والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Summary

ونحن نقدم فعالة من حيث التكلفة وسريعة بروتوكول التنميط الجيني التي توظف متنوعة محددة الاشعال PCR أن الاختلافات الهدف تسلسل الحمض النووي داخل المنطقة هل بلاستيدات trnL-F للتمييز بين أنواع مختلفة من Imperata cylindrica (cogongrass) التي لا يمكن تمييزها عن طريق التشكل وحدها. هذه الأصناف وتشمل الأعشاب الضارة الواردة اتحاديا، cogongrass وثيقة الصلة، واسعة الانتشار متنوعة الزينة، وأنا. cylindrica فار. koenigii (يابانية عشب الدم).

Abstract

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas^1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety⁴ (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.

Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances^5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass^8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential^3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

Protocol

1. جمع العينات والمحافظة على

وقد تم تطوير هذا الأسلوب واختبارها باستخدام، الطازجة والمجمدة، والأنسجة ورقة جفت مؤخرا.

1. تحديد cogongrass و / أو JBG الأنسجة مع مساعدة من اختصاصي النصنيف التي تتخصص في تحديد الأنواع العشب. مع أوراقها حمراء لامعة، JBG الزينة هو من السهل التمييز بصريا من البرية من نوع cogongrass JBG وتعود، ولكن cogongrass وJBG العودة لا يمكن تمييزها تقريبا عن بعضها البعض. Cogongrass والنمط الظاهري JBG عادت لها الخضراء، وتعد أوراق، جذور أكبر بكثير وأطول، وأكثر من مساحة الورقة من JBG ¹² (الشكل 1).
2. جديد الأنسجة ورقة تنص على الحمض النووي الأكثر وفرة وجودة أعلى ويمكن جمعها من الحقل أو المسببة للاحتباس الحراري أولا نمت النباتات cylindrica. إذا أنسجة جديدة ليتم استخدامها، واستخراج الحمض النووي في غضون 3 ساعات من جمع للمساعدة في منع التدهور. خلاف ذلك، وإعداد أنسجة لتخزين، keepiنانوغرام النسيج بارد وبعيدا عن أشعة الشمس المباشرة.
3. لتخزين الأنسجة لاستخراج الحمض النووي في وقت لاحق، والطريقة المثلى هي لتجميد وتخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية فورا. لا تسمح الأنسجة المجمدة لذوبان الجليد قبل استخراج الحمض النووي. نقل الأنسجة المجمدة لالنتروجين السائل قبل طحن خطوات لاستخراج الحمض النووي لمنع ذوبان الجليد.
4. إذا كان التجميد -80 درجة مئوية غير متوفر، جفاف الأنسجة فورا. لتخزين جاف، ضع النسيج في مظروف ورقة وتخزين المغلف في هلام السيليكا المجففة أو المجففات أخرى ناشطة في درجة حرارة الغرفة. وهناك كمية صغيرة من السيليكا مؤشر تخلط مع عدم ضمان وتشير إلى أن السيليكا السليكا من الجفاف تماما ومناسبة لل تجفيف الأنسجة النباتية.
5. استخدم ما لا يقل عن 10 مرات أكثر من هلام السيليكا الأنسجة ورقة جديدة من حيث الوزن. وينبغي أن الأنسجة النباتية يجف في غضون 24 ساعة. ويخفض نوعية وكمية من الحمض النووي من خلال تخزين جافة مع مرور الوقت (كما في حالة من عينة معشبةق).

2. الحمض النووي استخراج

لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة النباتية، اتبع DNeasy النبات البسيطة كيت (QIAGEN، فالنسيا، كاليفورنيا؛ كات # 69104 أو 69106) تعليمات الشركة الصانعة واحد تعديل طفيف. بدلا من استخدام اقترح الأنسجة أقل من 100 ملغ الطازجة أو أقل من 20 ملغ الأنسجة الجافة لكل عمود، طحن أكبر من 100 ملغ، ومن ثم نقل 100 ملغ من الأنسجة الطازجة أو المجمدة (أو> 20 ملغ من النسيج الجاف) إلى أنابيب المناسب لاستخراج. ويتم استخراج الحمض النووي، وصانعة في وقت واحد.

