כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

Summary

שיטה להערכת הזיקה המתמדת של אגוניסט למדינה פעיל ( K) של קולטני G-חלבון בשילוב מתואר. הניתוח מספק אמצעים מוחלט או יחסי של K תלוי אם הפעלת קולטן המכונן הוא מדיד. השיטה שלנו חל במורד התגובות השונות של הפעלת הקולטן.

Abstract

כאשר אגוניסט מפעיל אוכלוסייה של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), זה מעורר מסלול איתות זה מגיע לשיאו בתגובה של התא או הרקמה. תהליך זה יכול להיות מנותח ברמה של קולטן יחיד, אוכלוסייה של קולטנים, או תגובה במורד הזרם. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את התגובה במורד הזרם כדי לקבל אומדן של הזיקה אגוניסט מתמדת המדינה הפעילה של קולטנים יחיד.

רצפטורים להתנהג כמו מתגים quantal כי חלופי בין מדינות פעיל פעיל (איור 1). המצב הפעיל אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים G או שותפים איתות אחרים. בהעדר ligands, המדינה לא פעיל השולט. הכריכה של אגוניסט מעלה את ההסתברות כי קולטן יעבור למצב פעיל בגלל זיקה מתמדת למדינת פעיל (K _ב) שלו הוא גדול בהרבה מזה של מדינת פעיל (K). סיכום שליציאות אקראיות של כל הקולטנים באוכלוסייה התשואות על רמה קבועה של הפעלת קולטן בזמן. הגומלין של ריכוז של אגוניסט לעורר חצי מקסימלי הפעלת קולטן שווה מתמיד את הזיקה שנצפו (K _obs), וכן את החלק היחסי של אגוניסט קולטן מתחמי במצב פעיל מוגדר יעילות (ε) (איור 2).

שיטות לניתוח התגובות במורד הזרם של GPCRs פותחו המאפשרים הערכה של K _obs ואת היעילות היחסית של ^1,2 אגוניסט. בדו"ח זה, אנו מראים כיצד לשנות את הניתוח הזה כדי להעריך את ערך K אגוניסט _b ביחס לזה של אגוניסט אחר. עבור מבחני כי התערוכה פעילות המכונן, אנו מראים כיצד להעריך K _b ביחידות המוחלט של M ^-1.

השיטה שלנו לניתוח ריכוז בתגובה אגוניסט עקומות ^3,4 מורכברגרסיה ליניארית הגלובלית באמצעות מודל מבצעי ^5. אנו מתארים הליך באמצעות יישום תוכנה, פריזמה (GraphPad תוכנה, Inc, סן דייגו, קליפורניה). ניתוח התשואות אומדן של המכפלה של K ו _obs פרמטר יחסי היעילות (τ). אומדן τK _obs של אגוניסט אחד, מחולק כי אחרת, היא מדד יחסי של K _b (ע"ר _i) ^6. במשך כל קולטן מפגין פעילות מכוננת, אפשר להעריך פרמטר יחסי היעילות של קומפלקס הקולטן חינם (τ _sys). במקרה זה, הערך של K _b אגוניסט שווה τK _obs / τ _sys ^3.

השיטה שלנו הוא שימושי לקביעת הסלקטיביות של אגוניסט עבור תת קולטן לכימות אגוניסט קולטן חלבוני איתות דרך שונה G.

Protocol

1. מדידת ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט: אין פעילות מכוננת

1. לקבלת הערכת יחסי אגוניסט ערכי K _b (ע"ר _i), סדרה של לפחות שני ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט נדרשת. כל מבחנה ב assay על התגובה התפקודית של GPCR ניתן למדוד ובלבד ריכוז של אגוניסט יכול להיות מבוקר סוג אחד של קולטן מתווך את התגובה. מתאים מבוססי תאים כוללים מבחני מדידה של המחנה ^4,7 וצבירת inositolphosphate ^8,9 בקו תא מבטא רצפטור רקומביננטי. דוגמאות של מבחני רקמות שלם כוללים מדידה של התכווצות של שריר חלק ¹⁰ או _M-2 receptor ו muscarinic β _{1-adrenoceptor} בתיווך שינויים התכווצות של החולדה שדה מגורה שמאל אטריום ^11.
2. בחר סדרה של אגוניסטים לניתוח כולל אגוניסט יעיל מאוד(ליגנד למשל, אנדוגני). בניסוי נתון, למדוד להשלים ריכוז בתגובה עקומות עבור כל אגוניסט. אם מספר אגוניסטים גדול מדי כדי להשלים את assay בניסוי אחד, מחלקים את אגוניסטים לתוך קבוצות, כל אחת בהיקף של מספר לניהול של אגוניסטים עבור ניסוי בודד. עבור כל תת קבוצה, למדוד את עקומת ריכוז התגובה של אגוניסט יעיל מאוד יחד עם אלו של אגוניסטים אחרים בתת (ראה תרשים 3). חזור על הניסוי עבור כל תת קבוצה 3-6 פעמים, בערך, תלוי השתנות של הנתונים.
3. עבור עקומת ריכוז כל תשובה, למדוד את התגובה בהיעדר אגוניסט (תגובה הבסיס), וכן בנוכחות ריכוזים הגוברת של אגוניסט. שטח הריכוזים אגוניסט אחיד בקנה מידה להיכנס בערך כל 0.3-0.7 יומן ₁₀ יחידות, המכסים את מגוון התגובות והגדרת תגובה מקסימלי (E _max) (ראה איור 3). עבור experimלהורים על שורות תאים, כל מדידה נעשית בשלושה עותקים.
4. הפחת את התגובה הבסיס מזה שנמדד בנוכחות של ריכוז כל אחד אגוניסט. התגובות להתוות איור 3 חושבו בצורה זו.

