قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

Summary

وهناك طريقة لتقدير تقارب مستمر لناهض للدولة النشط ( K _{ب) لمستقبلات البروتين يقترن G. التحليل ينص على تدابير المطلقة أو النسبية K ب اعتمادا على ما إذا التأسيسية تنشيط مستقبلات غير قابلة للقياس. أسلوبنا ينطبق على المصب استجابات مختلفة من التنشيط مستقبلة.}

Abstract

عندما ناهض ينشط عدد سكانها مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، فإنه يثير مسارا يشير إلى أن يتوج في استجابة الخلايا او الانسجة. ويمكن تحليل هذه العملية على مستوى واحد من مستقبلات ، بلغ عدد السكان المستقبلات ، أو استجابة المصب. هنا نحن تصف كيفية تحليل استجابة المتلقين للحصول على تقدير للتقارب ناهض المستمر للحالة نشطة من المستقبلات واحدة.

مستقبلات تتصرف كما أن تبديل كمي بالتناوب بين الدول النشطة وغير النشطة (الشكل 1). في حالة نشطة تتفاعل مع بروتينات معينة أو مجموعة الشركاء الآخرين في الإشارة. في غياب يغاندس ، وتسود حالة غير نشطة. الربط من ناهض يزيد من احتمال أن مستقبلات ستتحول الى حالة نشطة بسبب التقارب المستمر للحالة نشطة (K _ب) هو أكبر بكثير من تلك التي للدولة غير نشطة (K _أ). وخلاصة للالنواتج عشوائية من جميع المستقبلات في غلة السكان على مستوى ثابت من تفعيل مستقبلات في الوقت المناسب. والمتبادل للتركيز ناهض انتزاع نصف القصوى تنشيط مستقبلات تعادل ثابت لوحظ تقارب (K _OBS) ، ويتم تعريف جزء من ناهض مستقبلات المجمعات في حالة نشطة وفعالية (ε) (الشكل 2).

وقد تم تطوير أساليب لتحليل استجابات المتلقين من GPCRs التي تمكن من تقدير K _OBS والكفاءة النسبية ^ل1،2 ناهض. في هذا التقرير ، وتبين لنا كيفية تعديل هذا التحليل لتقدير القيمة النسبية ناهض _ب K إلى أن من آخر ناهض. لفحوصات الذي يحمل النشاط التأسيسية ، وتبين لنا كيفية تقدير _ب K في وحدات مطلقة من ^-1 م.

لدينا وسيلة لتحليل ناهض التركيز على الاستجابة منحنيات ^3،4 يتكونمن الانحدار غير الخطية العالمية باستخدام نموذج تشغيلي ^5. نحن تصف الإجراء باستخدام البرنامج التطبيقي ، بريزم (GraphPad برمجيات ، وشركة سان دييغو ، كاليفورنيا). تحليل الغلة تقديرا لنتاج K _OBS ومعلمة تتناسب مع فعالية (τ). تقدير τK _OBS واحد ناهض ، مقسوما على آخر ، هو قياس نسبي _لب K (RA _ط) ^6. عن أي نشاط مستقبلات المعرض التأسيسي ، فمن الممكن لتقدير معلمة تتناسب مع فعالية مستقبلات معقدة الحرة (τ _SYS). في هذه الحالة ، القيمة _ب K من ناهض ما يعادل τK _OBS / τ _SYS ^3.

لدينا وسيلة مفيدة لتحديد الانتقائية لمستقبلات ناهض لفرعية لقياس وناهض مستقبلات إشارات من خلال مجموعة من البروتينات المختلفة.

