das amostras, pressionar os vasos e submergir na água para verificar vazamentos. Fugas de gás são a principal causa de resultados atípicos na forma de sinais fracos ou ausentes ion volátil.

2. Experimento biológico: set-up e segurança considerações

1. Crescer o seu culturas nas condições adequadas à sua hipótese. Recomenda-se que pelo menos dois biológicos repetições, cada uma com dois técnicos repetições, são usados ​​para cada variável.
2. Prepare um espaço em branco para cada condição de cultura (meio, antibióticos, etc) e incubar os em branco sob as mesmas condições que as suas amostras.
3. Empregar as precauções de segurança que são apropriadas para os agentes biológicos que você está usando, levando em consideração o nível de biossegurança (s) da espécie.
4. Para evitar a contaminação de seu instrumento e as linhas de gás de transferência com agentes biológicos viável, instale filtros do tamanho dos poros adequados para a linha de gás transportador. Os filtros não irão interferir com a transferência de compostos voláteis da câmara de reacção SESI, mas pode ser ligeiramente o impacto da eficiência da transferência de aerosol. ⁶
5. Use de contenção secundária ou um armário de biossegurança ao anexar a tampa de transferência de gás para o frasco de cultura para assegurar a contenção adequada em caso de derramamento de agentes biológicos.
6. Iniciar e terminar o fluxo de gás portador a sua garrafa de amostra de uma forma que não vai aumentar a pressão dentro da garrafa.

3. Otimização de instrumento

NOTA: SESI-MS é projetado especificamente para voláteis da amostra, para limitar o uso da fragrância itens de cuidados pessoais (por exemplo, colônias, anti-séptico bucal, loções, amaciante de roupa), goma, cigarros, etc antes de usar o instrumento. Firmemente cap todos os produtos químicos voláteis no laboratório e de controle aéreo rascunhos, tanto quanto possível durante o teste.

Os seguintes parâmetros instrumentais, que afetam a intensidade do sinal e estabilidade, terá de ser otimizado para o seu instrumento e experiência.

1. Solução electrospray e taxa de fluxo: Escolha a solução electrospray apropriado para a classe de moléculas que deseja atingir, tendo em conta a polaridade instrumento operacional (modo positivo ou negativo-ion) e de caráter molecular dos compostos-alvo. Neste experimento a solução electrospray é de 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, 94,9% de água (v / v), o que aumenta a intensidade do sinal de menos moléculas polares while proporcionar estabilidade bom sinal. A solução é entregue a uma vazão de 5 nL / s.
2. Caudal do gás: O caudal do gás pode afetar a estabilidade electrospray e da intensidade do sinal. CO ₂ (≥ 99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado aqui.
3. Forma de agulha e posição: A forma ea posição ponta da agulha afetar fortemente a intensidade do sinal e estabilidade. Ao instalar uma nova agulha, a posição da agulha deve ser otimizada para criar um equilíbrio entre o fundo baixo, alto sinal do analito, e estabilidade de sinal. A fim de reproduzir os espectros SESI depois de uma mudança de agulha, é necessário recolher periodicamente espectros como você ajustar a posição da agulha até que esteja capaz de igualar o espectro observado para seus registros. A distância da ponta da agulha electrospray à massa orifício especificação será 1-5 mm.
4. Tensão aplicada: A voltagem que é aplicada ao sistema afeta a intensidade de íons de sinal e da estabilidade do Taylor electrospray cone. Além disso, a tensão ideal é dependente de sua solução de electrospray e a forma da ponta da agulha. No início de sua série de experimentos, determine a tensão que produz o espectro ideal e estabilidade de sinal para o seu sistema, e depois usar essa voltagem para todos os experimentos subseqüentes. Para o nosso sistema, tensões aplicadas de 2,0-5,0 kV fornecer intensidade de sinal ótima e estabilidade electrospray. Para este experimento 2,5 kV é usado.