2. ניתוח ראשוני של ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט: אין פעילות מכוננת

1. הזן את נתוני ריכוז בתגובה ניסויים (למשל, איור 5) לתוך טבלה נתונים פריזמה. כל הריכוזים אגוניסט יומן מוזנים תחת העמודה שכותרתה X. מדידות תגובה עבור אגוניסט כי נראה _{מקסימום} הערך הגדול ביותר E הם נכנסו בטור, ואלה עבור אגוניסט השני הם נכנסו לתוך עמודות אותיות סמוכות. מדידות שכפל של ריכוז תגובה עקומות הם נכנסו לתוך תת עמודות של עמודה בכתב נתון.
2. בחר את הגיליון גרף שבו הנתונים הם זממו, ולנתח את הנתונים על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית באמצעותהמשוואה זכאי, יומן (אגוניסט) לעומת התגובה - שיפוע משתנה (ארבעת הפרמטרים). הגבל את הפרמטר "תחתונה" לאפס, ולבצע ניתוח רגרסיה. העתק את "למעלה" (E _max) והיכנס EC ₅₀ הפרמטרים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel לשימוש החישוב של אומדני הפרמטרים הראשונים. אגוניסט עם ההערכה הגדולה _{מקסימום} E הוא יועד "אגוניסט רגיל", ואילו אחרים מיועדים אגוניסטים כמו "אגוניסטים מבחן".
3. חשב את האומדן הראשוני של יומן τK _obs (LOGR1) כמו ערך שלילי EC ₅₀ יומן של אגוניסט תקן (EC-log ₅₀ ').
   
   חישוב אומדן ראשוני של RA יומן _i הערך של אגוניסט כל מבחן (LOGRA) {כמו יומן (למעלה * EC ₅₀ ') / (למעלה "* EC _50)}, שבה הפרמטרים של אגוניסט תקן מסומנים עם גרש .
   
   חשב את יומן זיקה קוןstants של אגוניסטים הבדיקה (LOGK2 - LOGK5) כמו יומן השלילית של EC שלהם ₅₀ ערכים.

3. שערוך של ערכים אגוניסט ראי באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית: אין פעילות מכוננת

1. הזן את הנתונים לטבלה נתונים פריזמה כמתואר לעיל על פי 2.1. ודא כי הנתונים עבור אגוניסט תקן הוזנו בעמודה A.
2. הזן המוגדרים על ידי המשתמש המשוואה, "יומן ראי", לתוך פריזמה על כמה שורות כפי שמוצג למקרה מעורבים בסך הכל חמש אגוניסטים:
   • + A P = LOGK1
   • Q + A = LOGR
   • <~> ש = LOGR + LOGRA
   • P = LOGK2
   • P = LOGK3
   • P = LOGK4
   • P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(10 ^ 1 (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. הזן את אומדני הפרמטרים הראשונית כדלקמן:
   הזן ערך נמוך באופן שרירותי של 0 עבור קבוע ביומן זיקה (LOGK1) של אגוניסט הסטנדרטי.
   
   הזן את האומדן הראשוני שלLOGR ואת קבועי זיקה (LOGK2 - LOGK5) והיכנס ראי ערכים (LOGRA) של אגוניסטים הבדיקה.
   
   הקצה את האומדן הראשוני של גורם מתמר שיפוע (M) ערך של 1.0.
   