1. قبل البدء في هذه الإجراءات، والتحقق من أن الإيثانول وأضيف إلى مخازن AP3 / E وAW.
2. طحن> 100 ملغ من الأنسجة ورقة الطازجة أو المجمدة (أو> 20 ملغ من أنسجة الأوراق الجافة) إلى مسحوق ناعم باستخدام ثلاث جولات من النيتروجين السائل مع طحن في بمدافع الهاون المبردة ومدقة. اضطراب غير كافية من المواد ابتداء أو تحلل غير كاف ويمكن أيضا يؤدي إلى انخفاض العوائد من الحمض النووي. طحن بعناية tissرق وعدم الإثقال على الأعمدة مع الأنسجة أكثر من اللازم.
3. نقل 100 ملغ مسحوق المجمدة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة (أو 20 ملغ من مسحوق جاف من الأنسجة) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 400 ميكرولتر من العازلة AP1 و 4 ميكرولتر من ألف ريبونوكلياز يمكن وضعها في كل أنبوب في رفوف صغيرة على موازنة لمراقبة الوزن الصحيح للنسيج في أنبوب.
4. دوامة أو هزة عينة (s) للخلط، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية، وقلب الأنبوب (ق) 2-3 مرات خلال حضانة.
5. إضافة 130 ميكرولتر من العازلة AP2 على كل عينة. مزيج من أنبوب للقلب (ق) عدة مرات، واحتضانها لمدة 5 دقائق على الجليد.
6. الماصة كل المحللة في عمود QIAshredder منفصلة تدور البسيطة، ووضع كل عمود في أنبوب جمع 2 مل (المقدمة مع عدة). عمود الطرد المركزي (ق) لمدة 2 دقيقة على 20000 XG (~ 14000 دورة في الدقيقة)، ونقل كل التدفق من خلال كسر في أنبوب جديد (غير مرفق مع عدة) دون تعطيل أي شكل بيليه.
7. إضافة 1،5 كميات من الاحتياطي AP3 /E، ومزيج من قبل pipetting.
8. نقل 650 ميكرولتر من الخليط في عمود الدوران البسيطة DNeasy في أنبوب جمع 2 مل. عمود الطرد المركزي (ق) لمدة 1 دقيقة في 6000 XG (~ 8000 دورة في الدقيقة)، والتخلص من التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة مع الخليط المتبقية لكل عينة.
9. وضع عمود الدوران (ق) الى 2 الجديدة أنبوب جمع مل (ق)، وإضافة 500 ميكرولتر من AW الاحتياطي إلى أعلى كل عمود. عمود الطرد المركزي (ق) لمدة 1 دقيقة في 6000 XG (~ 8000 دورة في الدقيقة)، وتجاهل التدفق من خلال.
10. إضافة آخر ميكرولتر 500 من AW الاحتياطي إلى أعلى كل عمود. الطرد المركزي ل2 دقيقة على 20000 XG (~ 14000 دورة في الدقيقة). وسوف تجف هذه الخطوة العمود، وبالتالي إزالة أي الإيثانول المتبقية الواردة في المخازن المؤقتة التي يمكن أن تحول دون PCR.
11. نقل كل عمود الدوران إلى أنبوب جديد 1.5 مل عينة microcentrifuge. إضافة 100 AE العازلة ميكروليتر إلى أعلى كل عمود لشطف، واحتضان عمود (ق) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عمود الطرد المركزي (ق) لمدة 1 دقيقة في 6000 XG (~ 8000 دورة في الدقيقة) لجمع الحمض النووي.
12. كرر هذه الخطوات من شطف وقت واحد، يبلغ حجمه الحمض النووي في نفس 1.5 مل أنبوب microcentrifuge لانتاج 200 ميكروليتر من عينة. عينات من الحمض النووي مخزن في -20 درجة مئوية حتى استخدامها. تركيز الحمض النووي تعتمد على نوع النسيج وظروف التخزين. ويتم الحصول على عوائد أفضل عندما يبلغ حجمه الحمض النووي مع ما مجموعه 200 ميكرولتر من AE العازلة، ولكن يمكن زيادة تركيزات إذا خفضت كميات شطف إلى اقل من 50 ميكروليتر.

