Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Özet

Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar Imperata cylindrica (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil. cylindrica Var. Koenigii (Japonca kan otu).

Özet

Yabani tip I cylindrica (cogongrass) olumsuz Afrika, Asya, Avrupa, Yeni Zelanda, Okyanusya ve Amerika ^1-2 genelinde 73 farklı ülkede tarım ve doğal kaynakları etkileyen, dünyanın en kötü on invaziv bitkilerden biridir. Cogongrass yerli bitki türlerinin büyük bir çeşitlilik yerinden ve sırayla yem ve barınma için yerinden yerli bitki türleri bağlıdır yerli hayvanlarını tehdit hızla yayılan, monodominant standları oluşturur. Sorunun eklemek için, bir süs çeşitli [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] yaygın Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron ve Japon kan otu (JBG) adları altında pazarlanıyor. Bu çeşit varsay steril ve non-invaziv ve onun kırmızı renkli yaprakları için arzu edilen bir süs olarak kabul edilir. Ancak, doğru koşullar altında, JBG canlı tohum üretebilir (Carol Holko 2009, kişisel iletişim) ve i yeşil bir dönebilirsinizBu vahşi tip invaziv çeşitli ⁴ (Şekil 1) ayırt edici özellikleri üzerine alır gibi cogongrass çoğu zaman ayırt edilemez nvasive formu. Bu tanımlama bile iyi eğitimli bitki taksonomistlerin için morfolojisi zor bir görev kullanarak yapar. Saldırgan bir yeşil fenotipi JBG ile geri dönmesinin de nadir bir olay değildir. Kodlama ve nükleer ve kloroplast hem DNA değişken bölgelerin dizi karşılaştırmalar kullanarak, JBG Maryland, South Carolina, ve Missouri eyaletlerinde içinde yeşil invaziv gecmistir doğruladı. Aktif bir cogongrass istilası var olmadığı JBG kıta ABD'nin hemen her eyaletinde satılan ve dikilmiş oldu. Iyi anlaşılmış değil geri sorunun ölçüde rücu bitkiler belgelenmemiş ve genellikle yok çünkü.

Bu molekül protokolünün Uygulama JBG döner tanımlamak için bir yöntem sağlar ve co-meydana gelen, bu çeşitler kalmasına yardımcı birnd muhtemelen melezleştirerek. Cogongrass farklı bir genotip ile geçerken, bir zorunlu outcrosser ve,-rüzgar dağınık canlı üretmek ^5-7 geniş mesafelerde cogongrass yayıldı tohumları olabilir. JBG cogongrass göre biraz farklı bir genotip vardır ve cogongrass olan canlı melezler oluşturur mümkün olabilir. Sorunun eklemek için JBG cogongrass ^8-10 daha soğuk ve hoşgörülü bir gölge olduğunu ve bu iki çeşit arasındaki gen akışı daha agresif olan melezler oluşturmak için muhtemelen, vahşi tip cogongrass daha cesur, hoşgörülü, soğuk ve gölge. Yabani tip cogongrass anda Güneydoğu ABD'nin dünya çapında 490 milyon hektarın üzerinde, infests iken 500.000 hektarı aşan infests ve hızla kuzeye geniş niş ve coğrafi potansiyeli ^3,7,11 nedeniyle yayılır olarak ABD büyük kısmını işgal yeteneğine sahiptir. Genetik bir geçiş potansiyel USDA-APHIS Federal Zehirli Hafta Programı için ciddi bir endişe kaynağıdır. Şu anda, USDA-APHIS devletler wh JBG yasaklarere büyük cogongrass enfestasyonlar (örneğin, Florida, Alabama, Mississippi) vardır. Cogongrass ve JBG dağılımları genişletmek Ancak, bir araya gelen iki çeşit önlenmesi daha zor kanıtlayabilirim. Ayrıca, döner JBG dağılımı henüz bilinmeyen ve morfoloji aracılığıyla bu çeşitler tanımlamak için yeteneği olmayan bazı cogongrass istilalarını JBG döner bir sonucu olabilir. Ne yazık ki, mevcut kimliklenme moleküler yöntemler genellikle alıcı ve masraflı zaman her ikisi de AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ve DNA dizi analizi, güveniyor. Burada, doğru cogongrass ve JBG dönmek ayırt ilk maliyet-etkin ve güvenilir PCR tabanlı moleküler genotiplendirme yöntemi sunuyoruz.

