JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.

Abstract

التلوث الميكروبي للبيئة يمثل مخاطر صحية كبيرة. المؤشرات البكتيرية الكلاسيكية البراز أظهرت أن يكون لها حدود كبيرة ، والفيروسات وأكثر مقاومة للكثير من عمليات التعطيل والمؤشرات القياسية البراز لا تبلغ عن مصدر التلوث. تطوير أساليب فعالة التكلفة للتركيز الفيروسات من الماء والمقايسات الجزيئية يسهل انطباق الفيروسات كمؤشرات للتلوث البراز والجراثيم كمصدر تتبع الأدوات (MST). والفيروسات الغدية polyomaviruses هي فيروسات تصيب الحمض النووي الأنواع الفقارية محددة بما في ذلك البشر وتفرز بشكل مستمر في البراز و / أو البول في جميع المناطق الجغرافية التي شملتها الدراسة. في الدراسات السابقة ، واقترح علينا تحديد مقدار الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) وpolyomaviruses JC (JCPyV) بواسطة PCR الكمي (qPCR) وذلك في مؤشر تلوث البراز البشري. في الآونة الأخيرة ، وضعنا لفحوصات qPCR الكمي محددة من البرتغالالفيروسات الغدية سينمائية (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV) كدلالة على وجود تلوث برازي الحيوانات ذات حساسيات من نسخ الجينوم 10-10 في أنبوب اختبار. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم الإجراءات الواجب اتباعها لتحديد مصدر تلوث في عينات المياه باستخدام هذه الأدوات. ومثال على نتائج ممثلة ، يظهر تحليل الفيروسات في المياه الجوفية تقديم مستويات عالية من النترات.

الكشف عن الفيروسات في المياه الملوثة منخفضة أو متوسطة يتطلب تركيز الفيروسات ما لا يقل عن عدة لترات من الماء إلى حجم أصغر بكثير ، وهو الإجراء الذي عادة ما يتضمن الخطوات تركيز اثنين في السلسلة. هذا الإجراء مرهقة بعض الشيء ، والتباين الملحوظ في استرداد الفيروسي يعيق بشكل كبير في تجهيز المتزامن لعدد كبير من عينات المياه.

من أجل القضاء على عنق الزجاجة بسبب الإجراءات على مرحلتين لدينا تطبيق البروتوكول خطوة واحدة وضعت في السابق studieق ، وتنطبق على مجموعة متنوعة من المصفوفات المياه. الإجراء يشمل : تحمض عينات من المياه لمدة عشر لتر ، تندف من الحليب الخالي من الدسم ، والترسيب خطورة المواد flocculated ، وجمع من تعجل والطرد المركزي ، إعادة تعليق من يعجل في 10 مل العازلة الفوسفات. يتم استخدام تركيز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية والفيروسات الغدية محددة وpolyomaviruses من الفائدة التي qPCR كميا. قد يكون عدد كبير من العينات التي تم تحليلها في وقت واحد باستخدام هذا الأسلوب تركيز منخفض التكلفة.

وقد تم تطبيق هذا الإجراء لتحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر وفي هذه الدراسة ، فإننا نقدم نتائج تحليل عينات المياه الجوفية. هذا الأسلوب الإنتاجية العالية الكمية هو موثوق بها ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة.