Protocol

1. قياس تركيز منحنيات الاستجابة ناهض : أي نشاط التأسيسية

1. لتقدير القيم النسبية ناهض _ب K (RA _ط) ، لا بد من سلسلة من اثنين على الأقل من منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض. ويمكن قياس أي في الفحص المختبري للاستجابة وظيفية لتوفير النوع من الاختزال التي يمكن السيطرة عليها تركيز ناهض ونوع واحد من مستقبلات يتوسط الاستجابة. مناسبة الخلية المستندة إلى فحوصات تشمل قياس ^4،7 في مخيم وتراكم inositolphosphate ^8،9 في خط الخلية تعبر عن مستقبلات المؤتلف. أمثلة على المقايسات الأنسجة كلها تتضمن قياس تقلص العضلات الملساء أو ¹⁰ م ₂ ومستقبلات المسكارينية β ₁ - الأدرينية بوساطة التغيرات في الانكماش من فئران الحقول ، حفزت الأذين الأيسر ^11.
2. اختيار سلسلة من منبهات للتحليل بما في ذلك ناهض فعالة للغاية(على سبيل المثال ، يجند الذاتية). في تجربة معينة ، وقياس تركيز كامل للاستجابة لكل منحنيات ناهض. إذا كان عدد كبير جدا منبهات لاستكمال الفحص في تجربة واحدة ، تقسيم منبهات إلى مجموعات فرعية ، يتألف كل منها من عدد معقول من منبهات لإجراء تجربة واحدة. لكل فرعية ، وقياس منحنى التركيز على الاستجابة لناهض فعال للغاية مع تلك التي منبهات أخرى في فرعية (انظر الشكل 3). تكرار التجربة على كل مجموعة فرعية 3-6 مرات ، تقريبا ، تبعا لتباين البيانات.
3. لكل منحنى التركيز على الاستجابة ، وقياس استجابة في غياب ناهض (الاستجابة القاعدية) ، وفي وجود زيادة تركيزات ناهض مساحة تركيزات ناهض موحد على نطاق وسجل تقريبا كل 0،3-0،7 سجل ₁₀ وحدة ، تغطي مجموعة من الاستجابات وتحديد الاستجابة القصوى (E _ماكس) (انظر الشكل 3). لexperimالوالدان على خطوط الخلية ، ويتم قياس كل من ثلاث نسخ.
4. طرح استجابة القاعدية من أن يقاس بحضور كل تركيز ناهض. حسبت الاستجابات المرسومة في الشكل (3) في هذه الطريقة.

2. التحليل الأولي من المنحنيات التركيز على الاستجابة ناهض : أي نشاط التأسيسية

1. إدخال البيانات من خلال تجارب التركيز على الاستجابة (على سبيل المثال ، الشكل 5) في جدول بيانات في المنشور. ودخلت كل من ناهض سجل تركيزات تحت العمود المسمى X. يتم إدخال قياسات استجابة لناهض الذي يظهر أن يكون الحد _الأقصى أكبر قيمة في العمود E A ، ويتم إدخال تلك لناهض أخرى إلى الأعمدة بالحروف المجاورة. يتم إدخال قياسات تكرار لمنحنيات التركيز على الاستجابة إلى أعمدة الفرعية عمود معين بالحروف.
2. حدد ورقة الرسم البياني الذي يتم رسم البيانات ، وتحليل البيانات عن طريق تحليل الانحدار غير الخطية باستخدامالمعادلة بعنوان السجل (ناهض) في مقابل الاستجابة -- المنحدر المتغير (أربع معلمات). تقييد "أسفل" المعلمة إلى الصفر ، وإجراء تحليل الانحدار. نسخ "الأعلى" (E _{كحد أقصى)} ، وسجل EC ₅₀ معلمات في جدول بيانات Excel لاستخدامها في حساب التقديرات الأولية المعلمة. وعينت ناهض مع التقدير E أكبر _ماكس باسم "ناهض القياسية" ، في حين عينت منبهات أخرى ك "منبهات اختبار".
3. حساب التقديرات الأولية لτK سجل _OBS (LOGR1) كقيمة سلبية سجل ₅₀ من المفوضية الأوروبية الموحدة ناهض (- EC سجل ₅₀ ').
   