   הקצה את האומדן הראשוני התגובה מקסימלי של המערכת (Msys) ערך שווה _{למקסימום} E של אגוניסט תקן (למעלה ").
4. החלת מגבלות הפרמטר הבא: LOGK1 מוגבל מתמיד, 0; LOGR1, Msys ו-M, ערך משותף לכל סדרות הנתונים; LOGK2 - LOGK5 ו LOGRA, ללא מגבלות.
5. ליזום ניתוח רגרסיה ליניארית. התוצאות התשואה K יומן _obs והיכנס RA _אני הערכים של אגוניסטים הבדיקה. אם אגוניסט הסטנדרטי הוא אגוניסט מלא, אז גם את K יומן _obs והיכנס RA ערכים _אני מדויקים. אם אגוניסט יעיל ביותר (אגוניסט סטנדרטי) הוא למעשה אגוניסט חלקי, אזי K _obs הערכים של AG יעיל יותרonists ניתן להפריז. עם זאת, האומדנים של יומן RA _אני עדיין מדויק במצב זה.
6. אם רגרסיה לא להתכנס, הניסוי מומלץ לתכנן את העקומה התיאורטית מוגדרת על ידי אומדני הפרמטרים הראשונים. אם קיימות סטיות גדולות בין נקודות נתונים עקומי תיאורטית, לבדוק את החישוב של אומדני הפרמטרים הראשונים. אם אחד או יותר אגוניסטים יש E _{מקסימום} ערכים שווה ערך לזה של אגוניסט הסטנדרטי, ייתכן שיהיה צורך להגביל K יומן שלהם _obs הערכים 0 עבור הרגרסיה להתכנס על פתרון.

4. מדידת ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט בתא מבוססי מבחני מפגין פעילות קולטן מכוננת

1. לקבלת הערכת אגוניסט ערכי K _b ביחידות המוחלט של ^-1 M, תאים מבוסס מבחני חוץ גופית נמצאים בשימוש שפעילות מכוננת התערוכה הקולטן. Constituפעילות קולטן tive מוגדר להגדיל את בתגובה מעל רמת הבסיס הנגרמת על ידי ביטוי של הקולטן של עניין.
2. בחר אגוניסטים ועיצוב הניסוי כמתואר לעיל בסעיף 1.2.
3. עבור עקומת ריכוז כל תשובה, למדוד את התגובה בהיעדר אגוניסט שאינם transfected תאים (תגובה הבסיס) לבין תאים transfected עם הקולטן של עניין (בתגובה הבסיס + תגובה מכוננת). מדוד את התגובה בנוכחות ריכוזים שונים של אגוניסטים שונים כמתואר לעיל בסעיף 1.3.
4. חישוב פעילות קולטן מכוננת והתגובה ריכוז כל אגוניסט כתגובה נמדד מינוס התגובה הבסיס בתאים לא transfected עם הקולטן. איור 6 מציג התגובות אגוניסטים שונים מחושב בצורה הזו מסלול איתות מפגין פעילות מכוננת נמוך מאוד.

5. ראשוניalysis ריכוז תגובה עקומות אגוניסט מפגין פעילות מכוננת

1. הזן את הנתונים (למשל, איור 6) לטבלה נתונים פריזמה כמתואר בסעיף 3.1, אלא גם להזין את התגובה הנגרמת על ידי פעילות קולטן מכונן את העמודות באותיות המתאימות המתאים ריכוז יומן של אגוניסט -20. לוגריתם שלילי גדול הוא נכנס לריכוז אגוניסט המשוער של אפס.
2. לנתח את הנתונים כפי שתואר לעיל בסעיף 2.2, אבל עם הפרמטר "תחתונה" מוגבל כך שהוא "משותף לכל ערכות נתונים". העתק את "למעלה" (E _max), משותף "תחתונה" והיכנס EC50 הפרמטרים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel לשימוש החישוב של אומדני הפרמטרים הראשונים.
3. חשב את ההערכות פרמטר הראשונית כדלקמן:
   
   זיקה יומן מתמיד של אגוניסט תקן (LOGK1) או כל אגוניסט מלא, בדיקה צריכה להיקבע ניסויים נפרדים כפי שתואר לעיל ³ .
   
   חישוב אומדן ראשוני של יומן K _obs הערך של כל מבחן אגוניסט חלקי (כלומר, רק LOGK2 במקרה זה) כמו {log (Top'-Top) / (EC ₅₀ (Top'-Bottom))}, שבו "Bottom "מציין את התגובה הנגרמת על ידי הפעלת קולטן מכוננת.
   
   חשב את האומדן הראשוני של יומן K _ב (LOGKb) עבור אגוניסט כמו כל יומן {למעלה / (EC ₅₀ תחתונה)}.
   
   חשב את האומדן הראשוני של יומן τ _sys (LOGTsys) כמו יומן {למטה / ('למעלה - למטה)}.

6. שערוך של ערכים Kb אגוניסט לתגובות מפגין פעילות קולטן מכוננת באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית

1. הזן את הנתונים לטבלה נתונים פריזמה כמתואר לעיל תחת 3.1
2. הזן המוגדרים על ידי המשתמש המשוואה ", התחבר Kb", לתוך פריזמה על כמה שורות, כפי שמוצג על תנאי של שני אגוניסטים:
   • + A = LOGKOBS LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • = (10 ^ (X + LOGKOBS)) 1
   • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ ז]}
3. הזן את אומדני הפרמטרים הראשונית כדלקמן:
   
   הזן את קבועי הזיקה של כל אגוניסט (LOGK1 - הזן את הערך נקבע לפי צעד 5.3).
   
   הזן את K _obs הערכות של אגוניסט כל מבחן.
   
   הזן את הערכות Kb של אגוניסטים.
   
   הזן יומן τ _sys (LOGTsys) להעריך.
   
   הקצאת במדרון מתמר גורם (M) ואת התגובה מקסימלי של המערכת (Msys) ערכים של 1.0 ו 'למעלה (E _max של אגוניסט תקן), בהתאמה.
4. החלת מגבלות הפרמטר הבא: LOGTsys, Msys ו-M, ערך משותף לכל סדרות הנתונים; LOGK2 ו LOGKb, ללא מגבלות.
5. ליזום ניתוח רגרסיה ליניארית. התוצאות התשואה יומן K _b של אגוניסט הסטנדרטית, K יומן _obs יומן K ערכים של _b אגוניסטים חלקיים, והתגובה מקסימלי של המערכת (Msys), הערך _sys τ עבור מורכב הקולטן חינם (LOGTsys), ואת המדרון מתמר גורם במודל תפעולי (M).
6. אם רגרסיה לא להתכנס, בצע את הפעולות המתוארות לעיל תחת נקודת 3.6.

7. נציג תוצאות

איור 5 מראה כמה נתונים שפורסמו בעבר שלנו על הידרוליזה muscarinic אגוניסט-Induced phosphoinositide בסינית השחלה תאים אוגר ביציבות המבטאים את הקולטן muscarinic M ₃ ^12. ריכוז התגובה הקימורים של אגוניסטים muscarinic נבחר נמדדו assay הזה. הנתונים נותחו כמתואר לעיל על פי סעיף 3 כדי לאמוד את הערך של K _b אגוניסט כל, הביע ביחס לזה של oxotremorine-M. אלה RA יומן הערכות _ואני, carbachol, -0.56 ± 0.063; arecoקו, -0.60 ± 0.074; pilocarpine, -1.20 ± 0.15; MCN ו-A-343, -1.92 ± 0.31. עקומות תיאורטי מתאים לייצג את הפחות ריבועים של משוואת רגרסיה על הנתונים (סעיף 3.2). ההערכות המקביל התגובה המרבי של המערכת (M _sys) ואת השיפוע מתמר גורם (M) היו 53.9 ± 1.3 ו - 1.15 ± 0.09, בהתאמה. יומן K _obs ערכי אגוניסטים, למעט זה של oxotremorine-M היו, carbachol, 5.19 ± 0.14; arecoline, 5.49 ± 0.12; pilocarpine, 5.58 ± 0.16 ו MCN-A-343, 5.27 ± 0.33.

איור 6 מציג את התוצאות של ניסויים הידרוליזה muscarinic phosphoinositide אגוניסט-מגורה ב HEK 293 תאים ביציבות להביע G _α15 ^3. ביטוי חולף של הקולטן M ₃ muscarinic גרמה לעלייה הידרוליזה phosphoinositide הבסיס, אשר יוחס קולטן Activ מכוננתity. הנתונים נותחו להעריך את יומן K ערכים של oxotremorine _ב-M ו-MCN-A-343 כפי שתואר על פי סעיף 6. ניתוח זה הניב יומן K ערכים _ב של 8.30 ± 0.59 ו - 6.59 ± 0.77 עבור oxotremorine-M ו-MCN-A-343, בהתאמה. עקומות תיאורטי מתאים לייצג את הפחות ריבועים של משוואת רגרסיה על הנתונים (ראה סעיף 6.2). אומדני יומן τ _sys, M ו-M היו _sys -2.29 ± 0.59, 95.8 ± 2.8 ו - 0.72 ± 0.08, בהתאמה. אומדן K _obs הערך של MCN-A-343 היה 5.35 ± 0.46.

באיור 1. הקשר בין פעילות קולטן יחיד את הרמה הממוצעת של הפעלת הקולטן של האוכלוסייה. פעילות קולטן יחיד, התנהגות תיאורטית של קולטן אחד העוברים transitions בין פעילים (ב) ו - פעיל (כבוי) קובע בנוכחות אגוניסט מוצג. הקבועים זיקה של אגוניסט עבור מדינות פעיל פעיל מסומנים על ידי K _b ו-K בהתאמה. התנהגות אוכלוסייה, התנהגות תיאורטית של קולטנים מספר העוברים במעברים אקראיים בין מדינות פעיל פעיל בנוכחות אגוניסט מוצג. האוכלוסין בממוצע, הרמה הממוצעת של הפעלת קולטן באוכלוסייה של קולטנים בנוכחות ריכוז מסוים של אגוניסט מוצג. רמת אקטיבציה של האוכלוסייה הקולטן המכונה הגירוי.

באיור 2. הקשר בין תפקוד הקולטן ההפעלה וגם את היעילות (ε) וקבוע זיקה שנצפה (K _obs) הממוצע של אגוניסט. האוכלוסייה, הרמה הממוצעת שלהפעלת הקולטן שהושרו על ידי הגברת ריכוזי אגוניסט מוצג. הפעלת קולטן, הרמה הממוצעת של הפעלת הקולטן הוא זמם אגוניסט ריכוז יומן של אגוניסט. ריכוז יומן שלילית של אגוניסט הנדרש להפעלת חצי מקסימלי קולטן שווה זיקה יומן נצפתה מתמיד של אגוניסט (יומן K _obs). מקסימום של הפונקציה הפעלת קולטן מצוין כמו יעילות (ε).

באיור 3. דוגמאות ריכוז בתגובה עקומות לגירוי של הצטברות ^[3 H] על ידי אגוניסטים inositolphosphate muscarinic שונים סינית השחלה תאים אוגר המבטא את האדם M ₃ קולטן muscarinic. סך של תשעה ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט נמדדו. הניסוי ניתן לחלק לשני חלקים. עבור כל חלק, אגוניסט סטנדרטי (oxotremorinEM) נבחנת תמיד יחד עם אגוניסטים נוספים. לפיכך, שני ניסויים מהסוג שמוצג a ו-b נדרשים כדי למדוד את ריכוז בתגובה עקומות של תשעה אגוניסטים אם רק חמישה אגוניסטים ניתן assayed בבת אחת. הנתונים הם מתוך Ehlert et al. ^12.

איור 4. דוגמאות ריכוז בתגובה לגירוי של עקומות הצטברות ^[3 H] על ידי אגוניסטים inositolphosphate muscarinic שונים HEK 293 תאים המבטאים את הקולטן האנושי muscarinic M ₂ ו-G _α15. הביטוי של הקולטן M ₂ גרם של 30 - 35% ^[3 H] בתגובה inositolphosphate, אשר יוחסה פעילות קולטן מכוננת. הנתונים הם מתוך Ehlert et al. ^12.

איור 5. Muscarinic אגוניסט בתיווך הידרוליזה phosphoinositide בתאי השחלה סינית אוגר ביציבות המבטא את האדם M ₃ קולטן muscarinic. ריכוז התגובה הקימורים של אגוניסטים muscarinic שנבחרו הידרוליזה phosphoinositide מגרה מוצגים. ממוצע ערכים משלושה ניסויים ± SEM מוצגים. הנתונים הם מתוך Ehlert et al. ^12.

איור 6. Oxotremorine-M-MCN ו-A-343 בתיווך הידרוליזה phosphoinositide ב HEK 293 תאים להביע G _α15 לבין הקולטן muscarinic M _3. הידרוליזה phosphoinositide מתבטא ביחס _{מקסימלי} של oxotremorine E-M. בהעדר אגוניסט, הידרוליזה phosphoinositide לייחס ביטוי של הקולטן M ₃ היוו כ -2% של התגובה. פירושו של שלושה ניסויים ± SEM מוצגים. דאתא הם מן Ehlert et al. ^3.

Discussion

בגלל השיטה שלנו להערכת RA _אני (יחסית לערך K _ב) רק דורש מדידת ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט, הניתוח שלנו ניתן לעשות זאת בכל עת עקומות אלה נמדדים.

אם יום יומית וריאציה בתגובה של הכנת הניסוי (למשל, תאים או רקמות) הוא גדול, ?...