Protokol

1. Örnek Toplanması ve Korunması

Bu yöntem geliştirilmiş ve taze, dondurulmuş, kurutulmuş yaprak ve son zamanlarda doku kullanılarak test edildi.

1. Cogongrass ve / veya ot türlerinin belirlenmesi konusunda uzmanlaşmış bir taksonomisti yardımı ile dokulara JBG tanımlayın. Onun parlak kırmızı yapraklı, süs JBG görsel dönmek wild-tip cogongrass ve JBG ayırt etmek kolaydır, ancak cogongrass ve JBG dönmek birbirinden neredeyse ayırt edilemez niteliktedir. Cogongrass ve JBG rücu fenotipi yeşil, uzun yapraklı, oldukça büyük ve uzun rizomlar ve JBG ¹² (Şekil 1) daha fazla yaprak alanı var.
2. Taze yaprak dokusu en bol ve en yüksek kalitede DNA sağlar ve tarla veya sera yetiştirilen I. tahsil edilebilir cylindrica bitkiler. Taze doku kullanılacak ise, bozulması önlemek için toplama 3 saat içinde DNA ayıklayın. Aksi takdirde, depolama, keepi için doku hazırlanmasıdoğrudan güneş ışığı ng doku serin ve dışarı.
3. Daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için dokuların saklamak için en uygun yöntem hemen -80 ° C de doku dondurmak ve depolanmasıdır. Dondurulmuş doku DNA ekstraksiyon önce çözülmeyi izin vermeyin. Çözülme önlemek için DNA ekstraksiyon taşlama adımları önce sıvı azot için dondurulmuş doku aktarın.
4. Bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir değilse, kuru doku hemen. Kuru depolanması için, bir kağıt zarf halinde doku yerleştirmek ve kurutulmuş silika jel veya oda sıcaklığında diğer aktif kurutucular içinde zarfı depolamak. Karıştırılır göstergesi silika küçük bir miktarı olmayan gösteren bir silika silika için tamamen kurutulmuş ve uygundur sağlayacak olan bitki doku kurutma.
5. En az 10 kat ağırlık taze yaprak daha silika jel kullanın. Bitki dokusunda 24 saat içinde kuru olmalıdır. DNA nitelik ve nicelik (herbaryum numunenin durumunda olduğu gibi, zaman içinde kuru depolanması aracılığıyla azalırs).

2. DNA Ekstraksiyonu

Bir küçük değişiklik ile üreticinin talimatlarına; bitki dokularından DNA ayıklamak için, DNeasy Bitki Mini Kit (Cat # 69.104 veya 69.106 Qiagen, Valencia, CA) izleyin. Bunun yerine her sütun için önerilen en az 100 mg taze doku veya daha az 20 mg kuru doku kullanarak, uygun tüplere (kuru doku veya> 20 mg), taze veya dondurulmuş doku 100 mg aktarmak den az 100 mg eziyet ve ekstraksiyonu için. Nükleer ve plastid DNA aynı anda elde edilir.