   حساب التقديرات الأولية لRA سجل _ط قيمة كل اختبار ناهض (LOGRA) كما سجل {(EC الأعلى * ₅₀ ') / (الأعلى' * EC _50)} ، الذي يتم الرمز المعلمات من ناهض القياسية مع الفاصلة .
   
   حساب سجل تقارب يخدعstants للمنبهات الاختبار (LOGK2 -- LOGK5) وسجل كل منهما السلبية للقيم ₅₀ EC.

3. تقدير القيم الراي ناهض باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية : أي نشاط التأسيسية

1. إدخال البيانات في جدول البيانات في بريزم على النحو الموصوف أعلاه تحت 2.1. تأكد من أن يتم إدخال البيانات لناهض قياسية في العمود A.
2. إدخال المعرفة المعادلة ، "سجل راي" ، في منشور على عدة أسطر كما هو موضح في القضية التي تنطوي على ما مجموعه خمسة منبهات :
   • P = LOGK1
   • س = LOGR
   • <~ A> = س + LOGR LOGRA
   • P = LOGK2
   • P = LOGK3
   • P = LOGK4
   • P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (س + س))] ^ م})
3. أدخل المعلمة التقديرات الأولية كما يلي :
   إدخال قيمة منخفضة بشكل تعسفي من 0 للتسجيل المستمر تقارب (LOGK1) من ناهض القياسية.
   
   أدخل التقدير الأولي للLOGR والثوابت تقارب (LOGK2 -- LOGK5) وسجل راي القيم (LOGRA) من منبهات الاختبار.
   
   تعيين التقدير الأولي للمحول عامل الانحدار (M) بقيمة 1.0.
   
   تعيين التقديرات الأولية للاستجابة القصوى للنظام (Msys) أي ما يعادل قيمة إلى _{أقصى الحدود} هاء من ناهض القياسية (الأعلى ").
4. تطبيق القيود المعلمة التالية : LOGK1 مقيدة إلى 0 ، ثابت ؛ LOGR1 ، Msys والرصد ، والقيمة المشتركة لجميع مجموعات البيانات ؛ LOGK2 -- LOGK5 وLOGRA ، دون أي قيود.
5. الشروع في تحليل الانحدار غير الخطية. نتائج العائد K سجل _OBS وسجل RA _ط قيم ناهضات الاختبار. إذا كان المعيار هو ناهض ناهض كاملة ، ثم سجل كل من K _OBS وسجل القيم RA _ط دقيقة. إذا كان ناهض الأكثر فعالية (ناهض قياسي) هو في الواقع ناهض جزئي ، ثم K _OBS قيم آغ أكثر فعاليةقد تكون المبالغة onists. ومع ذلك ، فإن تقديرات RA سجل _ط لا يزال دقيقا في هذه الحالة.
6. إذا لم تتقارب الانحدار ، قد ترغب في المؤامرة المجرب منحنى النظرية التي تحددها المعلمة التقديرات الأولية. إذا كانت هناك انحرافات كبيرة بين نقاط البيانات والمنحنيات النظرية ، والتحقق من حساب التقديرات الأولية المعلمة. إذا واحد أو أكثر من منبهات البريد _أقصى القيم يعادل ذلك من ناهض القياسية ، قد يكون من الضروري تقييد K لهم سجل _OBS القيم إلى 0 للانحدار لتلتقي على حل.

4. قياس تركيز منحنيات الاستجابة ناهض في الخلية المقايسات مقرها العارضة التأسيسية نشاط مستقبلات

1. لتقدير القيم ناهض _ب K في وحدات المطلقة M ^-1 ، الخلية التي يوجد مقرها في فحوصات المختبر وتستخدم هذا النشاط يحمل مستقبلات التأسيسية. Constituيتم تعريف نشاط مستقبلات tive مثل زيادة استجابة فوق مستوى القاعدية بسبب التعبير عن مستقبلات المصالح.
2. ناهضات اختيار وتصميم التجربة على النحو الموصوف أعلاه في القسم 1.2.
3. لكل منحنى التركيز على الاستجابة ، وقياس استجابة في غياب ناهض في خلايا غير transfected (الاستجابة القاعدية) في الخلايا وtransfected مع مستقبلات الفائدة (+ القاعدية استجابة استجابة التأسيسية). قياس استجابة في وجود تركيزات مختلفة من منبهات مختلفة كما هو موضح أعلاه في القسم 1.3.
4. حساب التأسيسية نشاط مستقبلات وردا على تركيز كل ناهض باعتبارها استجابة قياس ناقص في الخلايا القاعدية استجابة لا transfected مع مستقبلات. ويبين الشكل 6 الردود على منبهات مختلفة تحسب على هذا النحو عن طريق إشارة عارضة النشاط التأسيسية منخفضة جدا.

5. أولي analysis منحنيات الاستجابة للتركيز النشاط ناهض العارضة التأسيسية

1. إدخال البيانات (على سبيل المثال ، الشكل 6) في جدول بيانات في المنشور كما هو موضح في القسم 3.1 ، ولكن أيضا إدخال الاستجابة الناجمة عن نشاط مستقبلات التأسيسية في الأعمدة المناسبة بالحروف المقابلة لتسجيل تركيز ناهض من -20. يتم إدخال اللوغاريتم سلبية كبيرة لتقريب تركيز ناهض an صفر.
2. تحليل البيانات كما هو موضح أعلاه في القسم 2.2 ، ولكن مع "القاع" المعلمة مقيدة بحيث يتم ذلك "المشتركة لجميع مجموعات البيانات." نسخ "الأعلى" (E _{بحد أقصى)} ، وتقاسم "القاع" وسجل EC50 المعلمات في جدول بيانات Excel لاستخدامها في حساب التقديرات الأولية المعلمة.
3. حساب التقديرات الأولية المعلمة على النحو التالي :
   
   يجب تحديد سجل تقارب المستمر لناهض القياسية (LOGK1) أو أي اختبار كامل ناهض ، في تجارب منفصلة كما هو موضح سابقا ³ .
   
   حساب التقديرات الأولية لسجل K _OBS قيمة كل اختبار ناهض جزئي (أي LOGK2 فقط في هذه الحالة) ، وسجل {(Top' - الأعلى) / (EC ₅₀ (Top' القاع))} ، حيث "القاع "تدل على الاستجابة الناجمة عن تنشيط مستقبلات التأسيسية.
   
   حساب التقديرات الأولية لسجل ك _ب (LOGKb) لكل ناهض كما سجل {الأعلى / (EC ₅₀ القاع)}.
   
   حساب التقديرات الأولية لسجل τ _SYS (LOGTsys) كما سجل {أسفل / ('أعلى -- أسفل)}.

6. تقدير القيم كيلو بايت ناهض المعرض التأسيسي لاستجابات نشاط مستقبلات باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية

1. إدخال البيانات في جدول البيانات في بريزم على النحو الموصوف أعلاه تحت 3.1
2. إدخال المعرفة المعادلة ، "تسجيل الدخول ك" ، في منشور على عدة أسطر كما هو مبين لحالة اثنين منبهات :
   • LOGKOBS = LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
   • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. أدخل المعلمة التقديرات الأولية كما يلي :
   
   أدخل كل الثوابت تقارب ناهض (LOGK1 -- أدخل القيمة المحددة بموجب الخطوة 5.3).
   
   أدخل K _OBS تقديرات ناهض كل اختبار.
   
   أدخل تقديرات كيلو بايت للمنبهات.
   
   سجل دخول τ _SYS (LOGTsys) تقدير.
   