Protocol

1. تركيز الجسيمات الفيروسية موجودة في عينات المياه

  1. وتكييف جمع عينات المياه
    1. جمع ما لا يقل عن 2 لتر من 10 مكررات لكل عينة في حاويات من البلاستيك مع مسطحة القاع وعينة واحدة اضافية كعنصر تحكم العملية. وسيتم ارتفعت هذه العينة الأخيرة مع كمية معروفة من الجزيئات الفيروسية ويستخدم كعنصر تحكم.
      ملاحظة : من المستحسن أن يكون مادة مستقلة خاصة (الزجاجات والأنابيب وغيرها) لعينات ارتفعت.
    2. تحقق من معايرة مقياس التوصيل وإعادة تقويم إذا لزم الأمر. تعد السيطرة السلبية باستخدام ماء الصنبور سبق تعديلها إلى الموصلية الكافي (انظر أدناه 1.6) في واحدة من خارج الحاويات البلاستيكية L 10.
    3. لعينات ارتفعت : إضافة حجم قياسي من السيطرة على الفيروس (نسخ الجينوم حوالي 10 5 لكل 10 لتر من الماء) إلى العينة. مزيج من قبل التحريك تجنب الرش والهباء الجوي. ويمكن التحكم إيجابية تتمثل في سلالة اتش المألوف من لياليكما اوك HAdV - 35 أو عاثية مثل MS2.
    4. إذا كانت العينة تمثل كمية عالية من المواد العالقة (الرمل أو غيرها من المواد) ، والسماح لها الرواسب لمدة 15 دقيقة. نقل الماء في وعاء جديد.
    5. ضبط درجة الحموضة من عينة المياه إلى 3.5 (± 0.1) عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك N 1. هذه الخطوة هامة للتركيز على فيروسات ، لذا تأكد من درجة الحموضة تم تعديلها بشكل صحيح. مزيج الماء بشكل دقيق من قبل اثارة قوية بينما إضافة حمض الهيدروكلوريك. (ملاحظة : إذا كانت درجة الحموضة أقل من 3.5 إضافة هيدروكسيد الصوديوم M 1).
    6. ضبط التوصيل. إذا كان لديها عينة من 1500 الموصلية مايكروثانية / سم أو أكثر ، ليست هناك حاجة هذه الخطوة. إذا كان التوصيل هو أقل من 1500 ميكروثانية / سم ليست مضمونة تشكيل المواد flocculated (flocs) لذلك ضبط التوصيل إلى 1500 ميكرو ثانية / سم عن طريق إضافة أملاح البحر الاصطناعي (سيغما). مزيج بقوة التحريك مع إضافة أملاح البحر.
    7. سجل الرقم الهيدروجيني للعينات قبل وبعد وكذلك وتكييفق استخدام حجم حمض الهيدروكلوريك. وينبغي أيضا أن تسجل الموصلية بعد تعديل درجة الحموضة. تطهير دائما الأقطاب الحموضة متر ومقياس التوصيل بمحلول حمض الهيدروكلوريك الطازجة ، مع 10 ٪ dechlorinate الصوديوم حل tiosulphate وأخيرا شطف بالماء المقطر.
  2. إعداد الحليب الخالي من الدسم قبل flocculated 1 ٪ (PSM)
    1. تحقق من معايرة متر الرقم الهيدروجيني ومقياس التوصيل وإعادة تقويم إذا لزم الأمر.
    2. تعد مرحلة ما قبل حل flocculated الحليب الخالي من الدسم (1 ٪ PSM ، ث / ت) عن طريق إذابة 10 جرام من مسحوق الحليب منزوع الدسم (Difco) في مياه البحر L 1 الاصطناعي (حل 33.3 غرام من أملاح البحر الاصطناعي في 1 لتر من مياه الصنبور الكلور وتعقيم) و ضبط بعناية إلى 3.5 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1N. يجب أن تكون مرئية flocs. إعداد الحل قبل لمجرد أن يكون استخدام أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لإزالة الكلور استخدم 1 مل من محلول tiosulphate 10 ٪ لكل 100 مل من الماء.
  3. تندف من الجسيمات الفيروسية موجودة في عينات المياه
    1. إضافة 100 مل من PSM 1 ٪ إلى 10 عينة مياه - L.
    2. تحريك العينات لمدة 8-10 ساعة للسماح للفيروسات ليمتز إلى flocs. استخدام جهاز توقيت لتبديل قبالة التحريك بعد 80-10 ساعة.
    3. وقف التحريك وترك الرواسب flocs بواسطة الجاذبية لمدة 8-10 ساعة.
  4. جمع وإعادة حل ، وflocs. الطرد المركزي
    1. إزالة طاف باستخدام مضخة تمعجية وماصة بلاستيكية متصلة أنبوب بلاستيكي. وينبغي أن يكون للعينات جمعت ارتفعت طاف في زجاجة وتطهيرها وفقا للاجراءات الداخلية. في جميع الحالات الحرص على عدم جمع بيليه.
    2. جمع الرواسب مع flocs (حوالي 500 مل) في زجاجة الطرد المركزي.
    3. تحقيق التوازن بين الأواني بإضافة درجة الحموضة PSM 3.5.
    4. القدور الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي بسرعات عالية 8000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. بمجرد أن توقف أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة بعناية الأواني الطرد المركزي من أجهزة الطرد المركزي.
    5. ز جداصب ently الخروج وتجاهل طاف. اتباع التدابير المناسبة لمواد معدية.
    6. إضافة 7 مل من الفوسفات عازلة بحل بيليه في كل زجاجة الطرد المركزي.
    7. بمجرد أن يتم حل flocs وقياس وإضافة العازلة الفوسفات للوصول إلى إجمالي حجم 10 مل.
    8. التجانس والتركيز الفيروسية التي vortexing وتوزيع مل 10 في microtubes النظيفة التي ينبغي أن تكون مجمدة في -80 درجة مئوية في حين الحاجة إلى مزيد من التحليل.

2. حمض النووي استخراج

  1. إجراء استخراج الحمض النووي مع مجموعة صغيرة QIAamp الفيروسية الحمض النووي الريبي لتعليمات الشركة المصنعة. هذه المجموعة تمكن من استخدام منصة الآلي (مثل Qiacube ، Qiagen).