3. التحقق من النوعية والكمية الحمض النووي

1. اختبار نوعية وكمية من الحمض النووي المستخرج قبل الإعداد PCR باستخدام مقياس الطيف أو مقياس التألق وهلام إستشراد. هذا سوف يساعد على ضمان نجاح الخطوات اللاحقة.
2. باستخدام مقياس الطيف اختبار الحمض النووي، كما ونوعا. وينبغي أن تكون غلة جيدة الحمض النووي بين 50 و 150 نانوغرام / ميكروليتر مع 260/280 و 230/280 نسب قريبة من 2.0. كمثال على ذلك، ويبين الشكل 2 نتائج ذات نوعية جيدة باستخدام مقياس الطيف NanoDrop (ThermoScientific، ويلمنجتون، DE).
3. إجراء الكهربائي باستخدام معيار الجل الاغاروز 1٪. التحقق من وجود فرق كبير نسبيا (> 10 كيلوبايت) مع عدم وجود لstreaking القليل من التلوث النووي الريبي (الشكل 3).
4. إذا كان تركيز الحمض النووي عالية، وعينات من الحمض النووي المخففة إلى 70 نانوغرام / ميكروليتر لخطوات لاحقة.

4. PCR الاشعال

وتستند على مبادىء القراءة PCR المستخدمة في هذا البروتوكول على الاختلافات بين تسلسل المنطقة صانعة هل trnL-F من المورثات cogongrass وJBG. هذه الاختلافات تأتي في شكل من تعدد الأشكال (الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة) وInDels (الإدراج وعمليات الحذف) الذي سمح بتطوير تشكيلة محددة من خلال تحديد موقع الاشعال الاشعال في مواقع تسلسل فريد من نوعه (الشكل 4).

1. ويمكن لنوعية الاشعال يكون لها تأثير كبير على نتائج PCR. الاشعال النظام من شركة محترمة. نحن لدينا من أجل الاشعال المائل شركة، والسيرة الذاتية (:/ / www.obliquebio.com/web/ "الهدف =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/، هانتسفيل، AL)، وطلب فقط معيار إجراءات تحلية.
2. trnL-F الاشعال سيطرة إيجابية: هذه المجموعة التمهيدي تضخيم صانعة المنطقة هل trnL-F من الأنواع الأكثر العشب ^11-13، وتقوم بدور مراقبة إيجابية جيدة (مما أدى إلى فرقة بي بي 890).
   

   اسم	تسلسل
   trnF (GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL (إكسون 5 ')-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. من النوع البري الاشعال cogongrass: هذه المجموعة التمهيدي هو محدد لcogongrass ولا تضخيم المنطقة trnL-F من JBG المورثات. نتائج المجموعة في الفرقة التي هي 595 شركة بريتيش بتروليوم.
   

   اسم	وما يليهاuence
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG وJBG قسيس الاشعال: هذه المجموعة التمهيدي هو محدد لJBG التركيب الوراثي وليس تضخيم المنطقة trnL-F من cogongrass. نتائج المجموعة في الفرقة التي هي 594 شركة بريتيش بتروليوم.
   

   اسم	تسلسل
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. Resuspend كل التمهيدي في حجم كاف من nuclease خالية من O ₂ DDH للحصول على الأوراق المالية 100 ملم الحلول التي يمكن تخزينها على -20 درجة مئوية، على المدى الطويل.
6. تمييع لكل سهم التمهيدي إلى 12 ملم قبل خطوات الإعداد PCR.

5. PCR الإعداد

وتتضخم الحمض النووي الاستخراج باستخدام كل من مجموعات التمهيدي أعلاه في تفاعلات PCR. وتشمل مراقبة إيجابية لضمان حصول جميع الكواشف PCR تعمل بشكل جيد ويمكن أن تولد الفرقة. وتشمل مراقبة سلبية لضمان الملوثة أن أيا من الكواشف مع الحمض النووي غير المرغوب فيها، ومراقبة سلبية، لا تحتوي على قالب وينبغي أن تسفر عن أي إنتاج الفرقة.

1. إعداد جميع ردود الفعل في أنابيب PCR رقيقة الجدران للسماح أفضل نقل الحرارة بين كتلة thermocycler والعينة، ونحن نوصي باستخدام المتاحة تجاريا الهباء الجوي خالية من نصائح ماصة للمساعدة على تجنب التلوث.
2. لكل عينة من الحمض النووي معزولة، وإنشاء 50 ميكرولتر تفاعلات PCR باستخدام كل من مجموعات التمهيدي أعلاه في 0.2 مل أنابيب PCR رقيقة الجدران عن طريق إضافة الكواشف التالية على الجليد في النظام المدرجة أدناه. إذا ويجري حاليا إعداد عينات متعددة، وجعل كوكتيل يحتوي على جميع الكواشف مع استثناءمن القالب الحمض النووي لإثبات شروط موحدة بين كل ردود الفعل.
   

   PCR الكاشف	حجم مستعملة	نهائي Concetration
   Nuclease خالية DDH 2 O	40.5 ميكرولتر
   10X ميزة 2 PCR العازلة (Clonetech، كاليفورنيا)	5،0 ميكروليتر	10٪ (V / V)
   ميزة عالى النقاء PCR dNTP ميكس (10 ملم لكل منهما، Clonetech، كاليفورنيا)	1،0 ميكروليتر	0.2 ملم
   التمهيدي 1 (12μM في DDH 2 O)	1،0 ميكروليتر	0.24 ميكرومتر
   التمهيدي 2 (12μM في DDH 2 O)	1،0 ميكروليتر	0.24 ميكرومتر
   ميكس ميزة بوليميريز 2 (Clonetech، كاليفورنيا)	0،5 ميكروليتر	1٪ (V / V)
   الحمض النووي استخراج(70 نانوغرام / رد فعل؛ ضبط DDH حجم O 2 حسب الحاجة)	1،0 ميكروليتر	1.4 نانوغرام / ميكروليتر
   	المجموع: 50.0 ميكرولتر

3. للتأكد من أن جميع الكواشف PCR تعمل بشكل جيد، والإعداد لسيطرة إيجابية باستخدام بادئات مراقبة إيجابية. هذه المجموعة التمهيدي يعمل بشكل جيد على قدم المساواة لcogongrass، JBG، JBG تعود والأعشاب الأخرى، وسيؤدي إلى الفرقة التي هي 890 شركة بريتيش بتروليوم.
4. إعداد التحكم في استخدام سلبي التمهيدي سيطرة نفس تعيين مراقبة إيجابية، وذلك باستخدام DDH ₂ O بدلا من استخلاص الحمض النووي. وإذا كان كل الكواشف خالية من الحمض النووي يلوث، وهذا سيؤدي إلى رد فعل في أي فرقة.
5. إذا كان تركيز الحمض النووي هو المنخفض، ويمكن إضافة المزيد من الحمض النووي لكل رد فعل، وضبط كمية من Nuclease خالية من O ₂ DDH تستخدم لجعل حجم رد الفعل الكلي إلى 50 ميكروليتر. لا تستخدم أكثر من 5 ميكرولتر من الحمض النووي (10٪ من حجم التداول الكلي) في صeaction، يمكن الشوائب ممكن الواردة في عينات من الحمض النووي تحول دون تفاعلات PCR.

6. PCR ركوب الدراجات

1. تنفيذ التكبير PCR في thermocycler مجهزة بغطاء ساخنة باستخدام الدراجات PCR التالية المعلمات. نستخدم المؤيد Mastercycle S thermocycler (إيبندورف، Hauppauge، NY) وضع معيار للعمل مع ظروف التعلية درجة الحرارة. وينبغي أن أي thermocycler جودة أداء جيدا.
   

   دورة	تمسخ التليين	التبلمر
   1	2 دقيقة على 95 درجة مئوية
   2	30 ثانية في 95 درجة مئوية	30 ثانية عند 61 درجة مئوية 90 ثانية عند 68 درجة مئوية 35 دراجات
   3		5 دقائق عند 68 درجة مئوية
   عقد في 4 درجات مئوية حتى تتم إزالة عينة

2. تحسين الظروف لPCR (بما في ذلك درجة الحرارة التمهيدي الصلب، مرات التمديد، وعدد من الدورات) حسب الحاجة تبعا لنوعية الحمض النووي، الاشعال، طق البلمرة أو نوع من thermocycler المستخدمة. ونحن نوصي باستخدام thermocycler التدرج قادرة عند تحديد الأمثل درجات الحرارة الصلب.
3. إذا كان thermocycler المستخدمة لا يملك غطاء ساخنة، إضافة 1 قطرة من الزيوت المعدنية إلى أعلى كل عينة لمنع تبخر خلال ركوب الدراجات PCR.

