Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

Zusammenfassung

Eine Methode zur Abschätzung der Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand ( K _{B) Ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor beschrieben. Die Analyse bietet absolute oder relative Maßnahmen K B Je nachdem, ob konstitutive Rezeptoraktivierung messbar ist. Unsere Methode bezieht sich auf verschiedene Reaktionen unterhalb von Rezeptor-Aktivierung.}

Zusammenfassung

Wenn ein Agonist eine Bevölkerung von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) aktiviert, löst es einen Signalweg, der in der Reaktion der Zelle oder eines Gewebes gipfelt. Dieser Prozess kann auf der Ebene eines einzelnen Rezeptors, eine Bevölkerung von Rezeptoren oder einer nachgeschalteten Reaktion analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie die nachgeschaltete Reaktion zu analysieren, um eine Schätzung des Agonisten Affinitätskonstante für den aktiven Zustand einzelner Rezeptoren zu erhalten.

Rezeptoren verhalten, als quantal Switches, die abwechselnd zwischen aktiven und inaktiven Zuständen (Abbildung 1). Der aktive Zustand interagiert mit spezifischen G-Proteine ​​oder andere Signalisierung Partnern. In Abwesenheit von Liganden, überwiegt in den inaktiven Zustand. Die Bindung von Agonisten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass der Rezeptor wird in den aktiven Zustand wechseln, weil ihre Affinitätskonstante für den aktiven Zustand (K _b) ist viel größer als bei den inaktiven Zustand (K _a). Die Summe derrandom Ausgänge aller der Rezeptoren in der Bevölkerung führt zu einem konstanten Niveau von Rezeptor-Aktivierung in der Zeit. Der Kehrwert der Konzentration des Agonisten entlocken halbmaximale-Rezeptor-Aktivierung ist äquivalent zu der beobachteten Affinitätskonstante (K _obs), und der Anteil der Agonist-Rezeptor-Komplexe in den aktiven Zustand wird als Wirkungsgrad (ε) (Abbildung 2) definiert.

Methoden zur Analyse der nachgeschalteten Reaktionen der GPCRs sind entwickelt worden, damit die Schätzung der K _obs und relative Wirksamkeit eines Agonisten ^1,2. In diesem Bericht zeigen wir, wie diese Analyse zu modifizieren, um den Agonisten K _b-Wert relativ zu dem eines anderen Agonisten zu schätzen. Für Tests, die konstitutive Aktivität aufweisen, zeigen wir, wie K _b in absoluten Einheiten von M ^-1 abschätzen.

Unsere Methode zur Analyse von Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven ^3,4 bestehtder globalen nichtlineare Regression mit dem operativen Modell ^5. Wir beschreiben ein Verfahren, mit dem Software-Anwendung, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Die Analyse liefert eine Schätzung des Produktes der K _obs und ein Parameter proportional zur Wirksamkeit (τ). Die Schätzung der τK _obs eines Agonisten, durch die eines anderen geteilt wird, ist ein relatives Maß für K _b (RA _i) ^6. Für jeden Rezeptor aufweisen konstitutiven Aktivität ist es möglich, einen Parameter proportional zur Wirksamkeit des freien Rezeptor-Komplex (τ _sys) zu schätzen. In diesem Fall wird die K _b-Wert eines Agonisten entspricht τK _obs / τ _SYS ^3.

Unsere Methode ist nützlich für die Bestimmung der Selektivität der Agonist für Rezeptor-Subtypen und zur Quantifizierung der Agonist-Rezeptor-Signalwege durch verschiedene G-Proteine.