3. PCR الكمي من الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) ، polyomaviruses JC (JCPyV) ، الفيروسات الغدية الخنازير (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV)

  1. الكمي للنسخ الجينوم في العينات
    1. إعدادمزيج qPCR في منطقة منفصلة نظيفة باستخدام TaqMan PCR البيئية ماجستير ميكس 2X (النظم البيولوجية التطبيقية). رد الفعل يحدث رد فعل في لوحة 96 - البصرية مغطاة جيدا لاصق يغطي البصرية. تركيزات ميكس ماجستير ، موصوفة الاشعال وتحقيقات في الجدول 1.
    2. مرة واحدة وقد أعد هذا المزيج ، 15μl قسامة في كل جانب بما في ذلك التحكم (انظر 3.2). فإن الحجم الكلي لأحد رد فعل بعد إضافة الهدف يكون 25μl (المزيج 15μl + عينة 10μl أو قياسي).
    3. إضافة حمض النووي من العينات المستخرجة (10μl) في منطقة منفصلة. تشغيل المباشر والتخفيف من عشرة أضعاف في تنقية المياه من كل عينة في مكررة. تغطية الآبار التي تحتوي على عينات لجزء من غطاء لاصق ، والحفاظ على الجزء الآخر من غطاء للخطوة التالية.
    4. إضافة التخفيفات من الايقاف القياسية الحمض النووي (10μl) من GC/10μl 0-10 6 10 بواسطة ثلاث نسخ واستخدام micropipette تستخدم حصرا لستاندارد الحمض النووي. فمن المستحسن أن تضيف المعايير في منطقة الأشعة فوق البنفسجية مجهزة لتدمير الحمض النووي البلازميد ولتنظيف micropipette بعد كل استعمال. تغطية الآبار التي تحتوي على المعايير مع غطاء لاصق قبل قطع.
      ملاحظة : لتحضير المعلقات القياسية ليتم استخدامها في تحديد مقدار نسخ الجينوم ، ينبغي استنساخ الحمض النووي في المنطقة المستهدفة الى البلازميد وخطي. في العنوان التالي ستجد إجراءات تفصيلية حول كيفية إنشاء منحنيات قياسية مع قوالب DNA البلازميد لاستخدامها في qPCR :
      http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf
    5. نفذ qPCR في اختيار نظام ملائم المعلمات المناسب (النظر في استخدام غطاء لاصق وحجم الكلي في كل بئر ، الخ). بعد تفعيل AmpliTaq الذهب لمدة 10 دقيقة في 95 درجة مئوية ، و 40 دورات من التضخيم تتم على النحو التالي : 15 درجة مئوية في ليالي 95و1 دقيقة عند درجة 60 للHAdV ، وJCPyV BPyV و 15 ثانية في 95 درجة مئوية ، 20S عند درجة حرارة 55 مئوية و 20S في 60 درجة مئوية لمدة PAdV.
    6. حالما يتم الانتهاء من ردود الفعل ، تخزين البيانات والنتائج كما هو موضح في دليل المستخدم للمعدات المستخدمة. وسيتم تحديد كمية الحمض النووي كما وسيطة من البيانات التي تم الحصول عليها بعد تصحيح عامل التخفيف عند الحاجة.
  2. ضوابط
    1. استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية. يجب أن تشمل فحص أكثر من دولة واحدة غير قالب التحكم (NTC) لاثبات مزيج لا تنتج مضان. فإنه من المستحسن لتشغيل مراقبة عملية إيجابية من أجل تقييم تثبيط الأنزيمية المحتملة نتيجة للمثبطات الموجودة في العينات المدروسة.
    2. نتائج قياسية لفحوصات qPCR اثنين من التخفيفات مختلفة من الحمض النووي من القياسية ومراقبة العملية. استخدام النتائج لإعداد الرسوم البيانية لمراقبة الجودة (QC) البرامج ذات الصلة لحساسية وكفاءة المقايسات.
  3. تأكيدالنتائج
    1. قد تكون النتائج ايجابية وأكد كذلك باستخدام تسلسل المتداخلة - PCR والنوكليوتيدات من amplicons ، وإنتاج بيانات إضافية عن تسلسل النوكليوتيدات السلالات الكشف 1،5،6،7،9،12.