7. هلام إستشراد من المنتجات PCR

لتصور نتائج التحليل، منفصلة منتجات PCR على هلام الاغاروز 1٪ باستخدام معيار الكهربائي.

1. الجمع بين 2 ميكرولتر من منطقة عازلة الحمض النووي التحميل القياسية (عادة ما يكون حل 5X أو 6X) مع 5 ميكرولتر من كل منتج PCR تضخيمها.
2. تحميل العينات على مادة هلامية تحتوي على 1٪ الاغاروز EtBr (إيثيديوم الميثيل لتلطيخ DNA) المصنوع من البريدنظم العازلة ither تاي أو SB (بورات الصوديوم) ^16. نحن نستخدم 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل محلول المخزون EtBr الاغاروز لكل 100 مل 1٪ (0.1 ميكروغرام / مل).
3. تشغيل العينات في 120V ~ حتى الجبهة صبغ يصل ¾ من الطول الكلي للهلام.
4. تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (مثل الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة ضوء مربع)، تفقد العصابات مما أدى إلى معرفة ما إذا تم تضخيم شظية المناسبة.
5. توثيق جل وشرائح الناتجة باستخدام الصور والوثائق المتاحة نظام أو كاميرا.

8. ممثل النتائج

بناء على تصور للمنتجات PCR، cogongrass لديه نمطا فريدا النطاقات مقارنة بما كان عليه من JBG أو عادت JBG (الشكل 5). لكل عينة من الحمض النووي، ينبغي أن trnL-F التمهيدي سيطرة مجموعة النتائج الإيجابية في فرقة واحدة عالية الكثافة في بي بي 890 ~. هذا يتحقق من أن جميع الكواشف PCR تعمل بشكل جيد. وبالمثل، ينبغي للسيطرة سلبية (أي قالب) رد فعل لا تحتوي على أي فرق للق التمهيدياستخدمت وآخرون. هذا يتحقق من أن كانت ملوثة أيا من الكواشف.

إذا تم التوصل إلى عينة من الحمض النووي من النوع البري cogongrass، وهو رد فعل PCR باستخدام مجموعة التمهيدي cogongrass محددة سيؤدي في فرقة واحدة في بي بي 595 ~ بينما الاشعال JBG محددة سيؤدي إلى عدم الفرقة. وبالمثل، إذا مشتق عينة من الحمض النووي من JBG أو عادت JBG، سيكون رد فعل PCR باستخدام مجموعة التمهيدي JBG محددة يؤدي إلى فرقة واحدة في ~ 594 شركة بريتيش بتروليوم في حين أن الاشعال cogongrass محددة سيؤدي إلى عدم الفرقة. لأن JBG وJBG عادت لها مطابق تسلسل الحمض النووي، وبالتالي سيكون لديهم مطابقة أنماط النطاقات. إذا عينات كثيرة وينبغي مقارنة على هلام في نفس الوقت، من المستحسن تشغيل جميع العينات المستمدة من كل التمهيدي وضع بجانب بعضها البعض، مما يجعل من الأسهل لفحص عينات لتحقيق نتائج ايجابية.

الاختلافات الشكلية بين JBG وJBG يعود واضحة إلى حد ما (اللون الأحمر على سبيل المثال من الأوراق وأصغر قامة من JB G مقابل تلوين الخضراء، ومكانة أكبر والنمو العدوانية للJBG العودة)، وذلك في حين PCR النتائج سوف تكون هي نفسها، والأصناف JBG من السهل التمييز بين استخدام مورفولوجيا النبات.

الشكل 1. مقارنة الاحتباس الحراري نمت Imperata cylindrica فار. koenigii (يابانية عشب الدم)، وعاد أولا cylindrica فار. koenigii (JBG تقرير تلفزيوني)، وأولا cylindrica (من النوع البري cogongrass).