Protokoll

1. Die Messung der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven: keine konstitutive Aktivität

1. Für die Abschätzung der relativen Agonist K _b-Werte (RA _i), ist eine Serie von mindestens zwei Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven erforderlich. Alle In-vitro-Assay für die funktionale Verhalten eines GPCR bereitgestellt gemessen werden, dass die Konzentration des Agonisten kontrolliert werden kann und einen einzigen Typ von Rezeptor vermittelt die Antwort. Geeignet zell-basierte Assays beinhalten die Messung von cAMP ^4,7 und ^8,9 inositolphosphate Ansammlung in einer Zelllinie, die einen rekombinanten Rezeptor. Beispiele für das gesamte Gewebe-Assays sind die Messung der Kontraktion der glatten Muskulatur ¹⁰ oder M ₂ Muskarinrezeptor-und β _{1-Adrenozeptor-vermittelten} Veränderungen in Kontraktion der Feld-stimulierten Ratten linken Vorhof ^11.
2. Wählen Sie eine Reihe von Agonisten zur Analyse einschließlich einer hochwirksamen Agonisten(ZB endogener Ligand). In einem gegebenen Experiment messen komplette Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die einzelnen Agonisten. Wenn die Anzahl der Agonisten ist zu groß, um den Test in einem einzigen Experiment abgeschlossen ist, teilen die Agonisten in Untergruppen, die jeweils aus einer überschaubaren Anzahl von Agonisten für einen einzigen Experiment. Für jede Untergruppe, messen Sie die Konzentrations-Wirkungs-Kurve des hochwirksamen Agonist zusammen mit denen der anderen Agonisten in der Untergruppe (siehe Abbildung 3). Wiederholen Sie das Experiment für jede Untergruppe von 3 bis 6 mal rund, abhängig von der Variabilität der Daten.
3. Für jede Konzentrations-Wirkungs-Kurve, messen die Reaktion in Abwesenheit von Agonist (basal response), und in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Agonisten. Raum der Agonist-Konzentrationen gleichmäßig auf einer logarithmischen Skala etwa alle 0,3 bis 0,7 log ₁₀ Einheiten, die den Bereich der Antworten und die Festlegung der maximalen Antwort (E _max) (siehe Abbildung 3). Für experimEltern an Zelllinien, ist jede Messung in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
4. Subtrahieren Sie die basalen Antwort von diesem in Gegenwart von jeder Konzentration des Agonisten gemessen. Die Antworten dargestellt in Abbildung 3 wurden auf diese Weise berechnet.

2. Eine vorläufige Analyse der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven: keine konstitutive Aktivität

1. Geben Sie die Daten aus den Konzentrations-Wirkungs-Experimente (z. B. Abbildung 5) in eine Datentabelle in Prism. Alle Log-Agonist-Konzentrationen werden in der Spalte X. trat die Reaktion Messungen für den Agonist, der zu den größten E _max-Wert zu haben scheint in Spalte A eingetragen sind, und diejenigen, für die anderen Agonisten sind in benachbarte Buchstaben Kolonnen eingegeben. Replicate Messungen einer Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind in Sub-Spalten eines bestimmten Buchstaben Spalte eingetragen.
2. Wählen Sie das Diagramm Blatt, auf dem die Daten aufgezeichnet und analysiert die Daten durch nichtlineare Regressionsanalyse mitdie Gleichung berechtigt, log (Agonist) vs Antwort - Variable Steigung (vier Parameter). Beschränken der "Bottom"-Parameter auf Null, und führen Sie die Regressionsanalyse. Kopieren Sie die "Top" (E _max) und log EC ₅₀ Parameter in einer Excel-Tabelle für die Verwendung bei der Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen. Der Agonist mit dem größten E _max Schätzung wird als "Standard-Agonist" bezeichnet, während die andere Agonisten als "Test-Agonisten" bezeichnet werden.
3. Berechnen Sie die erste Schätzung von log τK _obs (LOGR1) als negative log EC _50-Wert der Standard-Agonisten (-log EC ₅₀ ').
   
   Berechnen Sie die erste Schätzung des Log-RA _i-Wert von jedem Test-Agonisten (LOGRA) als log {(Top * EC ₅₀ ') / (Top' * EC _50)}, in der die Parameter des Standard-Agonisten mit einem Apostroph bezeichnet werden .
   
   Berechnen Sie die Log-Affinität conKonstanten der Test-Agonisten (LOGK2 - LOGK5) als negative log der jeweiligen EC _50-Werte.

3. Abschätzung der Agonist RAi Werte mit nicht-lineare Regressionsanalyse: keine konstitutive Aktivität

1. Geben Sie die Daten in ein Data Table in Prism, wie oben unter 2.1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Daten für die Standard-Agonisten in der Spalte A. eingetragen sind
2. Geben Sie eine benutzerdefinierte Gleichung, "log Rai", in Prism auf mehreren Linien wie für den Fall mit insgesamt fünf Agonisten gezeigt:
   • P = LOGK1
   • Q = log r
   • <~ A> Q = log r + LOGRA
   • P = LOGK2
   • P = LOGK3
   • P = LOGK4
   • P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. Geben Sie den anfänglichen Parameterschätzungen wie folgt:
   Geben Sie einen beliebig kleinen Wert von 0 für die Log-Affinitätskonstante (LOGK1) der Standard-Agonisten.
   
   Geben Sie die erste Schätzung desLogr und die Affinitätskonstanten (LOGK2 - LOGK5) und log RAi Werte (LOGRA) der Test-Agonisten.
   
   Weisen Sie die erste Schätzung des Wandlers Hang Faktor (M) ein Wert von 1,0.
   
   Weisen Sie die erste Schätzung für die maximale Reaktion des Systems (Msys) einen Wert entspricht dem E _max der Standard-Agonisten (Top).
4. Wenden Sie die folgenden Parameter Einschränkungen: LOGK1 gezwungen, die Konstante, 0; LOGR1, Msys und M, gemeinsam Wert für alle Datensätze, LOGK2 - LOGK5 und LOGRA, keine Einschränkungen.
5. Initiate lineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse liefern den log K _obs und log RA _i-Werte der Test-Agonisten. Wenn die Standard-Agonist ist ein voller Agonist, dann die beiden log K _obs und log RA _i-Werte korrekt sind. Wenn die wirksamste Agonist (Standard-Agonist) ist eigentlich ein partieller Agonist, dann ist die K _obs-Werte der wirksamer agonists kann nicht überschätzt werden. Dennoch ist die Schätzungen der log RA _i noch in dieser Situation genau.
6. Wenn die Regression nicht konvergiert, kann der Experimentator möchte die theoretische Kurve von der anfänglichen Parameterschätzungen definierten Grundstück. Wenn es große Abweichungen zwischen den Datenpunkten und der theoretischen Kurven sind, überprüfen Sie die Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen. Wenn eine oder mehrere Agonisten E _max-Werte entspricht der des Standard-Agonist, kann es notwendig sein, um ihre log K einschränken _obs-Werte auf 0 für die Regression auf eine Lösung konvergieren.

4. Die Messung der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven in Zell-basierte Assays ausstellenden konstitutiven Rezeptor-Aktivität

1. Für die Abschätzung des Agonisten K _b-Werte in absoluten Einheiten der M ^-1, zell-basierte In-vitro-Assays sind die Ausstellung konstitutiven Rezeptor-Aktivität verwendet. VerfassungTIVE-Rezeptor-Aktivität wird als die Zunahme der Reaktion oberhalb der basalen Ebene durch die Expression des Rezeptors von Interesse verursacht definiert.
2. Wählen Agonisten und Design des Experiments, wie oben in Abschnitt 1.2 beschrieben.
3. Für jede Konzentrations-Wirkungs-Kurve, messen die Reaktion in Abwesenheit von Agonist in nicht transfizierten Zellen (basal response) und in Zellen mit dem Rezeptor von Interesse (basal Antwort + konstitutive response) transfiziert. Messen Sie die Reaktion in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der verschiedenen Agonisten wie oben in Abschnitt 1.3 beschrieben.
4. Berechnen konstitutiven Rezeptor-Aktivität und die Antwort auf jede Konzentration des Agonisten als die gemessene Reaktion minus der basalen Reaktion in den Zellen nicht mit dem Rezeptor transfiziert. Abbildung 6 zeigt Reaktionen auf verschiedene Agonisten auf diese Weise für einen Signalweg eine sehr geringe konstitutive Aktivität berechnet.

5. Vorläufige einAlysis von Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven aufweisen konstitutive Aktivität

1. Geben Sie die Daten (z. B. Abbildung 6) in eine Datentabelle in Prism, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben, sondern auch geben die Antwort konstitutiven Rezeptor-Aktivität in den entsprechenden Buchstaben Spalten entspricht einer log Agonistkonzentration von -20 verursacht. Ein großer negativer Logarithmus ist die Angleichung eines Agonisten Konzentration von Null eingegeben.
2. Analysieren Sie die Daten wie oben in Abschnitt 2.2 beschrieben, aber mit dem "Bottom"-Parameter, so dass es gezwungen ist "für alle Datensätze geteilt." Kopieren Sie die "Top" (E _max), shared "Bottom" und log EC50-Parameter in eine Excel-Tabelle für die Verwendung bei der Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen.
3. Berechnen Sie die erste Parameterschätzungen wie folgt:
   
   Die Log-Affinitätskonstante der Standard-Agonisten (LOGK1) oder eine vollständige, Test-Agonisten müssen in separaten Experimenten bestimmt werden, wie bisher ³ .
   
   Berechnen Sie die erste Schätzung der log K _obs Wert jeder Teilprüfung-Agonisten (dh, nur LOGK2 in diesem Fall) als log {(Top'-Top) / (EC ₅₀ (Top'-Bottom))}, in dem "Bottom "bezeichnet die Reaktion von konstitutiver Rezeptoraktivierung verursacht.
   
