طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

Summary

قطيرة المنصات المرتكزة ميكروفلويديك من المرشحين واعدة للتجارب إنتاجية عالية نظرا لأنها قادرة على توليد بيكو لتر ، ذاتية مجزأة السفن بأسعار غير مكلفة كيلوهرتز. من خلال التكامل مع الأساليب مضان سريع وحساسة وعالية الدقة الطيفية ، يمكن أن كميات كبيرة من المعلومات التي يتم انشاؤها داخل هذه النظم استخراج بكفاءة ، وتسخيرها والاستفادة منها.

Abstract

تطوير منصات ميكروفلويديك لأداء والكيمياء والبيولوجيا في جزء كبير منه كان مدفوعا بمجموعة من الفوائد المحتملة التي تصاحب التصغير النظام. المزايا تشمل القدرة على العملية بكفاءة نانو لfemoto لتر حجم العينة ، والتكامل السهل لمكونات وظيفية ، وهي نزعة ذاتية نحو واسع النطاق المتنوعة ، التي مرت التحليلية المعززة ، وتحسين مراقبة آثار مفيدة مخفضة. ¹

في السنوات الأخيرة الكثير من الاهتمام تركز على تطوير النظم (أو تدفق مجزأة) قطيرة المستندة ميكروفلويديك وإمكاناتهم ومنصات عالية الإنتاجية في التجريب. ^2-4 هنا مصنوعة المياه في النفط المستحلبات لتشكيل تلقائيا في قنوات ميكروفلويديك نتيجة لعدم الاستقرار الشعري بين المرحلتين إمتزاج. الأهم ، يمكن إنشاء microdroplets كميات محددة بدقة والتراكيب بتردداتمن عدة كيلو هرتز. وعلاوة على ذلك ، عن طريق التغليف الكواشف المصالح داخل المقصورات المعزولة مفصولة مرحلة إمتزاج مستمرة ، سواء عبر عينة نقاش والتشتت (نشر ومقرها تايلور) يمكن القضاء عليها ، الأمر الذي يؤدي إلى الحد الأدنى من التلوث المتبادل والقدرة على العمليات التحليلية الوقت بدقة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، لأنه ليس هناك أي اتصال بين محتويات قطرات وجدران القناة (وهي المرحلة التي ترطب مستمر) يمنع امتصاص الخسائر والكواشف على جدران القناة.

مرة واحدة وقد تم إنشاؤها قطرات من هذا النوع ومعالجتها ، فمن الضروري لاستخراج المعلومات المطلوبة التحليلية. في هذا الصدد على طريقة الكشف عن الاختيار يجب أن يكون سريعا ، وتوفير ذات حساسية عالية ومنخفضة من حدود الكشف ، وتكون قابلة للتطبيق لمجموعة من الأنواع الجزيئية ، وتكون غير المدمرة وتكون قادرة على أن تكون متكاملة مع أجهزة ميكروفلويديك بطريقة سهلة. لمعالجة هذه الحاجة كما طورناuite من الأدوات التجريبية والبروتوكولات التي تمكن من استخراج كميات كبيرة من المعلومات photophysical من بيئات صغيرة الحجم وقابلة للتطبيق لتحليل مجموعة واسعة من المعلمات ، والفيزيائية والكيميائية والبيولوجية. هنا يتم تقديم مثالين من هذه الأساليب وتطبيقها على الكشف عن خلايا واحدة ورسم خرائط لعمليات الخلط داخل قطرات بيكو لتر الحجم. نحن تقرير كامل العملية التجريبية بما في ذلك تصنيع رقائق ميكروفلويديك والبصرية والإعداد لعملية توليد الحبرية والكشف.