1. Bu işlemler başlamadan önce, etanol doğrulamak tamponlar AP3 / E ve AW ilave edildi.
2. Soğutulmuş bir havanda in taşlama ile sıvı azot üç tur kullanılarak ince bir toz olarak taze dondurulmuş doku yaprağı (ya da kuru yaprak doku> 20 mg)> 100 mg öğütün. Başlangıç ​​materyali yetersiz bozulması ya da yetersiz lizis olabilir, aynı zamanda DNA düşük verimler yol açar. Dikkatle Tiss öğütmekue ve çok fazla doku ile sütunlar aşırı değildir.
3. Tampon AP1 400 ul ve her bir tüp, bir küçük bir raf yerleştirilebilir RNaz A. 4 ul içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne taze dondurulmuş doku (ya da kuru toz dokudan 20 mg) ila 100 mg donmuş toz transferi tüp başına doku ağırlığı doğru izlemek için dengelemek.
4. Vorteks veya titreme örneği (ler) karıştırılır ve 65 'de 10 dakika inkübe ° C arasında, 2-3 kere inkübasyon sırasında ters tüp (s).
5. Her numune için Tampon AP2 130 ul ekleyin. Ters tüp (s), birkaç kez ve buz üzerinde 5 dakika süreyle inkübe ile karıştırılır.
6. Pipetleyin her biri ayrı bir QIAshredder Mini spin kolon içine lizat ve 2 ml toplama tüpüne (kiti ile sağlanır) her sütuna yerleştirin. 2 20.000 xg (~ 14.000 rpm) dk ve her yeni bir tüp (kit ile birlikte) içine fraksiyon akış yoluyla herhangi oluşan pelet bozmadan aktarmak için Santrifüj kolon (lar).
7. / Tampon AP3 1.5 hacimleri ekleE, ve pipetleme ile karıştırın.
8. 2 ml'lik toplama tüpüne bir DNeasy Mini spin kolon karışımın içine 650 ul aktarın. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). Her numune için kalan karışımı ile bu adımı yineleyin.
9. Yeni bir 2 ml toplama tüp (ler) içine spin kolon (lar) yerleştirin ve her sütunun üst Tampon AW 500 ul ekleyin. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar).
10. Her sütunun üst Tampon AW başka 500 ul ekleyin. 20,000 xg (~ 14.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüjleyin. Bu aşama, böylece PCR inhibe edebilir tamponlar içinde bulunan herhangi bir kalıntı etanol kaldırarak, kolon kuruyacak.
11. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj örnek tüp için her spin kolon aktarın. Elüsyon için her sütun başına 100 mikrolitre Tampon AE ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kolonu (ler) inkübe edilir. DNA toplamak için 6000 x g'de (~ 8.000 rpm) 1 dakika boyunca santrifüj; kolon (s).
12. Bu elüsyon 200 ul numune elde etmek için aynı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DNA elüt edilerek, bir kez adımları tekrar. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın DNA örnekleri. DNA konsantrasyonları doku tipi ve depolama koşullarına bağlıdır. Tampon AE 200 ul toplam ile elüt DNA zaman optimum verimleri elde edilmiştir, ancak konsantrasyonları elüsyon hacmi kadar az 50 ul kadar indirgenmiş halinde arttırılabilir.

3. DNA Kalite ve Miktar doğrulanması

1. Bir spektrofotometre veya florimetre ve jel elektroforezi kullanılarak PCR kurulum öncesinde çıkarılan DNA kalitesi ve miktarı test edin. Bu, sonraki adımların başarı sağlamaya yardımcı olur.
2. Bir spektrofotometre, DNA testi kalite ve miktar kullanma. İyi DNA verimleri 50 ile 150 arasında olmalıdır 2.0 yakın 260/280 ve 230/280 oranlarında ul / ng. Bir örnek olarak, Şekil 2 NanoDrop spektrofotometre (ThermoScientific kullanılarak iyi kalitede sonuçlarını göstermektedir , Wilmington, DE).
3. Standart% 1 agaroz jel kullanılarak elektroforez yürütün. RNA kontaminasyonu çok az şeritli (Şekil 3) hiçbir nispeten geniş bant (> 10 Kb) varlığını doğrulayın.
4. DNA konsantrasyonu yüksek, seyreltik DNA örnekleri sonraki adım için 70 ng / ul için ise.