الشكل 2. مثال على عينات من الحمض النووي التحقق منها باستخدام مقياس الطيف NanoDrop. نلاحظ أنه، بغض النظر عن مقياس الطيف الضوئي المستخدمة، ونسبة 260/280 وينبغي أن تكون قريبة إلى 1.8، ونسبة 260/230 يجب أن تغلق على 2.0.

ontent ">
عينات من الحمض النووي رقم 3. التحقق باستخدام معيار الكهربائي للهلام في هلام الاغاروز 1٪. تم استخدام علامة تجارية لتحليل الحمض النووي الحجم. لين رقم 4 هو مثال على سوء نوعية عينة من الحمض النووي، والتي تبين تلطيخ وتلوث بعض الحمض النووي الريبي.

عادت التحالفات تسلسل الشكل 4. من المناطق trnL-F من cylindrica Imperata koenigii. فار (يابانية عشب الدم)، I. cylindrica فار. koenigii (JBG تقرير تلفزيوني)، وأولا cylindrica (من النوع البري cogongrass). السهام السوداء العمودية تشير إلى اختلافات في سلاسل الناتجة عن تعدد الأشكال وInDels. الأسهم الخضراء أفقي تشير إلى مواقف الاشعال cogongrass البرية من نوع يستخدم لcogongrass محددة PCR. السهام الحمراء أفقي تشير إلى بريدsitions من JBG وJBG قسيس الاشعال المستخدمة لJBG محددة PCR.

الشكل 5. نتيجة الممثل من هلام إستشراد من المنتجات المشتقة من cogongrass PCR، JBG وJBG العودة عينات من الحمض النووي جنبا إلى جنب مع cogongrass والاشعال JBG محددة، فضلا عن trnL-F سيطرة إيجابية والتحكم قالب لا سلبي.

Discussion

الحضانة الولايات المتحدة والصناعات المشهد تزدهر على زراعة وبيع أنواع النباتات الغريبة ورواية. هذا، بالإضافة إلى تزايد عولمة التجارة، ويزيد من فرص أن الأنواع النباتية الغازية ستدخل، وإنشاء، وانتشرت في الولايات المتحدة القدرة على تنظيم الحكومة الفدرالية مثل هذه المصانع تعتمد على المعلومات التي غالبا ما تكون غير متوفرة، بما في ذلك القدرة على أن تصبح الغازية الصحيح والتصنيف، والطابع المميز وراثية من الأصناف المحلية والمتجنسين. لأن معرفتنا النباتات الغازية غالبا ما تكون محدودة، وقد تم النباتات المستوردة ذات الخصائص المخفية الغازية قدم عن طيب خاطر فقط لمعرفة وقت لاحق انهم غزو مواردنا الزراعية والطبيعية. هذا البروتوكول يهدف الى معالجة هذه المشاكل مرتبطة أولا أصناف cylindrica من خلال تقديم أول طريقة مبسطة الجزيئية التي يمكن أن نميز بدقة بين البرية من نوع cogongrass وشكل عادت من نظيره JBG الزينة.

jove_content "> وبالنسبة للتنمية من هذا البروتوكول، وجمعت من النوع البري cogongrass من السكان المجنسين في وحدة البركة الغابات كريك في مقاطعة سانتا روزا بالقرب جاي، فلوريدا في شهر يونيو من عام 2008. JBG تم شراؤها من المشاتل التجارية (بلوبيرد اطفال، المؤتمر الوطني العراقي ..) في يونيو 2008 وكذلك من جمع المنزل في كولومبيا، MO JBG يعود تم الحصول عليها من باحة متحف كامبل الجيولوجي في جامعة كليمسون، واتفاقية استكهولم في يونيو 2008؛ من جامعة بارك في ريفرديل، ماجستير في يونيو 2009، و من الساحة الأمامية من المنزل في كولومبيا، مو في عام 2009 (التي تم تحديدها من قبل Cseke ليلاند). تمت المحافظة على جميع النباتات في الدفيئة التي تقع في جامعة ألاباما في هانتسفيل (هانتسفيل، AL).

وشملت التسلسل الجيني للحمض النووي التي تم جمعها من هذه النباتات ومقارنات في عمق 9 مناطق الحمض النووي المستقل الذي يستخدم عادة في محطات الباركود ^2. في جميع الحالات، كانت تتابع JBG مباراة بنسبة 100٪ لتلك التي تعود JBG، مما يساعد علىتحقق من أن JBG لا تعود في الواقع إلى نموذج، أخضر الغازية. فقط لبرنامجها النووي وبلاستيدات الخضراء المناطق trnL-F خلافات التي يمكن استخدامها للتمييز بين وراثيا cogongrass وJBG. في منطقته لديها ما مجموعه 3 تعدد الأشكال (الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة) بين cogongrass وJBG، في حين ان المنطقة trnL-F قد 2 و 2 النيوكلوتايد InDels (الإدراج والحذف). هذه الاختلافات الوراثية سمح متنوعة محددة بادئات PCR إلى تطوير التي يمكن أن تميز بين من النوع البري cogongrass ويعود JBG. قد تأتي النتائج الأكثر موثوقية من الاشعال المستمدة من المنطقة trnL-F صانعة. وهكذا، ويستند هذا البروتوكول على الفوارق بين المناطق تسلسل trnL-F من الجينوم بلاستيدات الخضراء من cogongrass، JBG وعادت JBG (الشكل 4).

للمساعدة في توليد الاشعال التي هي أكثر تحديدا للأصناف المذكورة والمساعدة على تجنب ايجابيات كاذبة من أنواع وثيقة الصلة، آلل معروف trnL-F تسلسل أولا وتمت مقارنة مع أصناف cylindrica trnL-F متواليات من أنواع الأعشاب ذات الصلة (43 سلاسل مستقلة من 29 نوعا، على سبيل المثال، Cymbopogon citratus، Sorghastrum incompletum، دمع أيوب، jobi، Miscanthus سينينسيس، قصب السكر officinarum، halepense الذرة البيضاء). وعلى الرغم من أننا فحص متواليات التمهيدي متنوعة محددة عبر 29 نوعا من العشب، وخصوصية الاشعال تشكيلة معينة لم يتم دراستها على نحو شامل لقدرته على تضخيم الحمض النووي من معظم الأنواع الأخرى العشب. وبناء على ذلك، ينبغي أنسجة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي التي تم تحديدها بعناية كما I. cylindrica قبل البدء في هذا البروتوكول. إذا لا يمكن تحديد العشب إما cogongrass أو JBG، ثم نقترح التسلسل للمنتج PCR للتأكد من أن تسلسل وتطابق تام إلى cogongrass أو JBG. حاليا، فإن الطريقة الأكثر دقة للتحقق من هوية من عينة عشب معين هو لأداء PCR في تي في على حد سواءrnL-F والمناطق، تليها سلسلة من المنتجات والتحقق PCR ومقارنة تسلسل إلى تسلسل معروف من الأنواع التي تم تحديدها بدقة. ويمكن تضخيم الحمض النووي باستخدام بادئات المراقبة المفصلة في هذا البروتوكول (لمنطقة trnL-F) أو الاشعال الأخرى التي تتوافر في غيرها من المنشورات ^13-15. التسلسل هو عمل أكثر من ذلك بكثير وتكلفة مكثفة من استخدام إجراءات مبسطة لدينا.

نوعية الاشعال PCR تستخدم لأمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. لقد جعلنا من الاشعال لهذا الإجراء المتاحة من شركة المائل، بيو ( http://www.obliquebio.com/web/ ، هانتسفيل، AL). ميزة ليأمر الاشعال من بيو المائل هي أنها تخزين أعداد كبيرة من aliquots من كل التمهيدي من سلسلة إنتاج نموذج مطابق كما الاشعال نحن تستخدم لتعظيم الاستفادة في مختبرنا. وبناء على ذلك، الاشعال ليس فقط تسلسل نفسه، ولكن تيمهلا تأتي من الكثير إنتاج نفسها بالضبط التي تم استخدامها في هذا البروتوكول. باستخدام بادئات من نفسه الكثير، يمكن أن تساعد على تجنب المتغيرات الدخيلة في الإجراء الذي قد ينجم عن الاختلاف في نوعية بادئات PCR. وعلى نحو مماثل، في حين الأخرى بلمرة طق ينبغي أن تعمل بشكل جيد لPCR، ونوعية بوليميريز طق المستخدمة لها تأثير على جودة نتائج PCR. للسماح لأفضل الاتساق في الكواشف PCR، ونحن الأمثل للبروتوكول باستخدام الكواشف من Clontech. وميزة 2 بوليميريز (Clontech، ماونتن فيو، كاليفورنيا، القط # 639201 أو 639202) هو خليط من قوية، بوليميريز طق الساخنة البداية وانزيم تصحيح التجارب المطبعية التي تساعد على تقديم نوعية عالية والتكبير أكثر دقة.