Protocol

1. رقاقة تلفيق

1. SU8 الرئيسي تلفيق.
   للحصول على قنوات ميكروفلويديك من ارتفاع 40 ميكرون ، ومعطف تدور SU8 - 50 (MicroChem كورب) على رقاقة سيليكون في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. خبز لينة على طبق الساخنة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 30 دقائق حتى تتبخر المذيبات وdensify الفيلم. بعد تهدئة ، تعرض SU8 مقاومة الإشعاع مع 360-440 نانومتر في 300 إم جي / ² تحت القناع المناسب. بعد التعرض ، خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. بعد التبريد ، وتطوير المناطق غير معلن (EC Micrpoposit المذيبات ، Chestech) لمدة 5 دقائق ، مع التحريك. ⁵ استخدام الطازجة EC مذيب لشطف رقاقة ثم جففه تحت غاز لتوليد سطح نظيف. علاج الرقاقة مع يغسل الهكسان والميثانول. استكمال عملية تصنيع رئيسية SU8 مع الخطوة الأخيرة من تبخر ثلاثي كلورو (1،1،2،2 - perfluoocytl) سيلاني على سطح (في المجفف لمدة 40 دقيقة).
2. PDMS curinز ، التكعيب وثقبها.
   لتشكل ركائز ميكروفلويديك منظم ، ونحن مزيج Sylgard 184 (داو كورنينج) في نسبة (ث / ث) 10:01 من الراتنج لcrosslinker ثم صب على الماجستير. ديغا في مجفف ، ومن ثم علاج الجهاز (الطبقة العليا) لمدة ساعة عند 65 درجة مئوية. قطع PDMS الشفاء وقشر تشغيله الرئيسية. إنشاء الثقوب وصول أنابيب fluidic به لكمة خزعة. علاج طبقة أخرى من PDMS (8 غرام من راتنج موزعة بالتساوي في طبق بيتري 10x10 سم) لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. وضع طبقة عليا في إعداد الطبقة السفلية ثم علاج بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. قشر رقائق من صحن بيتري والزهر للاستخدام.