4. Ligar e ajustar o SESI-MS para análise

1. Começar por assegurar que a tensão de alimentação está desligada e que o sistema é descarregado de eletricidade. Faça isso: 1) assegurar o indicador sobre a tensão de alimentação estão desligados, 2) garantir a tensão no multímetro é zero, e 3) de aterramento os fios elétricos.
2. Instalar a solução electrospray apropriado para a sua experiência.
3. Ligar o gás de arraste e definir o fluxo para a taxa apropriada para a sua experiência.
4. Aplicar pressão ao reservatório electrospray para iniciar a entrega da solução electrospray para a câmara de reação.
5. Ligue a tensão de alimentação e ajustar a tensão para um valor apropriado para seus experimentos.

NOTA: Neste ponto, as superfícies de metal da fonte de ionização são capazes de entregar um choque perigoso. Ter um grande cuidado quando se trabalha em torno do instrumento uma vez que a tensão de alimentação foi ligado.

6. Estabelecer um método de ajuste para o monitoramento do espectro SESI-MS ao fazer aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada. Use os parâmetros de aquisição que tem otimizado para o seu sistema e sua experiência. Desmarque a vários canais de Aquisição caixa de seleção (MCA) (se aplicável) de modo que cada varredura produz um espectro independente, definir o tempo de aquisição de 10-15 min, e iniciar a aquisição. Espectros do fundo de gás transportador deve agora ser observados.
7. Faça aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada para obter um cromatograma de íons estáveis ​​total (TIC) e verifica reprodutível que correspondem a CO ₂ scans de suas experiências anteriores. Uma vez que os ajustes de tensão têm sido feitos, continuam a coletar espectros e TIC por cinco minutos para garantir o instrumento está estabilizado.
8. Uma vez que a estabilidade é assegurada instrumental, configurar o método de aquisição, conforme apropriado para as suas amostras, ajustando o tempo de aquisição, intervalo de dados e seleção de MCA, conforme necessário. Coletar uma transportadora de gás espectro de fundo para seus registros.

5. Obtenção de uma impressão digital volátil de sua cultura bacteriana

1. Para coletar um espectro branco, direcionar o fluxo gasoso através das linhas de bypass, e em seguida, anexar a amostra em branco (válvulas fechadas) para as linhas de gás de transferência do instrumento.
2. Abra as válvulas para o frasco da amostra, e fechar as válvulas das linhas de bypass.
3. Permitir que o sistema atinja o equilíbrio por 30 segundos, durante os quais a umidade na câmara de reação está se estabilizando. Este período de equilíbrio é essencial para a obtenção de espectros reprodutível. Para garantir que o sistema está equilibrado, você pode querer monitorar o TIC, o que vai mudar durante o período de equilíbrio, e estabilizar depois.
4. Uma vez que o sistema é equilibrado, iniciar a coleta do espectro.
5. Depois que o espectro é coletado, retire o frasco da amostra pela primeira abertura do transportador linhas de desvio de gás, em seguida, fechar as válvulas de amostra e, finalmente, retirar o frasco da amostra. Lavar o sistema com o gás de transporte para 2-4 min, retirando a umidade e voláteis adsorvidos partir das linhas de transmissão, prevenção de amostra para amostra transição.
6. Repita os passos de 5,2-5,5 para cada amostra bacteriana, intermitentemente coleta de espectros em branco adicionais para garantir a completa subtração em branco. Incompleta subtração em branco levará àaparecimento de picos química de fundo no seu espectro processados ​​que são comuns às técnicas de ionização à pressão atmosférica (por exemplo, os ftalatos, silicones, etc.) ⁹
7. Ao recolher o seu espectro, assegurar que os sinais de íons não são superiores aos limites de detecção linear de seu instrumento, como determinado pelo TIC ea intensidade máxima de picos individuais. Íons exceder os limites superiores do detector o seu instrumento pode gerar picos de artefato que não são representativos da sua amostra.

6. Resultados representante

Como exemplo dos espectros SESI-MS que pode ser obtido para voláteis de bactérias, as impressões digitais íon positivo o modo volátil para E. coli e P. aeruginosa cresceu aerobicamente em Lennox-LB por 24 horas a 37 ° C são mostradas (Fig. 2). O E. coli volátil espectro é dominado por indole em 118 = m / z, o que dá E. culturas coli seu odor característico, enquanto que o espectro de P. aeruginosa contém uma maior variedade de picos protonatable.