   تعيين عامل منحدر محول (M) والاستجابة القصوى للنظام (Msys) قيم 1.0 و 'الأعلى (E _أقصى من ناهض قياسي) ، على التوالي.
4. تطبيق القيود المعلمة التالية : LOGTsys ، Msys و M ، والقيمة المشتركة لجميع مجموعات البيانات ؛ LOGK2 وLOGKb ، دون أي قيود.
5. الشروع في تحليل الانحدار غير الخطية. نتائج تسفر عن تسجيل K _(ب) من ناهض القياسية ، وسجل K _OBS وسجل _ب K القيم من منبهات جزئية ، والاستجابة القصوى للنظام (Msys) ، وقيمة _SYS τ للمجمع مستقبلات الحرة (LOGTsys) ، ومعامل الانحدار محول في نموذج تشغيلي (M).
6. إذا لم تتقارب الانحدار ، اتبع الخطوات المذكورة أعلاه تحت النقطة 3.6.

7. ممثل النتائج

الشكل 5 يوضح بعض البيانات المتوفرة لدينا تنطبق على التحلل فسفوإينوزيتيد المسكارينية ناهض التي يسببها في خلايا مبيض الهامستر الصيني معربا عن ستابلي مستقبلات المسكارينية ¹² م _3. تم قياس تركيز منحنيات الاستجابة للمنبهات المسكارينية المحدد في هذا الاختبار. وقد تم تحليل البيانات على النحو الموصوف أعلاه تحت الباب 3 لتقدير قيمة _ب K كل ناهض ، أعرب النسبي لتلك التي oxotremorine - M. هذه التقديرات RA سجل _ط هي ، كرباكول ، -0.56 ± 0.063 ؛ arecoالخط ، -0.60 ± 0.074 ؛ بيلوكاربين ، -1.20 ± 0.15 ، وMCN - A - 343 ، -1.92 ± 0.31. المنحنيات النظرية تمثل تناسب المربعات الصغرى لمعادلة الانحدار للبيانات (القسم 3.2). كانت التقديرات المقابلة من الاستجابة القصوى للنظام (M _SYS) ، وعامل منحدر محول (M) 53.9 ± 1.3 و 1.15 ± 0.09 ، على التوالي. وسجل K _OBS قيم منبهات ، إلا أنه من oxotremorine - M كانت ، كرباكول ، 5.19 ± 0.14 ؛ أريكولين ، 5.49 ± 0.12 ؛ بيلوكاربين ، 5.58 ± 0.16 وMCN - A - 343 ، 5.27 ± 0.33.

الشكل 6 يبين نتائج تجارب على التحلل المسكارينية فسفوإينوزيتيد ناهض - 293 حفز خلايا في كلوة الجنين البشري معربا عن ستابلي _α15 G ^3. تسبب التعبير عابرة للمستقبلات المسكارينية ₃ M زيادة في التحلل فسفوإينوزيتيد القاعدية ، الذي ينسب إلى أكتيف مستقبلات التأسيسيةإيتي. وقد تم تحليل البيانات لتقدير القيم سجل K _ب من oxotremorine - M - A وMCN 343 كما هو موضح تحت القسم 6. أثمر هذا التحليل سجل K من القيم _ب 8.30 ± 0.59 و 6.59 ± 0.77 لoxotremorine - M - A وMCN 343 ، على التوالي. المنحنيات النظرية تمثل تناسب المربعات الصغرى لمعادلة الانحدار للبيانات (انظر القسم 6.2). وكانت تقديرات سجل τ _SYS ، _SYS M و M -2.29 ± 0.59 ، 95.8 ± 2.8 و 0.72 ± 0.08 ، على التوالي. وتقديرا لK _OBS كانت قيمة MCN 343 - A 5.35 ± 0.46.

الشكل 1 : العلاقة بين النشاط مستقبل واحد وعلى مستوى متوسط ​​من تفعيل مستقبلات السكان. نشاط مستقبلات واحدة ، السلوك النظري لمستقبل واحد يمر transitioويرد نانوثانية بين النشط (في) وغير نشط (إيقاف) ولايات في وجود ناهض. يتم الرمز الثوابت تقارب من ناهض للدول النشطة وغير النشطة التي كتبها _ب K _و K ، على التوالي. يظهر سلوك السكان ، والسلوك النظري للمستقبلات عدة تحولات عشوائي بين الدول النشطة وغير النشطة في وجود ناهض. السكان متوسط ​​، يظهر متوسط ​​مستوى تنشيط مستقبلات في عدد السكان من المستقبلات في وجود تركيز محدد من ناهض. ومن المعروف على مستوى تفعيل مستقبلات السكان كما التحفيز.