ووصف الإجراء التالي ، تم الكشف عن الفيروسات البشرية والحيوانية وكميا في مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر 2،3. كمثال ممثل ، تم تقييم عينات من المياه الجوفية من المناطق تقديم مستويات عالية من النترات لتحديد مصادر التلوث. وقد تم جمع عينات من المياه لمدة عشر ليتر من 4 آبار مختلفة في المناطق الريفية في منطقة شمال شرق في اسبانيا. خمس نسخ مكررة تم جمعها في كل تكرار واحد يجري بشكل جيد مع المصنف اتش 2 الإنسان استخدامها لمكافحة العملية. تم تجهيز العينات وفقا لبروتوكول الممثلة في الشكل 1. الأربعة يعيد تحليلها في واحدة من أربعة مواقع وأظهرت الدراسة نتائج إيجابية لPAdV (متوسط ​​قيمة 7.74x10 2 GC / لتر) التي من شأنها أن تكون ذات صلة إلى وجود عجائن الخنازير في المناطق المجاورة للموقع وأخذ عينات البراز ستدعم تلوث الخنازير كمصدر من النترات في المياه الجوفية (الجدول 2).

4. ممثل النتائج :

figure-protocol-10267
الشكل 1. الداخلي للكشف والتحديد الكمي للفيروسات في الماء.

figure-protocol-10480
الجدول 1. تركيز الاشعال وتحقيقات عن المقايسات qPCR.

figure-protocol-10690
الجدول 2. الكشف النوعي والكمي لالفيروسات الغدية الحيوانية والبشرية وpolyomaviruses في عينات المياه الجوفية.
ن عدد من يعيد تحليل
النسبة المئوية ٪ من إيجابية متماثلة
(--) غير المكتشفة

Discussion

ووصف الإجراء استيفاء الشروط اللازمة للأسلوب المناسب لروتين مختبرات البيئة والصحة العامة : يمكن استنساخه ، موثوق بها ، واضحة وفعالة من حيث التكلفة. بروتوكول بسيط ، ولكن يجب اتباعها بعناية. والموصلية المنخفضة في العينات دون إضافة تركيز الأملاح المطلوبة من مياه الب...

Disclosures

وقد أودعت طلبات براءات الاختراع في عام 2009 اثنين لحماية الملكية الفكرية للبروتوكولات لتقدير حجم وPAdV BPyV.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل الحكومة الاسبانية "MINISTERIO دي Educación ذ Ciencia" (مشروع AGL2008-05275-C01/ALI) ، في إطار الاتحاد الأوروبي للبحوث 7 مشاريع ممولة VIROBATHE (العقد رقم 513648) ، VIROCLIME (العقد رقم 243923 ) والوكالة الكتلانية للمياه والوكالة الكتالونية DE L' Aigua (ACA) ، Departament دي التحكم ط Millora dels Ecosistemes السباحة. أثناء الدراسة المتقدمة ومارتا Rusiñol زميل "AGAUR" الكاتالونية الحكومة (FI - DGR).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم الكاشف شركة فهرس العدد تعليقات
الطرد المركزي عالية السرعة (8000 x ج) Berckman كولتر أفانتي J - 20XP
درجة الحموضة متر ، ومقياس الحرارة مقياس التوصيل Afora LPPC3003
أنابيب بلاستيكية طولها 100-200 سم Deltalab 350059
تخرج عقيمة ماصات المتاح Labclinics PN10E1
أنابيب بلاستيكية معقمة 1.5 و 10-15 مل (إيبندورف ، الصقور ، الخ.) Afora KA298/00
الأواني الطرد المركزي (500 مل) فيشر العلمية SE5753512
النمامون المغناطيسي والمغناطيس (واحدة لكلالعينة) فيشر العلمية 10510
الزجاج أو البلاستيك قيعان الحاويات وجود شقة للسماح للاستخدام النمامون المغناطيسي Deltalab 191642
مضخة تمعجية لإزالة طاف (أو فراغ مضخة مائية نفاثة) واتسون ، مارلو 323E / D
الموقت إلى التحول بعيدا عن اثارة بعد 8-10 ساعات Deltalab 900400
حمض الهيدروكلوريك (1N و0.1N) Panreac 141020.1611
هيدروكسيد الصوديوم (1N) Panreac 131687.1211
أملاح البحر الاصطناعي مياه البحر سيغما S9883
الحليب الخالي من الدسم (SM) Difco 232100
الفوسفات الحموضة العازلة 7(5) 01:02 ت / ت 2 من العقيمة نا هبو M 4 و 0،2 ناه 2 ص 4 0،2 م عند pH 7.5
Thiosulphate Panreac 121879.1209 جعل حل 10 ٪ في الماء
QIAamp الفيروسي RNA ميني كيت Qiagen 52904
96 - جيدا رد فعل لوحة بصرية (500 وحدة) تطبيق النظم البيولوجية 43426659
لاصق يغطي البصرية (100 وحدة) تطبيق النظم البيولوجية 4311971
TaqMan PCR البيئية ماجستير ميكس 2X تطبيق النظم البيولوجية 4396838

References

  1. Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
  2. Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  3. Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  4. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
  5. Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
  6. Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
  7. Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
  8. Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
  9. de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
  10. Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
  11. Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
  12. Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

58 PCR qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved