の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

要約

我々は、葉緑体trnL-Fスペーサー領域内の標的DNA配列の違いがの品種を区別することが、様々な特異的PCRプライマーを採用して費用対効果の迅速な分子タイピングプロトコルを提供チガヤ（cogongrass）単独形態によって区別す​​ることができない。これらの品種は、私は、連邦政府が記載されている有害な雑草、cogongrassと密接に関連する、広く普及し、様々な装飾品が含まれてい。チガヤ VAR。チガヤ（日本人の血草）。

要約

野生型I.チガヤ （cogongrass）は負のアフリカ、アジア、ヨーロッパ、ニュージーランド、オセアニア、南北アメリカ^1月2日を通して73カ国の農業と天然資源に影響を与え、世界のトップ10最悪の侵略的な植物の一つです。 Cogongrassは、ネイティブの植物種の多種多様な変位と順番に飼料及び避難所のための避難ネイティブ植物種に依存する野生動物を脅かす急速に拡散、monodominantスタンドを形成します。問題は、装飾的な様々な[I.に追加するチガヤ VAR。 チガヤ （レツィウス）]が広くチガヤ "ヤマモモ"、レッドバロン ​​、そして日本人の血草（JBG）の名前で市販されている。この品種は、推定される滅菌と非侵襲的であり、その赤い色の葉を観賞望ましいと考えられている。ただし、適切な条件下では、JBGは、実行可能なシードを生成することができます（キャロルHolko、2009私信）と私は緑に戻すことができます。それは野生型の侵襲的な様々な^4（ 図1）の際立った特性を取るように頻繁にcogongrassから区別することはできませんnvasiveフォーム。これはよく訓練された植物分類学者であっても形態に困難なタスクを使用して識別を行います。積極的な緑の表現型にJBGの復帰もまれではありません。コー​​ディングと核と葉緑体DNAの両方の可変領域の配列比較を使用して、我々はJBGは、メリーランド州、サウスカロライナ州とミズーリ州の州内緑の侵襲に戻っていることを確認しています。アクティブcogongrassの侵入がないですJBGは、米国本土ではほぼすべての状態で販売されていると植えられています。よく分かっていないに戻す問題の範囲に戻っ植物は文書化されていないとしばしば破壊されたためです。

この分子プロトコルのアプリケーションが戻り、共起からこれらの品種を保つのを助けることができるJBGを識別する方法を提供するndはおそらくハイブリダイズする。 Cogongrassが嫌気outcrosserであり、異なった遺伝子型と交配する場合、実行可能な生成することができます^5月7日広い長距離cogongrassを広げて種子を風を分散。 JBGはcogongrass若干異なる遺伝子型を持っており、cogongrassで実行可能なハイブリッドを形成することができるかもしれません。問題に追加するには、JBGはcogongrass ^8月10日よりも寒さと寛容な日陰であり、これら2品種間の遺伝子の流れがより積極的であるハイブリッドを生成する可能性がある、野生型cogongrassより丈夫トレラント、冷陰。野生型cogongrassは、現在、東南アジア、米国で世界中で100万490ヘクタール以上をinfestsながらは50万ヘクタール以上infests、それが急速に北上し、その幅広いニッチや地理的な潜在的な^3,7,11のために広がって、米国の大半を占めることができます。遺伝的交差の可能性はUSDA-APHIS連邦有害週間のプログラムのために深刻な懸念である。現在、USDA-APHISは、州WHでJBG禁止しているERE主要なcogongrassの蔓延（例えば、フロリダ州、アラバマ州、ミシシッピ州）があります。 cogongrassとJBG、その分布を拡大しかし、組み合わせから2品種を防止することがより困難に証明することができます。さらに、JBGの配布元に戻すには、現在不明であり、形態を介してこれらの品種を識別する能力なしに、いくつかのcogongrassの蔓延は、JBG戻りの結果であるかもしれません。残念なことに、識別、現在の分子のメソッドは、通常とコストがかかる時間です。どちらもAFLP（増幅断片長多型）と、DNAシークエンシング、依存しています。ここでは、正確にcogongrassとJBG戻す区別する最初の費用対効果と信頼性の高いPCRベースの分子タイピング手法を提案する。

プロトコル

1。標本の収集と保存

この方法は開発され、新鮮な、凍結、最近乾燥した葉組織を用いて試験した。

1. cogongrassおよび/または草種の同定に特化し分類学者の助けを借りて、組織をJBGを識別します。その鮮やかな赤い葉で、観賞用JBGは、視覚的に戻す野生型cogongrassとJBGと区別するのは簡単ですが、cogongrassとJBG戻すには、互いにほとんど区別できません。 CogongrassとJBG戻っ表現型は緑色、長い葉が、かなり大きいと長い地下茎と、JBG ^12（ 図1）より葉面積を持っています。
2. 新鮮な葉組織は、最も豊富な最高品質のDNAを提供し、フィールドまたは温室栽培I.から収集することができますチガヤの植物。新鮮な組織を使用する場合は、劣化を防ぐために、コレクションの3時間以内にDNAを抽出します。それ以外の場合は、ストレージ、keepiのための組織を準備直射日光のngの組織涼しいとアウト。
3. 後日、DNA抽出のための組織を保存するには、最適な方法は、°C、直ちに-80℃で組織を凍結して保存することです。凍結組織は、DNA抽出の前に解凍することはできません。解凍防ぐために、DNA抽出の粉砕工程に先立って、液体窒素中に凍結組織を転送します。
4. -80℃の冷凍庫が利用できない場合は、乾いたティッシュはすぐに。乾式貯蔵のために、紙封筒に組織を配置し、室温で乾燥シリカゲルまたは他のアクティブな乾燥剤でエンベロープを保存します。 シリカは、シリカが完全に脱水し、適しているようになり、非示すと混在インジケーターシリカ少量の植物組織を乾燥させる。
5. 重量新鮮葉組織より少なくとも10倍以上のシリカゲルを使用しています。植物組織は、24時間以内に乾燥する必要があります。DNAの質と量が（押し葉標本の場合のように時間をかけて乾燥貯蔵によっても削減されます。秒）。

2。 DNA抽出

1マイナー変更を加えた、製造元の指示に従って、植物組織からDNAを抽出するために、DNeasy植物ミニキット（カタログ番号69104または69106キアゲン、バレンシア、CA）に従ってください。代わりに、列ごとに提案され、100未満mgの新鮮組織または20未満mgの乾燥組織を使用するのではなく、適切なチューブに（乾燥した組織から、あるいは> 20 mg）を新鮮あるいは凍結組織から100 mgを転送し、100ミリグラム以上のを挽くと、抽出のために。核およびプラスチドDNAが同時に抽出されます。

1. これらの手順を開始する前に、そのエタノールをバッファAP3 / EとAWに追加されたことを確認します。
2. 冷やした乳鉢と乳棒で粉砕して液体窒素3回を使用して微粉末に新鮮あるいは凍結した葉組織（または乾燥した葉組織の> 20 mg）の> 100 mgを挽く。 出発物質の不足の中断や不十分な溶解こともできますDNAの収率が低下につながる。慎重にTISSを挽くUEは、あまりにも多くの組織でカラムをオーバーロードしていません。
3. 新鮮あるいは凍結組織（または乾燥した組織からの粉末20mgの）からバッファAP1の400μlを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに100 mgの凍結粉末を転送するとRNase Aの4μlの各チューブに小さなラックに配置することができますチューブ当たり、組織の正確な重量を監視するためにバランスをとります 。
4. 65℃混ぜ、10分間インキュベートするボルテックスまたは手試料（S）°C、2〜3回インキュベーションの間に反転管（S）。
5. 各サンプルにBuffer AP2の130μlを添加します。反転管（S）数回混和し、氷上で5分間インキュベートする。
6. ピペットでそれぞれ独立したQIAshredderミニスピンカラムにライセートを、2 mlのコレクションチューブ（キットに付属）で各列に配置します。遠心2万XG（〜14,000 rpm）で2分間カラム（s）、および任意の形成されたペレットを中断せずに、各フロースルーを新しいチューブに分（キットには付属しません）に転送します。
7. /バッファAP3の1.5倍量を追加します。E、およびピペッティングにより混合する。
8. 2 mlのコレクションチューブにDNeasyミニスピンカラムに混合物の650μlを転送します。遠心分離は6,000 xgで（〜8,000 rpm）で1分間カラム（s）、およびフロースルーを捨てる。各サンプルの残りの混合物で、この手順を繰り返します。
9. 新しい2 mlコレクションチューブ（S）にスピンカラム（複数可）を配置し、各列の先頭にバッファAW 500μlを加える。遠心分離は6,000 xgで（〜8,000 rpm）で1分間カラム（s）、およびフロースルーを捨てる。
10. 各列の先頭にバッファAWの別の500μlを添加します。 2万XG（〜14,000 rpm）で2分間遠心します。このステップは、このようにPCRを阻害することができるバッファに含まれる残留エタノールを除去し、カラムを乾燥させます。
11. 新しい1.5 mlのマイクロ試料管に各スピンカラムを移します。溶出のために各列の上部に100μlのBuffer AEを追加し、室温で5分間カラム（複数可）をインキュベートします。 DNAを収集するために6000 XG（〜8,000 rpm）で1分間遠心分離カラム（複数可）。
12. これらの溶出は、サンプル200μlを得るために、同じ1.5 mlのマイクロ遠心チューブにDNAを溶出し、1回の手順を繰り返します。使用するまで-20℃でDNAサンプルを格納します。DNA濃度は、組織の種類と保管条件によって異なります。バッファAE200μlの合計でDNAを溶出する際に最適な収量が得られますが、濃度は、溶出ボリュームはわずか50μlに減少している場合は増加することができます。

3。 DNAの質と量の検証

1. 分光光度計または蛍光光度計とゲル電気泳動を用いてPCRをセットアップする前に抽出したDNAの質と量をテストします。これは、後続のステップの成功を確実にするのに役立ちます。
2. 分光光度計、テストDNAの質と量を使用します。優れたDNAの収量は50〜150の間でなければなりません2.0に近い280分の260と280分の230比ng /μLの。例として、 図2は、光度計分光光度計（ThermoScientificを使用して、質の良い結果を示しています。デラウェア州ウィルミントン）。
3. 標準1％アガロースゲルを用いて電気泳動を実施しています。 RNAのコンタミネーションから少し縞（ 図3）を持たない比較的大きなバンド（> 10 KB）の存在を確認してください。
4. DNA濃度が高い場合は、以降の手順は70 ng /μlににDNAサンプルを希釈する。

4。 PCRプライマー

このプロトコルで使用されているPCRプライマーはcogongrassのプラスチドtrnL-Fのスペーサー領域とJBG遺伝子間の配列の違いに基づいています。これらの違いは、一意のシーケンス（ 図4）のサイトでプライマーを配置することによって、様々な特異的プライマーの開発を許可されているSNPの形（一塩基多型）に来るとindelsの（挿入と削除）。

1. プライマーの品質はPCRの結果に大きな影響を持つことができます。評判の良い会社からの注文プライマー。我々は斜バイオ株式会社（から我々のプライマーを注文する唯一の標準的な脱塩手順を要求する:/ / www.obliquebio.com/web/ "ターゲット=" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/、ハンツヴィル、アラバマ州）。
2. trnL-F陽性対照プライマー：このプライマーセットは、ほとんどの草の分類^11月13日のプラスチドtrnL-Fのスペーサー領域を増幅し、良好なポジティブコントロール（890 bpのバンドになる）として機能します。
   

   名	シーケンス
   trnF（GAA）-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL（5 'エクソン）-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. 野生型cogongrassプライマー：このプライマーセットはcogongrassに固有であり、JBGの遺伝子型のtrnL-F領域を増幅していません。 595 bpであり、バンド内の結果セット。
   

   名	SEQuence
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBGとプライマーを元に戻すJBG：このプライマーセットは、遺伝子型をJBGに固有のものであり、cogongrassのtrnL-F領域を増幅していません。 594 bpであり、バンド内の結果セット。
   

   名	シーケンス
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. -20°C、長期に保存することができます100mMのストック溶液を得るためにヌクレアーゼフリーのddH ₂ Oの十分なボリューム内の各プライマーを再懸濁します。
6. PCRのセットアップ手順の前に12 mMの各プライマーストックを希釈する。

5。 PCRのセットアップ

DNA抽出は、PCR反応における上記プライマーセットをそれぞれ用いて増幅されています。すべてのPCR試薬がうまく働いて、バンドを生成することができることを保証するために陽性コントロールが含まれています。試薬のそれないことを確認するための負の制御を含む不要なDNAで汚染されている。 ネガティブコントロールは、テンプレートを含まないとしないバンドの生産になるはずです。

1. サーモブロックと試料との間の優れた熱伝達を可能にするための薄壁PCRチューブ内のすべての反応を準備します。 我々は、汚染を避けるために、市販のエアロゾルフリーピペットチップを使用することをお勧めします。
2. 各単離されたDNAサンプルについては、下記の順序でICEに以下の試薬を加えることにより0.2 mlの薄壁PCRチューブに上記プライマーセットをそれぞれ用いて50μlのPCR反応を設定します。複数のサンプルが用意されている場合は、例外を除いてすべての試薬を含むカクテルを作るDNAテンプレートのすべての反応の間に均一な条件を確立します。
   

   PCR試薬	使用したボリューム	最後のConcetration
   ヌクレアーゼフリーのddH 2 O	40.5μL
   10Xアドバンテージ2 PCRバッファー（クロンテック、CA）	5.0μL	10％（v / v）の
   利点純PCRのdNTPミックス（各10mMの、クロンテック、CA）	1.0μL	0.2mMの
   プライマー1（DDH 2 Oの12μm）の	1.0μL	0.24μM
   プライマー2（DDH 2 Oの12μm）の	1.0μL	0.24μM
   アドバンテージ2ポリメラーゼミックス（Clonetech社、カリフォルニア州）	0.5μL	1％（v / v）の
   DNA抽出（70 / NG反応;必要に応じてのddH 2 Oの音量を調整）	1.0μL	1.4 ng /μlに
   	合計：50.0μL

3. すべてのPCR試薬がうまく機能していることを確認するには、陽性対照プライマーを用いてポジティブコントロールをセットアップします。 このプライマーセットは元に戻すと他の草をJBG、cogongrass、JBGのために同様に動作し、890 bpであるバンドになります。
4. 代わりに、DNAの抽出のddH ₂ Oを使用して、ポジティブコントロールとして設定された同じコントロールプライマーを用いて負の制御を設定します。 すべての試薬 ​​は、DNAは汚染の自由である場合、この反応はないバンドになります。
5. DNA濃度が低い場合は、より多くのDNAは、ヌクレアーゼフリーのddH ₂ Oの量は、50μlの総反応容量をもたらすために使用される調整は、各反応物に添加することができます。DNA以上の5μlの（の10％を使用しないでください。 Rあたりの総容積）eactionは、DNAサンプルに含まれている可能性不純物としてPCR反応を阻害することができる。

6。 PCRサイクリング

1. 以下のPCRサイクルパラメータを使用して加熱蓋付きサーマルサイクラーを装備でPCR増幅を行っています。我々はMastercycleプロSサーモ（エッペンドルフ、ホーポージ、ニューヨーク州）は、標準温度ランプの条件で動作するように設定してください。どのような品質のサーモも実行する必要があります。
   

   サイクル	アニーリング変性	重合
   1	95℃で2分°C
   2	95°Cで30秒	30秒61℃で90秒68°Cで35サイクル
   3		68℃5分°C
   サンプルが削除されるまで4℃で保持する

2. DNAの品質に応じて、必要に応じてPCR（プライマーアニーリング温度、伸長時間、サイクル数を含む）のための条件を最適化し、プライマーは、サーモのTaqポリメラーゼまたは型が使用されます。 我々は最適なを決定する際に、グラデーションが可能なサーマルサイクラーを使用することをお勧めしアニーリング温度。
3. 使用されているサーモは、加熱された蓋を持っていない場合は、PCRサイクル中の蒸発を防ぐために、各サンプルの上にミネラルオイルを1滴を追加します。

7。 PCR産物のゲル電気泳動

独立したPCR産物は、標準的な電気泳動を用いて1％アガロースゲル上で、分析の結果を可視化する。

1. 各増幅PCR産物の5μlを標準的なDNAローディングバッファー2μlの（通常は5倍または6倍溶液）を兼ね備えています。
2. 電子で作られたEtBrを（DNA染色のための臭化エチジウム）を含む1％アガロースゲルにサンプルをロードするither TAEまたはSB（ホウ酸ナトリウム）緩衝液系^16。我々は、100ミリリットル、1％アガロース（0.1μg/ ml）をあたり10 mg / mlのEtBrをストック溶液1μlを使用しています。
3. 染料前面に達するまで〜120Vでサンプルを実行¾ゲルの合計の長さ。
4. UV光（短波長UV光ボックスなど）の下で、適切な断片が増幅されたかどうかを確認するために生じるバンドを点検します。
5. 利用可能な写真ドキュメントシステムやカメラを用いたゲル、その結果バンドを文書化します。

8。代表的な結果

PCR産物を可視化すると、cogongrassはJBGまたは元に戻しJBG（ 図5）のそれに比べてユニークなバンドパターンを持っています。各DNAサンプルについては、trnL-F陽性コントロールプライマーセットは〜890 bpの単一の高強度のバンドになるはずです。これは、すべてのPCR試薬がうまく機能していることを確認します。同様に、ネガティブコントロール（テンプレートなし）反応は、任意のプライマーのためのバンドを含まないようにすべきらは使用されます。これは、試薬のどれが汚染されなかったことを確認します。

DNAサンプルは、野生型cogongrass、JBG特異的プライマーなしのバンドになりつつcogongrass特異的プライマーセットは〜595 bpの単一のバンドになり用いたPCR反応から派生している場合。 DNAサンプルは、JBGから派生した、またはJBG元に戻された場合cogongrass特異的プライマーなしのバンドになりながら、同様に、JBG特異的プライマーセットを用いたPCR反応は、〜594 bpの単一のバンドになります。 JBGとJBGを戻すと、同一の核酸配列を持っているので、それ故に同一のバンドパターンがあります。多くのサンプルが同時にゲル上で比較されるのであれば、我々は、このように、それが容易に肯定的な結果を得るためにサンプルをスキャンするようになって、お互いに隣接し、それぞれのプライマーから派生したすべてのサンプルを実行することをお勧めします。

戻りをJBGとJBGの間に形態的な違いはかなり明らかである（葉とJBの小さい身長の例：赤色 PCRの結果が同じになりながら、G対緑の着色、大きな身長とJBGの積極的な成長戻す）は、そう、JBG品種は、植物の形態を使用して区別するのは簡単です。

図1温室効果の比較成長チガヤ VAR。 チガヤ （日本人の血草）、差し戻しI.チガヤ VAR。 チガヤ （JBG元に戻す）とI.チガヤ （野生型cogongrass）。

図2光度計分光光度計を用いて検証したDNAサンプルの例を示します。にかかわらず、使用される分光光度計、260/280比に近い1.8〜なければならないおよび260/230比が2.0に近いことに注意してください。

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図3 DNAサンプルは、1％アガロースゲル上で標準的なゲル電気泳動を用いて検証した。市販のDNAマーカーのサイズは分析のために使用されていました。レーン＃4はスミアといくつかのRNAのコンタミネーションを示す、質の悪いDNAサンプルの一例です。

図4。 チガヤ VAR。 チガヤ （日本人の血草）のtrnL-F領域の配列アラインメントでは、I.を差し戻しチガヤ VAR。 チガヤ （JBG元に戻す）とI.チガヤ （野生型cogongrass）。黒い縦の矢印は、SNPとindelsのから得られた配列の違いを示しています。水平方向の緑の矢印はcogongrass特異的PCRに使用する野生型cogongrassプライマーの位置を示している。水平方向の赤矢印は、POを示すJBGとJBG-特異的PCRに用いるプライマーを元に戻すJBGの回転位置。

図5。cogongrassから派生したPCR産物のゲル電気泳動の代表的な結果は、JBGとcogongrassとJBG特異的プライマーと同様にtrnL-Fポジティブコントロールとテンプレートなしのネガティブコントロールと組み合わせたDNAサンプルを元に戻すJBG。

ディスカッション

アメリカの保育園や景観産業はエキゾチックで斬新な植物種を栽培し、販売に成功する。貿易の拡大、グローバル化と相まって、これは、侵襲的な植物種は、次のコマンドを入力し確立し、米国では連邦政府の侵襲になる可能性を含めて、頻繁に入手できない情報に依存しているような植物を調節する能力を広がっていく可能性が高くなり、ネイティブと帰化した分類群から正しい分類、遺伝的明瞭。侵略的な植物の知識はしばしば制限されているため、隠された侵襲的な特性を持つインポートされた植物は喜んで彼らだけが私たちの農業と天然資源に侵入することが後で学ぶために導入されました。このプロトコルは、I.に関連付けられているような問題に対処することを目指して正確には、野生型cogongrassとその装飾JBGの相手の元に戻す形を ​​区別できる最初の簡略化の分子のメソッドを提供することによって、 チガヤの品種。

このプロトコルの開発のためjove_content ">は、野生型cogongrassは、2008年6月にジェイ、フロリダ州の近くにサンタローザ郡の池·クリーク森林単位で帰化した集団から採取した。JBGは、商業苗床（ブルーバード保育園、（株）から調達されました。リバー、マサチューセッツ州ユニバーシティパークから2009年6月;）2008年6月に同様にコロンビア州の住宅所有者のコレクションから、MO JBGは2008年6月にクレムソン大学、サウスカロライナ州でキャンベル地質標本館の中庭から得られたが戻り、 2009年にコロンビア、ミズーリにある住宅（リーランドCsekeで識別される）の前庭からすべての工場はハンツビルのアラバマ大学（ハンツヴィル、アラバマ州）に位置する温室で維持した。

これらの植物から採取したDNAの遺伝子配列は、一般的にバーコードの植物²品の独立したDNA領域の深さの比較に含まれています。すべてのケースでは、JBGの配列はこのように助け、JBG戻すのものと100％一致したJBGは確かに緑、侵襲的な形に戻すにはないことを確認してください。唯一の核と葉緑体trnL-Fの領域は、遺伝的にcogongrassとJBGを区別するために使用できる違いがあります。 trnL-Fの領域は、2個のSNPと2 indelsの（挿入および欠失）がありながら、ITS領域は、cogongrassとJBGの間に3個のSNP（一塩基多型）の合計を持っています。これらの遺伝的差異は、野生型cogongrassとJBG戻りを区別することができます開発される様々な特異的PCRプライマーを可能にした。最も信頼性の高い結果がプラスチドtrnL-Fの領域由来のプライマーから来ている。したがって、このプロトコルはcogongrass、JBGの葉緑体ゲノムのtrnL-F領域とJBG（ 図4）元に戻すとの間の配列の違いに基づいています。

問題の種類により具体的なプライマーを生成し、密接に関連する種から偽陽性を避けるために助けるために、アルI. lの知られているtrnL-Fのシーケンスチガヤの品種は、関連する草種（29種から43の独立した配列、 例えば、Cymbopogon citratus、Sorghastrum incompletum、ハトムギハトムギ-jobi、ススキ、サトウキビ、モロコシ ）からtrnL-Fの配列と比較した。 、我々は草、様々な特異的プライマーの特異性の29種を越えて様々な特異的プライマーの配列を調べたが、総合的に他のほとんどの草種からのDNAを増幅する能力について検討されていない。その結果、DNA抽出に使用する組織は、慎重にIとして識別する必要があります前にこのプロトコルを開始するチガヤ 。草がcogongrassまたはJBGのいずれかとして識別できない場合は、我々は、配列がcogongrassまたはJBGと正確に一致することを確認するためにPCR産物をシークエンシングをお勧めします。現在、指定された草の標本の身元を確認するための最も正確な方法は 、tの両方で、PCRを実行することですRNL-FおよびITS領域、配列のPCR産物の確認と正確に識別分類から知られている配列への配列の比較が続く。 DNAは、コントロールは、このプロトコルに詳述プライマー（trnL-Fの領域の場合）または他の出版物^13から15で利用可能な他のプライマーを用いて増幅することができます。シーケンスは、私たちの簡略化の手順を使用してより集中的に多くの労力とコストである。