   Berechnen Sie die erste Schätzung von log K _b (LOGKb) für jeden Agonisten wie log {Top / (EC ₅₀ unten)}.
   
   Berechnen Sie die erste Schätzung von log τ _sys (LOGTsys) als log {Bottom / (Top "- Bottom)}.

6. Abschätzung der Agonist Kb Werte für Antworten ausstellenden konstitutiven Rezeptor-Aktivität mittels nichtlinearer Regressionsanalyse

1. Geben Sie die Daten in ein Data Table in Prism, wie oben unter 3.1 beschrieben
2. Geben Sie eine benutzerdefinierte Gleichung "Log Kb", in Prism auf mehreren Linien wie für den Zustand der beiden Agonisten gezeigt:
   • LOGKOBS = LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
   • B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. Geben Sie den anfänglichen Parameterschätzungen wie folgt:
   
   Geben Sie die Affinitätskonstanten jedes Agonisten (LOGK1 - geben Sie den Wert unter Schritt 5.3 bestimmt).
   
   Geben Sie die K _obs Schätzungen der einzelnen Tests Agonisten.
   
   Geben Sie den Kb Schätzungen des Agonisten.
   
   Geben Sie log τ _sys (LOGTsys) zu schätzen.
   
   Weisen Sie den Schallkopf Hang Faktor (M) und die maximale Reaktion des Systems (Msys)-Werte von 1,0 und Top '(E _max der Standard-Agonist), bzw..
4. Wenden Sie die folgenden Parameter Einschränkungen: LOGTsys, Msys und M, gemeinsam Wert für alle Datensätze, LOGK2 und LOGKb, keine Einschränkungen.
5. Initiate lineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse liefern den log K _b der Standard-Agonist, der log K _obs und log K _b-Werte der partiellen Agonisten, und die maximale Reaktion des Systems (Msys), die τ _sys-Wert für den freien Rezeptor-Komplex (LOGTsys), und der Wandler Hang Faktor in der operativen Modells (M).
6. Wenn die Regression nicht konvergiert, befolgen Sie die oben beschriebenen Schritte unter Punkt 3.6.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt einige unserer bereits veröffentlichten Daten über die Muscarin-Agonisten-induzierte Hydrolyse Phosphoinositid in der chinesischen Hamsters stabil exprimieren die M ₃ Muskarinrezeptor ^12. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der ausgewählten Muscarin-Agonisten wurden in diesem Test gemessen. Die Daten wurden analysiert, wie oben unter Abschnitt 3 beschrieben, um die K _b-Wert von jeweils Agonist Schätzung, ausgedrückt im Verhältnis zu dem von Oxotremorin-M. Diese Log-RA _i Schätzungen sind, Carbachol, -0,56 ± 0,063; Arecoline, -0,60 ± 0,074; Pilocarpin, -1,20 ± 0,15; und MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. Die theoretischen Kurven stellen die kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung, um die Daten (§ 3,2). Die entsprechenden Schätzungen der maximalen Reaktionszeit des Systems (M _sys) und der Wandler Hang Faktor (M) wurden 53,9 ± 1,3 und 1,15 ± 0,09, bzw.. Der log K _obs-Werte der Agonisten, ausgenommen Oxotremorin-M wurden, Carbachol, 5,19 ± 0,14; Arecolin, 5,49 ± 0,12; Pilocarpin, 5,58 ± 0,16 und McN-A-343, 5,27 ± 0,33.

Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse von Experimenten an den Muskarin-Agonist-stimulierte Phosphoinositid Hydrolyse in HEK 293-Zellen stabil exprimiert G _α15 ^3. Transiente Expression der M ₃ Muskarinrezeptor verursacht eine Erhöhung der basalen Phosphoinositid Hydrolyse, die zu einer konstitutiven Rezeptor-activ zugeschrieben wurdeITY. Die Daten wurden analysiert, um die log K _b-Werte Oxotremorin-M und McN-A-343 abschätzen, wie unter Abschnitt 6 beschrieben. Diese Analyse ergab log K _b-Werte von 8,30 ± 0,59 und 6,59 ± 0,77 für Oxotremorin-M und McN-A-343, bzw.. Die theoretischen Kurven stellen die kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung, um die Daten (siehe Abschnitt 6.2). Die Schätzungen der log τ _{sys, sys} M und M wurden -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 und 0,72 ± 0,08, bzw.. Die Schätzung der K _obs Wert von MCN-A-343 war 5,35 ± 0,46.