لأن هذا البروتوكول يعتمد على الحمض النووي بلاستيدات الخضراء، التي ورثت أمومي في الأعشاب، قد لا أحداث التهجين بين cogongrass والأنماط الجينية JBG يتم القبض مع إجراء لدينا تحديد الجزيئية. في الحالات التي يكون فيها الجسمى هو suspeالمديرية، ونحن نوصي باستخدام مناطق النووية التي ورثتها من الآباء والأمهات على حد سواء. الأكثر استخداما غير صانعة منطقة المتغير للنظر في التنميط الجيني للنبات هو النووي الريباسي ITS منطقة ^13-15،17. حاليا، نحن نحرز تقدما نحو الإرسال المتعدد التضخيم من المنطقة trnL-F بلاستيدات الخضراء مع أن المنطقة النووي في أنبوب PCR نفسه. والإرسال المتعدد صانعة مع مناطق الحمض النووي الالتفاف المحتمل أن القيود المفروضة على استخدام إما وحدها، ولكن مثل هذه الأساليب تتطلب التحسين وتقييم إضافية لتحديد الجدوى الاقتصادية على أساس كل حالة على حدة. كما أن استخدام PCR في الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)، والتكنولوجيات الجديدة، مثل منارات الجزيئية (تحقيقات اولية فلوري)، كما يجري حاليا تقييم آمنة من الفشل ودقة أساليب التنميط الجيني للنبات.

بروتوكول المقدمة هنا يقدم نهجا سريعة وموثوق بها للتمييز بين JBG تعود من أن من البرية من نوع cogongrass. نحن نشجع استخدامالتمرير من هذا البروتوكول في الاتصال بنا للإبلاغ النتائج المستمدة من استخدام هذا البروتوكول. لا بل ان هذه المعلومات المشتركة تساعد على توفير معلومات عن توزيع JBG يعود. وسيساعد هذا أيضا المنظمين في وزارة الزراعة الأميركية من اتخاذ قرارات مستنيرة بشأن الإجراءات التي قد تكون في حاجة للالتفاف على انتشار والتهجين المحتملة للأصناف cogongrass الغازية للغاية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
DNeasy النبات البسيطة كيت	QIAGEN، فالنسيا، كاليفورنيا	69104 أو 69106	وينبغي أن أي مصنع الجينومية السمعة عدة الحمض النووي DNA يمكن أن ينتج جيدة الجودة تعمل بشكل جيد لهذه الإجراءات.
trnF (GAA)-F	منحرف بيو، وشركة	3-0578	إيجابية إلى الأمام مراقبة التمهيدي
trnL (إكسون 5 ')-C	منحرف بيو، وشركة	3-0579	عكس إيجابي التمهيدي مراقبة
trnLF-C-F1	منحرف بيو، وشركة	3-0864	التمهيدي إلى الأمام cogongrass من النوع البري
trnLF-C-R1	منحرف بيو، وشركة	3-0865	عكسمن النوع البري cogongrass التمهيدي
trnLF-R-F2	منحرف بيو، وشركة	3-0866	JBG إلى الأمام وJBG تعود التمهيدي
trnLF-R-R2	منحرف بيو، وشركة	3-0867	عكس JBG وJBG تعود التمهيدي
ميزة عالى النقاء PCR dNTP ميكس	Clontech، ماونتن فيو، كاليفورنيا	639125
ميزة 2 البوليميراز	Clontech، ماونتن فيو، كاليفورنيا	639201 أو 639202	وخير دليل على القراءة، بوليميريز طق الساخنة البداية