4. PCR primerleri

Bu protokolde kullanılan PCR primerleri cogongrass ve JBG genotiplerinin plastid trnL-F ayırıcı bölgesi arasındaki farklılıklar sekansı esas alır. Bu farklılıklar SNP'lerin formu (tek nükleotid polimorfizmleri) ve benzersiz dizilerinin siteleri (Şekil 4) primerler bularak çeşitli spesifik primerler gelişimine izin indellerin (Eklemeler ve Silmeler) gelir.

1. Primerlerin kalitesi PCR sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Saygın bir şirketten Sipariş astarlar. Biz Eğik Bio, Inc (bizim astar siparişWww.obliquebio.com/web/ :/ / "target =" _blank "sadece standart tuzsuzlaştırma prosedürleri talep> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL).
2. trnL-F pozitif kontrol primerleri: Bu primer seti ^11-13 en çim takson plastid trnL-F boşluk bölgesi güçlendirir ve iyi bir pozitif kontrol (bir 890 bp bant ile sonuçlanan) olarak hizmet vermektedir.
   

   Isim	Dizi
   trnF (GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL (5 'ekzon)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. Yabani tip cogongrass primerler: Bu primer seti cogongrass özeldir ve genotiplerinin JBG arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 595 bp bir bantta set sonuçları.
   

   Isim	Sequence
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG ve JBG primerler dönme: Bu primer seti genotipine JBG özeldir ve cogongrass arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 594 bp bir bantta set sonuçları.
   

   Isim	Dizi
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2,	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. -20 ° C, uzun süreli saklanabilir 100 mM stok çözümler elde etmek için nükleaz içermeyen GKD ₂ O yeterli hacmi her astar yeniden süspanse edin.
6. PCR kurulum adımları önce 12 mM her astar stok sulandırınız.

5.. PCR Kurulum

DNA ekstraksiyon PCR reaksiyonlarında primer seti Yukarıdaki her biri kullanılarak amplifiye edilir. Tüm PCR iyi çalışıyoruz ve bir grup oluşturabilir sağlamak için bir pozitif kontrol ekleyin. Reaktiflerin hiçbirinin istenmeyen DNA ile kontamine sağlamak için bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontrol yapılması şablonu içeren ve hiçbir bant üretimi neden.

1. Termalcycler blok ve örnek arasında daha iyi ısı transferi sağlamak için ince duvarlı PCR tüpleri tüm reaksiyonlar hazırlayın. Biz kontaminasyonu önlemek için piyasada bulunan aerosol-free pipet uçları kullanmanızı öneririz.
2. Her izole DNA örneği için, aşağıda listelenen sırada ICE aşağıdaki reaktifler ekleyerek 0.2-ml ince duvarlı PCR tüpleri yukarıdaki primer setleri her kullanılarak 50 ul PCR reaksiyonları kurdu. Birden fazla numune hazırlanmaktadır, özel durum tüm reaktifleri içeren bir kokteyl yapmakDNA örneğinin bütün reaksiyonlar arasında düzgün koşulları kurmak.
   

   PCR Reaktif	İkinci Cilt	Final zenginleştirmesi
   Nükleaz içermeyen GKD 2 O	40.5 ul
   Avantaj 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA)	5.0 ul	10% (v / v)
   Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix (10 mM her biri Clonetech, CA)	1.0 ul	0.2 mM
   Primer 1 (GKD 2 O 12μM)	1.0 ul	0.24 uM
   Primer 2 (GKD 2 O 12μM)	1.0 ul	0.24 uM
   Avantaj 2 Polimeraz Mix (Clonetech, CA)	0.5 ul	1% (v / v)
   DNA ekstraksiyonu(70 ng / reaksiyon; gerektiği gibi GKD 2 O ses seviyesini ayarlamak)	1.0 ul	1.4 ng / ml
   	Toplam: 50.0 ul

3. Tüm PCR iyi çalıştığından emin olmak için, pozitif kontrol primerler kullanılarak pozitif kontrol kurmak. Bu primer seti dönmek ve diğer otlar JBG, cogongrass, JBG için eşit derecede iyi çalışıyor ve 890 bp olan bir bant ile sonuçlanacaktır.
4. Bunun yerine DNA ekstraksiyon GKD ₂ O kullanılarak, pozitif kontrol olarak ayarlanır aynı kontrol primer kullanılarak negatif kontrol ayarlamak. Tüm reaktifler DNA kirletiyorsa serbest ise, bu reaksiyon bir grubu ile sonuçlanacaktır.
5. DNA konsantrasyonu düşük olması durumunda, fazla DNA nükleaz içermeyen GKD ₂ O miktarı 50 ul kadar toplam reaksiyon hacmi getirmek için kullanılan ayarlayarak, her bir reaksiyonun eklenebilir. DNA fazla 5 ul (% 10 kullanılmamalıdır r başına toplam hacmi)eaction, DNA örnekleri içindeki mümkün safsızlıklar PCR reaksiyonları inhibe edebilir.

6. PCR Bisiklete binme

1. Aşağıdaki PCR bisiklet parametreleri kullanarak ısıtılmış bir kapak ile donatılmış bir termalcycler PCR amplifikasyon yürütmek. Biz standart sıcaklık tırmanışı koşulları ile çalışacak şekilde ayarlanır Mastercycle yanlısı S termalcycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) kullanın. Herhangi bir kalite termalcycler iyi yapmalıdır.
   

   Devir	Tavlama denatürasyon	Polimerizasyon
   1	95 de 2 dakika ° C
   2	95 ° C de 30 saniye	30 sn 61 ° C de 90 saniye 68 ° C'de 35 döngü
   3		68 de 5 dakika ° C
   Örnek kaldırılır ° C'ye kadar, 4 at tut

2. DNA kalitesine bağlı olarak gerektiği gibi PCR (primer tavlama sıcaklığı, uzatma süreleri ve devir sayısı dahil) için koşulları optimize, astar, PCR ile Taq polimeraz veya türü kullanılır. Biz optimum belirlerken bir degrade yetenekli thermocycler kullanmanızı öneririz sıcaklıklarda tavlama.
3. Kullanılan termalcycler ısıtılmış bir kapağı yoksa, PCR devir esnasında buharlaşmasını önlemek için her numunenin üst mineral yağı 1 damla ekleyin.

7. PCR Ürünlerinin Jel Elektroforez

Analizin sonuçları görselleştirme, standart elektroforez ile% 1 agaroz jel üzerinde ayrı PCR ürünleri.

1. Her amplifiye PCR ürün 5 ul ile standart bir DNA yükleme tamponu 2 ul (tipik olarak bir ya da 5x 6x çözeltisi) birleştirir.
2. E yapılan EtBr (DNA boyama etidyum bromid) ihtiva eden bir% 1 agaroz jel üzerine örnekleri Yükither TAE veya SB (sodyum borat) tampon sistemleri ^16. Biz, 100 ml% 1 agaroz (0.1 ug / ml) başına 10 mg / ml EtBr stok solüsyonu 1 ul kullanabilir.
3. Boya ön ulaşıncaya kadar ~ 120V azından örnekleri çalıştırmak ¾ jel toplam uzunluğunun.
4. UV ışık altında (kısa dalga UV ışık kutusu gibi), uygun bir parçası amplifiye edildi görmek için çıkan bantları kontrol edin.
5. Kullanılabilir bir foto-dokümantasyon sistemi veya kamera kullanarak jel ve çıkan bantları belgeleyin.

8. Temsilcisi Sonuçlar

PCR ürünleri görselleştirme üzerine, cogongrass JBG ya JBG (Şekil 5) döndürülmesi ile karşılaştırıldığında özel bir bantlama desene sahiptir. Her bir DNA örneği için, trnL-F pozitif kontrol primer seti ~ 890 bp tek bir yüksek yoğunluklu bant neden. Bu, tüm PCR iyi çalıştığını doğrular. Benzer şekilde, negatif kontrol (hiçbir şablon) reaksiyonu herhangi bir astar s için bir bant içermelidiret kullanılır. Bu durum, reaktifler hiçbiri kontamine oldu doğrular.

DNA vahşi tip cogongrass, JBG spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken cogongrass spesifik primer seti ~ 595 bp tek bir grup ile sonuçlanacaktır kullanılarak bir PCR reaksiyonunda elde edilirse. DNA JBG türetilen ya JBG döndürülmesi durumunda cogongrass spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken Keza, JBG spesifik primer seti kullanılarak bir PCR reaksiyonunda azından ~ 594 bp'lik bir tek grubu ile sonuçlanacaktır. JBG ve JBG geri intikal özdeş nükleik asit dizisi olduğu için, dolayısıyla aynı bant desenleri olacaktır. Birçok örnekte, aynı zamanda bir jel üzerinde karşılaştırılacak olursak, biz böylece daha kolay olumlu sonuçlar için numunelerin tarama yaparak, birbirlerine yanında kurulan her astar türetilen tüm örnekler çalıştırmanızı öneririz.

Döner JBG ve JBG arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça açıktır (yaprak ve JB küçük boy örneğin kırmızı renk PCR sonuçları aynı olacak ise G vs yeşil rengi, büyük boy ve JBG agresif büyüme dönmek), böylece, JBG çeşitleri bitkisel özellikleri kullanarak ayırt etmek kolaydır.

Şekil 1. Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) yetiştirilen sera Karşılaştırılması, I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass).

Şekil 2. Bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak teyit DNA örnekleri bir örnek. Bakılmaksızın kullanılan spektrofotometrenin, 260/280 oranı 1.8 'e yakın olmalı ve 260/230 oranı 2.0 yakın gerektiğini unutmayın.

ontent ">
Şekil 3. DNA örnekleri% 1 agaroz jel üzerinde standart jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Bir ticari DNA işaret boyutu analizi için kullanıldı. Lane # 4 bulaşmasını ve bazı RNA kirlenme gösteren, düşük kaliteli DNA bir örnektir.

Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) ile trnL-F bölgelerin Şekil 4. Sıra diziler I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). Dikey siyah oklar SNP ve indellerin kaynaklanan dizileri farklılıklar göstermektedir. Yatay yeşil oklar cogongrass özgü PCR için kullanılmıştır yabanıl tür cogongrass primerlerin pozisyonları göstermektedir. Yatay kırmızı oklar po göstermektedirJBG ve JBG ve sonrası olarak bölünmüştür JBG özgü PCR için kullanılan primerler döner.

Şekil 5. Cogongrass-ve JBG spesifik primerlerin ile yanı sıra trnL-F pozitif kontrol ve bir şablon negatif kontrol herhangi bir araya DNA örnekleri JBG ve geri JBG cogongrass türetilen PCR ürünlerinin jel elektroforezi, temsili sonucu.

Tartışmalar

ABD fidanlık ve peyzaj sanayi egzotik ve yeni bitki türlerinin yetiştirilmesi ve satan gelişirler. Ticaretin giderek artan küreselleşme ile birleştiğinde Bu, bir istilacı bitki türleri, girmek kurmak ve ABD'de federal invaziv olma potansiyeline de dahil olmak üzere, genellikle mevcut değildir bilgiye dayanır bu tür bitkilerin düzenleme yeteneği yayacağı şansını artırır , yerli ve vatandaşlığa taksonlar doğru taksonomisi ve genetik çeşitlilik. Invaziv bitkilerin bilgimiz genelde sınırlı olduğundan, gizli invaziv özellikleri ile ithal bitkiler isteyerek sadece onlar bizim tarım ve doğal kaynaklar işgal daha sonra öğrenmek için getirilmiştir. Bu protokol, I. ile ilişkili bu sorunlara yönelik amaçlar doğru wild-tip cogongrass ve süs JBG muadili rücu formu ayırt edebilirsiniz ilk basitleştirilmiş moleküler yöntem sağlayarak cylindrica çeşitleri.