الشكل 2. العلاقة بين مستقبلات وظيفة التنشيط وفعالية (ε) ، ولاحظ ثابتة تقارب (K _OBS) من متوسط ​​ناهض. السكان ، ومتوسط ​​المستوىتنشيط مستقبلات التي تسببها زيادة تركيزات ناهض هو مبين. تنشيط مستقبلات ، هو تآمر على مستوى متوسط ​​من تفعيل مستقبلات ناهض تركيز سجل لناهض. تركيز السجل السلبي للناهض اللازمة لتنشيط مستقبلات نصف أقصى ما يعادل سجل وحظ تقارب المستمر لناهض (K سجل _OBS). هو الرمز الحد الأقصى للمستقبلات وظيفة التنشيط ونجاعتها (ε).

الشكل 3 أمثلة على التركيز والاستجابة منحنيات لتحفيز تراكم [H ^3] inositolphosphate بواسطة مستقبلات المسكارينية في مختلف خلايا مبيض الهامستر الصيني معربا عن الإنسان مستقبلات المسكارينية م _3. تم قياس ما مجموعه تسعة منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض. ويمكن تقسيم هذه التجربة إلى قسمين. لكل جزء ، وناهض القياسية (oxotremorinم) هو اختبار دائما مع منبهات إضافية. وهكذا ، تجربتين من النوع هو موضح في البندين أ و ب مطلوبة لقياس منحنيات التركيز على الاستجابة لتسعة ناهضات إذا كان يمكن يعاير سوى خمس منبهات في وقت واحد. البيانات هي من Ehlert وآخرون ^12.

الشكل 4. أمثلة من التركيز على الاستجابة لمنحنيات تحفيز تراكم [H ^3] inositolphosphate بواسطة منبهات مختلفة في الخلايا المسكارينية 293 كلوة الجنين البشري معربا عن الإنسان مستقبلات المسكارينية م ₂ و G _α15. تسبب التعبير عن مستقبلات ₂ م لمدة 30 -- 35 ٪ ^[3 H] inositolphosphate ردا على ذلك ، الذي ينسب إلى نشاط مستقبلات التأسيسية. البيانات هي من Ehlert وآخرون ^12.

الشكل 5. المسكارينية ناهض بوساطة فسفوإينوزيتيد المائي في خلايا مبيض الهامستر الصينية معربا عن ستابلي الإنسان مستقبلات المسكارينية م _3. تظهر منحنيات التركيز على الاستجابة لمنبهات المسكارينية المختارة لتحفيز التحلل فسفوإينوزيتيد. يعني القيم من ثلاث تجارب تظهر ± SEM. البيانات هي من Ehlert وآخرون ^12.

الشكل 6. Oxotremorine - M وMCN - A - 343 بوساطة التحلل في الخلايا فسفوإينوزيتيد 293 كلوة الجنين البشري معربا عن G _α15 ومستقبلات المسكارينية م _3. وأعرب عن فسفوإينوزيتيد المائي النسبية إلى _{أقصى الحدود} من oxotremorine E - M. في غياب ناهض ، عزا فسفوإينوزيتيد المائي ويتم التعبير عن مستقبلات ₃ M تمثل حوالي 2 ٪ من الاستجابة. وتظهر وسائل ثلاثة ± SEM التجارب. دآتا هم من Ehlert وآخرون. ^3.

Discussion

لأن لدينا وسيلة لتقدير RA _ط (القيمة النسبية _ب K) لا يتطلب سوى قياس منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض ، يمكن القيام به في أي وقت تحليلنا تقاس هذه المنحنيات.

إذا يوما بعد يوم الاختلاف في الاستجابة لإعداد التجريبية (م?...