2. الإعداد التجريبية

1. ميكروفلويديك الإعداد
   1. ملء المحاقن (البلاستيك أو الزجاج من بيكتون وديكنسون والشركة أو من العلوم التحليلية شركة سوسيتيه جنرال) مع الحلول المطلوبة ، وضمان عدم فقاعات الهواء البقاء في أي جزء من الأنبوب. لتوليد الحبرية تستخدم مرحلتين. ومائي (تفرقوا) phasه يحتوي على الكواشف من الفائدة (على سبيل المثال تعليق من الخلايا في النمو متوسطة ، أو إيجاد حل لfluorophores الجزيئي). ويتكون عموما من مرحلة النفط ، وهو في هذه الحالة بمثابة مرحلة مستمرة ، من خليط من النفط والسطحي ، السطحي مثل Raindance 2 ٪ (RainDance تكنولوجيز) في مجال النفط المفلورة (3M Fluorinert السائل الالكترونية FC - 40) ، أو 2 ٪ تمتد 80 (Croda) في الزيوت المعدنية.
   2. تناسب أنابيب (أنابيب البولي إثيلين ، جهاز هارفارد) قطرها الداخلي نفس نصائح إبرة حقنة واحدة على نهاية إلى الإبر. يجب قطع الأنابيب لمدة أقصر وقت ممكن للحد من عدم الاستقرار بسبب الاضطرابات تدفق الذبذبات.
   3. ربط نهايات أخرى من الأنابيب مباشرة إلى ثقبا في الركيزة PDMS. ويمكن أيضا إيجاد حلول أكثر تعقيدا ، مثل استخدام الموانئ السيليكا الشعرية أو الموصلات (مثل Nanoports أبتشيرتش) أن تنفذ لواجهة أكثر قوة بين الجهاز ميكروفلويديك والأنابيب و. ربط مأخذميناء الرقاقة لأنابيب ومباشرة الى جامع (لجمع النفايات ، أو مزيد من المعالجة الحليلة).
   4. تركيب مضخة الحقن على حقنة (مثل مضخات Hpsi الدكتوراه 4400 حقنة للبرمجة ، جهاز هارفارد) ، وتحديد المطلوب غرس معدل التدفق لكل مرحلة (عادة بناء على أمر من microliters في الدقيقة الواحدة). ينصح نسبة الحد الأدنى من النفط / مائي معدلات التدفق من 1 إلى تفادي ترطيب للPDMS من المرحلة المائية ، التي من شأنها أن تؤدي إلى تشكيل الحبرية غير مستقرة (اعتمادا على هندسة الجهاز). للسبب نفسه ، فمن المستحسن أيضا أن الدفقة الأولى للمرحلة النفط وحده ، من خلال أي قنوات ميكروفلويديك ، قبل إدخال المرحلة المائية. ويتضح من الإعداد النهائي لهذه الوثيقة تستخدم في التجارب 2A الشكل.
2. إعداد النظام البصري
   1. للتحقيق في أحجام صغيرة (تصل إلى picoliters قليلة) داخل قنوات ميكروفلويديك مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية استخدام المجهر مبائر (مع الآليإد القدرة المواقع submicron).
   2. استخدام المياه للذوبان جزيئات الفلورسنت ذات العوائد العالية الكم مثالي. إثارة الجزيئات باستخدام الليزر تعمل في الطول الموجي الذي يطابق استيعاب fluorophore المعنية. على سبيل المثال ، يمكن أن جزيئات الفلورسنت الشائعة مثل فلوريسئين 5 ثيوسيانات (FITC) واليكسا - 488 فلور متحمس بكفاءة باستخدام ليزر ديود 488 نانومتر (على سبيل المثال PicoQuant GMBH ، LDH - PC - 485). يمكن أن تكون جزيئات الفلورسنت ، مثل الأحمر أو Allophycocyanin تكساس (APC) خرجت بكفاءة على 633 نانومتر وباستخدام / ني ليزر (مثل نيوبورت R - 31425).
   3. استخدام ليزر نابض العاملة على معدلات الرسوب من عدة ميغاهيرتز (مع العديد من الفواصل نبض نانوثانية) وfluorophores مع خصائص متباينة حياته بما فيه الكفاية لتصوير مدى الحياة الإسفار (فليم) التجارب.
   4. استخدام الحزم توجيه المرايا والبصريات في السيطرة على ارتفاع شعاع فضلا عن اتجاه الشعاع.
   5. استخدام مزدوج اللون مرآة تعكس أشعة الليزر إلى الهدف لENS. إذا تم استخدام اثنين الليزر في نفس الوقت ، يمكن تثبيت شريط مزدوج اللون المزدوج للسماح للمرآة تعكس أشعة الليزر اثنين (مثلا الحزم نانومتر 488 و 633 مرآة z488/633rdc من شركة التكنولوجيا كروما ومثالية).
   6. تستخدم لتصحيح ما لا نهاية ، والفتحة العددية عالية (NA) هدف المجهر (أي 60 × أوليمبوس / 1.2 غ ، غمر الماء) لجعل ضوء الليزر إلى التركيز ضيقة داخل قناة ميكروفلويديك. ويجب عند العمل مع microchannels طويل القامة (> 100 ميكرون) أن يكون الهدف المحدد يستخدم بشكل مناسب لضمان أن يغطي مسافة عملها بفعالية ارتفاع الكامل للمتناهية.
   7. جمع مضان المنبعثة من عينة (داخل قناة ميكروفلويديك) باستخدام نفس الهدف NA العالية والتي تنتقل عن طريق مرآة مزدوج اللون نفسه.
   8. إزالة أي ضوء الإثارة المتبقية باستخدام واحدة أو مزدوجة النطاق الانبعاثات التصفية (مثل تصفية z488/633 من شركة التكنولوجيا كروما).
   9. تركيز emissio مضانن على 75 ميكرومتر ثقب صغير باستخدام عدسة محدبة ، بلانو (+50.2 F مثلا ؛ نيوبورت المحدودة). موقف الثقب في الطائرة مبائر الهدف المجهر.
   10. استخدام مزدوج اللون مرآة أخرى (مثل 630dcxr ، كروما وتكنولوجي كوربوريشن) لتقسيم إشارة الفلورسنت على اثنين كاشفات.
   11. تصفية مضان التي تعكسها المرآة مزدوج اللون مع مرشح الانبعاثات (مثلا hq540/80 متر من تصفية شركة كروما والتكنولوجيا) والتركيز عليه مع عدسة محدبة ، بلانو (على سبيل المثال و = 30.0 ، 25.4 مم معرف ، Thorlabs) على الأول ( 'الخضراء') كاشف. عن التجارب التي تنطوي على fluorophore الثانوية الحمراء تصفية مضان المنقولة بواسطة المرآة مزدوج اللون مع مرشح آخر من الانبعاثات (مثل عامل تصفية hq640lp من كروما تكنولوجي كوربوريشن) ثم التركيز عليه مع آخر بلانو عدسة محدبة على كاشف ('أحمر') الثاني.
   12. استخدام photodiodes سيل (مثل عقر - 141 ، EG & G ، بيركن ، إلمر) للكشف عن الفوتونات مضان. ويتجلى في الإعداد النهائي الشكل 2B.