Bu protokolün geliştirilmesi için jove_content ">, wild-tip cogongrass 2008 yılının Haziran ayında Jay, FL yakınlarındaki Santa Rosa County Pond Creek Orman Biriminde vatandaşlığa nüfus toplanmıştır. JBG ticari bir kreş (Bluebird Kreş, Inc temin edildi .. Riverdale, MA University Park ve Haziran 2009 yılında;;) 2008 yılı Haziran ayında yanı sıra Columbia ev sahibi koleksiyonundan, MO JBG Haziran 2008'de Clemson University, SC de Campbell Jeoloji Müzesi avlusunda elde edilen döner ve Columbia, 2009 yılında MO (Leland Cseke tarafından tanımlanan) bir ev sahibi ön avludan. Tüm bitkiler Huntsville, Alabama Üniversitesi (Huntsville, AL) bulunan bir serada tutuldu.

Bu bitkilerden toplanan DNA Genetik sekans genellikle barkod tesisleri ² için kullanılan 9 bağımsız DNA bölgeleri derinliği karşılaştırmalarda dahil. Tüm durumlarda, JBG ile dizilimler, böylece yardımcı JBG geri olanlar için bir% 100 idi eşleşmeJBG gerçekten yeşil, invaziv forma dönmek doğrulayın. Sadece nükleer ITS ve kloroplast trnL-F bölgelerde genetik cogongrass ve JBG ayırt etmek için kullanılabilir farklar var. TrnL-F bölgede 2 SNP ve 2 indellerin (eklemeler ve silmeler) sahipken ITS bölgesi, cogongrass ve JBG arasında 3 SNP (tek nükleotid polimorfizmleri) bir toplam vardır. Bu genetik farklılıkların doğal tip cogongrass ve JBG döner ayırt edebilirsiniz ki geliştirilecek çeşitli spesifik PCR primerleri izin verdi. En güvenilir sonuçları plastid trnL-F bölgede elde edilen primerler gelmiş. Dolayısıyla, bu protokol cogongrass, JBG ve kloroplast genomunun trnL-F bölge ve JBG (Şekil 4) döndürüldü arasındaki farklar dizisi dayanmaktadır.

Söz konusu çeşitlerin daha spesifik primerler oluşturmak yardımcı olmak ve yakından ilgili türler, al yanlış pozitif önlemek içinI. l bilinen trnL-F sekansları cylindrica çeşitleri ile ilgili çimen türleri (29 türünden 43 bağımsız dizileri, örneğin, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-iş buldum, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgum halepense) den trnL-F dizileri ile karşılaştırıldı. Biz çim, çeşitli özel primerlerin özgüllük 29 tür arasında çeşitli spesifik primer dizilerinden araştırılmasına karşın kapsamlı diğer birçok ot türleri DNA çoğaltılması için, yeteneği gidilmemiş. Sonuç olarak, DNA çıkarılması için kullanılan doku dikkatle I. olarak tespit edilmelidir cylindrica önce bu protokol başlangıç ​​için. Çim, sonra cogongrass veya JBG ya olarak tespit edilemiyorsa, biz dizileri cogongrass veya JBG için tam bir eşleşme olduğundan emin olmak için PCR ürünü sıralama öneririz. Şu anda, belirli bir otu numunenin bir kimlik doğrulama en doğru yöntem t her iki PCR gerçekleştirmek için olanRNL-F ve ITS bölgeler, dizisi PCR ürünlerinin doğrulanması ve kesin takson bilinen dizileri dizilerinin karşılaştırılması izledi. DNA kontrolü Bu protokol ayrıntılı primerler (trnL-F bölge için) ya da diğer primerler diğer yayın ^13-15 bu kullanılabilir kullanılarak büyütüldü edilebilir. Sıralama çok daha fazla emek ve basitleştirilmiş usuller kullanılarak daha yoğun bir maliyettir.