Por favor note que as intensidades relativas dos picos no espectro voláteis são dependentes dos parâmetros instrumental descrito na Seção 3. Esses parâmetros devem ser rigorosamente controladas a partir de experimento para experimento, a fim de obter espectros reprodutível.

Figura 2 Blank-iões positivos subtraídos modo SESI-MS espectros (20 - 150 m / z). Da E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1 voláteis após 24 h de crescimento aeróbico em Lennox-LB a 37 ° C. Para mais detalhes sobre os picos observados nos espectros SESI, consulte Zhu, et al. ^8.

Discussão

Bactérias produzem diferentes combinações de compostos voláteis, que podem ser utilizados para identificação bacteriana ^10-12 e avaliação do estado metabólico. O método SESI-MS descrito aqui fornece um meio de caracterizar rapidamente voláteis bacteriana (em dois minutos ou menos), sem qualquer preparação da amostra, gerando uma "impressão digital" bacteriana para a identificação da espécie. ⁸ Nas últimas décadas ionização a pressão atmosférica outros MS técnicas foram aplicadas para a caracterização de compostos voláteis, incluindo tubo de íon seletivo de fluxo (SIFT) e reação de prótons de transferência (PTR) espectrometria de massa. A vantagem distintiva que o SESI oferece mais esses métodos de ionização outro é que é possível a picos fragmento específico (desde que o tipo apropriado de espectrômetro de massa foi adaptada para o SESI), que é uma importante ferramenta para identificação de compostos. Nós não combater a fragmentação de pico no protocolo listados acima, mas exemplos de como informações de fragmentação pode ser utilizado na caracterização de compostos voláteis bacteriana, consulte Zhu, et al. ⁸

SESI-MS tem aplicação directa à situ na detecção de infecções bacterianas pulmonares através da análise da respiração, mas também pode ser aplicado a qualquer cenário em que a amostragem volátil é possível. Por exemplo, as análises de compostos voláteis na urina, sangue e respiração, que são relevantes para o diagnóstico de doenças metabólicas, doenças gastroenteric, câncer e exposição ambiental, estão bem adaptados ao SESI-MS. ^13,14 SESI-MS também tem uma ampla gama de aplicações não clínicas fingerprinting VOC, incluindo a análise rápida de alimentos para os voláteis característica associada com o amadurecimento, o envelhecimento, ou estragar ^15-18.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do material	Tipo	Companhia	Catálogo #	Comentário
API-3000 Triplo Quadrupolo	Instrumento	SCIEX		Comprado com o Analista 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI Fonte Ion	Instrumento			Custom-made; referência Veja 6
Medidor de fluxo de gás	Equipamento	Cole-Parmer	EW-03217-74
Gás carbônico	Equipamento	Airgas	CD I300	≥ 99,99% puro
Nitrogênio	Equipamento	Airgas	NI UHP300	Alta pureza Ultra
100 mL de vidro de garrafas de mídia	Equipamento	VWR	89012-114	GL45 roscas
Tampas de garrafa com portas luer	Equipamento	Bio Chem Fluidics	00945T-3	Cap montagem
Luer porta velas	Equipamento	Bio Chem Fluidics	009LP	Cap montagem
Tubo 1 / 4 "(OD) x 1 / 8" (ID)	Equipamento	Cole-Parmer	EW-95875-02	Cap montagem e linhas de transferência de gás
Tubo 1 / 8 "(OD) x 1 / 16" (ID)	Equipamento	Cole-Parmer	EW-06605-27	Cap montagem
Duas válvulas de sentido	Equipamento	Cole-Parmer	07391-04	Cap montagem
Filtro, Grade AAQ	Equipamento	Filtros Balston	9922-05
Ácido fórmico, LC / MS grau	Reagente	Pescador	A117-05AMP	Solução electrospray
Metanol, grau de LC / MS	Reagente	Pescador	A456-500	Solução electrospray
Água, LC / MS grau	Reagente	Pescador	W6-500	Solução electrospray