PCRに用いるプライマーの品質は、プロシージャの成功に不可欠です。我々は斜バイオ株式会社（からこの手順のためのプライマーが利用可能になったhttp://www.obliquebio.com/web/ 、ハンツヴィル、アラバマ州）。斜めバイオからプライマーを注文する利点は、彼らが我々の研究室での最適化に用いたプライマーと同一のサンプルの生産シリーズから、各プライマーのアリコートを大量に格納することです。その結果、プライマーは同じ配列を持っていますが、トンだけでなく、ねえ、このプロトコルで使用されたまったく同じ製造ロットから来ています。同じロットからプライマーを用いて、PCRプライマーの品質の違いから生じるの手順で、余分な変数を避けるのを助けることができます。同様に、他のTaqポリメラーゼはPCR、使用されるTaqポリメラーゼの品質のために正常に動作する必要がありますが、PCRの結果の品質に影響を与えます。 PCR試薬の優れた一貫性を可能にするために、我々は、クロンテックからの試薬を用いてプロトコルを最適化している。アドバンテージ2ポリメラーゼ（クロンテック社、カリフォルニア州マウンテンビュー、カタログ番号639201または639202）は、堅牢なホットスタートTaqポリメラーゼと高い特異性とより正確な増幅を提供するのに役立ちプルーフリーディング酵素の混合物である。

このプロトコルは母性草に継承されている葉緑体DNA、に依存しているため、cogongrassとJBG遺伝子型間のハイブリダイゼーションのイベントは私たちの分子同定の手順でキャプチャすることはできません。 hypridizationがsuspeである場合にCTED、我々は両方の親から継承された核領域を使用することをお勧めします。植物ジェノタイピングする際に考慮すべき最も一般的に使用される非プラスチド可変領域は、核リボソームのITS領域^13-15,17です。現在、我々は同じPCRチューブ内での核ITS領域のそれと葉緑体trnL-F領域の増幅を多重化に向けて前進している。核DNA領域とプラスチド多重化は、潜在的に単独を使用する場合の制限を回避するだろうが、このような方法はケースバイケースで可能性を判断するために最適化し、追加評価が必要になります。定量的リアルタイムPCR（定量PCR）、およびそのような分子ビーコン（蛍光プライマープローブ）、などの新しい技術の使用は、フェイルセーフの正確な植物ジェノタイピング方法として評価されている。

ここで紹介するプロトコルは、JBGは、野生型cogongrassのものから戻す区別するために、高速かつ信頼性の高いアプローチを提供します。我々は、使用を奨励するこのプロトコルのRSは、このプロトコルの使用に関して得られる結果を報告するために私達に連絡する。このような共有される情報は、JBGのディストリビューションに戻りに関する情報を提供するのに役立ちます。これは、USDAでのレギュレータは非常に侵襲的なcogongrass品種の普及と潜在的なハイブリダイゼーションを回避するために必要されるアクションに、情報に基づいて決定を下すのに役立ちます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
DNeasy植物ミニキット	キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州	69104または69106	良い品質のDNAを返す任意の評判の良いゲノム植物DNAキットはこれらの手順については、正常に動作する必要があります。
trnF（GAA）-F	斜めバイオ株式会社	3から0578	前方に陽性対照用プライマー
trnL（5 'エクソン）-C	斜めバイオ株式会社	3から0579	陽性対照プライマーを逆
trnLF-C-F1	斜めバイオ株式会社	3から0864	前方に野生型cogongrassプライマー
trnLF-C-R1	斜めバイオ株式会社	3から0865	逆野生型cogongrassプライマー
trnLF-R-F2	斜めバイオ株式会社	3から0866	フォワードJBGとプライマーを元に戻すJBG
trnLF-R-R2	斜めバイオ株式会社	3から0867	JBGとプライマーを元に戻すJBG逆
利点純PCRのdNTPミックス	Clontech社、カリフォルニア州マウンテンビュー	639125
アドバンテージ2ポリメラーゼ	Clontech社、カリフォルニア州マウンテンビュー	639201または639202	優れたプルーフリーディング、ホットスタートTaqポリメラーゼ