PCR için kullanılan primerler kalitesi prosedürün başarısı için kritiktir. Biz Eğik Bio, Inc (edinilebilir Bu prosedür için primerler yaptık http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Eğik Bio gelen primerler sipariş için avantajı bizim laboratuarda optimizasyonu için kullanılan primerler olarak özdeş numune üretimi serisi her astar hacimde çok sayıda depolamak olmasıdır. Sonuç olarak, astar, sadece aynı sıra var, ama t değilhey bu protokolde kullanılan aynı üretim yeri gelir. Aynı partiden primerler kullanılarak, PCR primerleri kalitesinde farklılıklar sonucu olabilir prosedürü gereksiz değişkenler önlemek yardımcı olabilir. Aynı şekilde, diğer Taq polimeraz PCR, kullanılan Taq polimeraz kalitesi için sorunsuz çalışır ise PCR sonuçlarının kalitesi üzerinde bir etkisi olacak. PCR daha iyi tutarlılık sağlamak için, Clontech'in reaktifleri kullanarak protokolü optimize etmiş. Avantaj 2 Polimeraz (Clontech, Mountain View, CA, Kedi # 639.201 veya 639.202) sağlam, sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz karışımı ve yüksek özgüllük ve daha doğru amplifikasyonlar sağlamak için yardımcı olan bir redaksiyon enzimdir.

Bu protokol anneden Otların içinde miras kloroplast DNA dayanır Çünkü cogongrass ve JBG genotipleri arasında hibridizasyon olaylar bizim moleküler tanımlama prosedürü ile çekilmiş olabilir. Hypridization suspe olduğu durumlardacted, biz her iki ebeveyn devralınan nükleer bölgeler kullanmanızı öneririz. Bitki genotipleme dikkate almak en sık kullanılan non-plastid değişken bölgenin nükleer ribozomal ITS bölgesi ^13-15,17 olduğunu. Şu anda, aynı PCR tüpünde nükleer ITS bölgenin bununla kloroplast trnL-F bölgenin amplifikasyonu multiplekslemesi doğru ilerleme kaydedilmektedir. Nükleer DNA bölgeleri ile plastid multiplekslemesi potansiyel olarak tek başına ya kullanma sınırlamaları aşmak olur, ancak bu yöntemlerin ayrı ayrı bir dava üzerinde fizibilite belirlemek için optimizasyon ve ek değerlendirme gerektirir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve bu tür moleküler işaretleri (floresan astar probları), gibi yeni teknolojilerin kullanımı da fail-safe ve doğru bitki genotipleme yöntemler olarak değerlendirilmektedir.

Burada sunulan protokol JBG vahşi tip cogongrass bu gelen geri ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlar. Biz kullanmak teşvikBu protokolün rs Bu protokolün kullanılmasından elde edilen sonuçları rapor etmek bize. Bu paylaşılan bilgi JBG döner dağıtımı hakkında bilgi vermek yardımcı olacaktır. Bu aynı zamanda USDA de düzenleyiciler oldukça invaziv cogongrass çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyon aşmak gerekiyor olabilir eylemler hakkında bilinçli kararlar almanıza yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DNeasy Bitki Mini Kit	Qiagen, Valencia, CA	69104 veya 69.106	Iyi kalitede DNA verir herhangi bir saygın genomik bitki DNA kiti bu işlemler için sorunsuz çalışır.
trnF (GAA)-F	Eğik Bio, Inc	3-0578	İleri pozitif kontrol astar
trnL (5 'ekzon)-C	Eğik Bio, Inc	3-0579	Pozitif kontrol astar Ters
trnLF-C-F1	Eğik Bio, Inc	3-0864	İleri vahşi tip cogongrass astar
trnLF-C-R1	Eğik Bio, Inc	3-0865	Gerivahşi tip cogongrass astar
trnLF-R-F2	Eğik Bio, Inc	3-0866	İleri JBG ve astar dönmek JBG
trnLF-R-R2,	Eğik Bio, Inc	3-0867	JBG ve astar dönmek JBG Ters
Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix	Clontech'in, Mountain View, CA	639125
Avantaj 2 Polimeraz	Clontech'in, Mountain View, CA	639.201 veya 639.202	İyi bir redaksiyon, sıcak-start Taq polimeraz