Abbildung 1. Beziehung zwischen einzelnen Rezeptor-Aktivität und das durchschnittliche Niveau der Aktivierung des Rezeptors Bevölkerung. Einzel-Rezeptor-Aktivität, die theoretische Verhalten eines einzelnen Rezeptors unterzogen transitions zwischen aktiven (On) und deaktiviert (Off) Zustände in der Gegenwart eines Agonisten gezeigt. Die Affinitätskonstanten des Agonisten für die aktive und inaktive Zustände werden durch K _b und K _a, respectively. Einwohnerzahl Verhalten, das theoretische Verhalten von mehreren Rezeptoren unterziehen zufällige Übergänge zwischen aktiven und inaktiven Zuständen in der Gegenwart eines Agonisten gezeigt wird. Population Durchschnitt ist das durchschnittliche Niveau der Rezeptor-Aktivierung in einer Population von Rezeptoren in der Gegenwart von einer bestimmten Konzentration des Agonisten gezeigt. Die Aktivierung Ebene des Rezeptors Bevölkerung wird als Stimulus bekannt.

Abbildung 2. Beziehung zwischen dem Rezeptor-Aktivierung Funktion und die Wirksamkeit (ε) und beobachtet Affinitätskonstante (K _obs) des Agonisten. Bevölkerungsdurchschnitt, das durchschnittliche Niveau derRezeptor-Aktivierung, hervorgerufen durch steigende Konzentrationen von Agonisten gezeigt. Rezeptor-Aktivierung wird das durchschnittliche Niveau der Rezeptor-Aktivierung dargestellt Agonist des Log-Konzentration des Agonisten. Die negativen log Konzentration von Agonist für halbmaximale-Rezeptor-Aktivierung erforderlich ist gleichbedeutend mit der log beobachtet Affinitätskonstante des Agonisten (log K _obs). Das Maximum der Rezeptor-Aktivierung Funktion wird als Wirkungsgrad (ε) bezeichnet.

Abbildung 3. Beispiele für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Stimulation der ^[3 H] inositolphosphate Ansammlung von verschiedenen Muscarin-Agonisten in der chinesischen Hamsters, die den menschlichen M ₃ Muskarinrezeptor. Insgesamt neun Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden gemessen. Das Experiment lässt sich in zwei Teile aufgeteilt werden. Für jedes Teil, das Standard-Agonisten (oxotremorineM) wird immer zusammen mit zusätzlichen Agonisten getestet. So, zwei Experimenten der gezeigten Art in a und b sind erforderlich, um die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von neun Agonisten zu messen, wenn nur fünf Agonisten auf einmal getestet werden kann. Die Daten werden von Ehlert et al. ^12.

Abbildung 4. Beispiele für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Stimulation von ^[3 H] inositolphosphate Ansammlung von verschiedenen Muscarin-Agonisten in HEK 293 Zellen, die das menschliche M ₂ Muskarinrezeptor und G _α15. Die Expression der M _2-Rezeptor führte zu einer 30 bis 35% ^[3 H] inositolphosphate Antwort, die zu einer konstitutiven Rezeptor-Aktivität zugeschrieben wurde. Die Daten werden von Ehlert et al. ^12.

Abbildung 5. Muscarinic Agonist-vermittelte Phosphoinositid Hydrolyse in der chinesischen Hamsters stabil exprimieren das menschliche M ₃ Muskarinrezeptor. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der ausgewählten Muscarin-Agonisten für die Stimulierung Phosphoinositid Hydrolyse gezeigt. Mittelwerte aus drei Experimenten ± SEM dargestellt. Die Daten werden von Ehlert et al. ^12.

Abbildung 6. Oxotremorin-M-und McN-A-343-vermittelten Phosphoinositid Hydrolyse in HEK 293 Zellen, die G _α15 und die M ₃ Muskarinrezeptor. Phosphoinositide Hydrolyse wird relativ zu den E _max von Oxotremorin-M. In Abwesenheit von Agonisten, zugeschrieben Phosphoinositid Hydrolyse um die Expression des M _3-Rezeptor machen etwa 2% der Antwort. Die Mittel von drei Experimenten ± SEM dargestellt. Die data sind von Ehlert et al. ^3.

Diskussion

Da unsere Methode zur Schätzung der RA _i (relative K _b-Wert) erfordert nur die Messung des Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven, kann unsere Analyse auch jederzeit diese Kurven gemessen werden.

Wenn der Tag zu Tag Variation in der Reaktion des experimentellen Vorbereitung (zB Zellen oder Gewebe) groß ist, kann die Antwort Messungen der einzelnen Konzentrations-Wirkungs-Kurve relativ zu den "Top" Schätzung der Standardabweichung Agonist...