3. قطيرة توليد والحصول على البيانات

1. أساليب الجيل الحبرية
   1. يمكنك استخدام اثنين من التشكيلات الرئيسية لتوليد microchannels قطرات : تدفق التركيز أو تي تقاطع الشكل (الشكل 3A و 3B) ^6،7 كلا الأسلوبين تعادل طالما شكلت قطرات واسعة مثل متناهية نفسها. نتيجة لقوى القص التي تنشأ من استخدام هذه هندستها لجلب السوائل إمتزاج two معا وعدم الاستقرار الشعرية اللاحقة التي تضع في الواجهة ، يتم إنشاء قطرات monodisperse (صغيرة مثل femtoliters قليلة) من تلقاء أنفسهم.
   2. يمكنك تغليف الكواشف بطرق مختلفة : يمكن تحضير الكواشف والمختلط قبالة رقاقة إلى الخليط المطلوب / التركيز ، أو يمكن أن يقدموا على حدة في رقاقة ثم مجتمعة قبل تشكيل الحبرية (الشكل 3C). هذاالأسلوب الأخير ينص على درجة أعلى من المرونة حيث يمكن تعديل الخلائط / تركيزات ضبط ببساطة نسبية تدفق أسعار الفائدة. لوحظ أن لتغليف الخلايا ، ينبغي أثار تعليق خلية في حقنة لتجنب تكاثف للخلايا على مدى الزمني للتجربة.
2. مضان الحصول على البيانات.
   1. الزوجان إشارة الإلكترونية من الانهيار كاشف الضوئي (الموصوفة في 2.2.12) إلى جهاز متعدد الوظائف دق لتسجيل البيانات (مثل PCI 6602 ، صكوك الوطنية) ، التي تعمل على جهاز كمبيوتر شخصي.
   2. فليم للتجارب ربط كاشفات إلى العد الزمني مربوط فوتون واحد (TCSPC) بطاقة (على سبيل المثال TimeHarp 100 ، PicoQuant محدودة) يعمل على جهاز كمبيوتر منفصل. هذه البطاقة تتيح للبيانات عمر مضان التي يمكن الحصول عليها باستخدام منهجية TCSPC : يرتبط كل فوتون الكشف الفلوري إلى حادثة نبضة ليزر ، وبالتالي يتم تعيين كل الفوتون المنبعث الفلورسنت فترة تأخير. هذه البياناتيمكن تركيبها على منحنى الاضمحلال الأسي واحدة أو متعددة ، للحصول على تقدير معامل fluorophore / ثانية معدل الإشعاعي / ثانية. Deconvolute البيانات الأولية مع صك الدالة الاستجابة (IRF) للكاشف : يتم الحصول على ذلك باستخدام تركيز منخفض Auramine - O الحل (الذي يعرض حياته مضان من picoseconds قليلة) ^8.

4. التعرف على الخلية ورسم الخرائط من خلال مزج قطرات

1. التعرف على الخلية ورسم الخرائط من خلال مزج قطرات
   1. استخدام كولاي الأعلى 10 سلالة من أجل بقاء التجربة مقايسة. ثقافة الخلايا في لوريا ، وبين عشية وضحاها Bertani مرق المباراة كثافة ضوئية الى 0.5 قبل التجارب.
   2. استخدام 0.4 ميكرومتر SYTO9 و 1 ميكرومتر يوديد propidium للكشف عن مدى صلاحية الخلايا. كلاهما الحمض النووي الإقحام الأصباغ وحدتها مضان يزيد بنسبة تزيد على 20 أضعاف عند ملزمة لالحمض النووي. SYTO9 هو صبغة الفلورسنت الأخضر الذي هو أناmbrane نفاذة ويوديد propidium هو صبغ أحمر فلوري وهو غشاء كتيم. وهكذا الخلايا الحية يتألق "الخضراء" في حين يحمل كل الخلايا الميتة "الخضراء" و "الحمراء" الانبعاثات.
   3. استخدام الإعداد المقدمة في 2.2) للكشف عن مضان أخضر / أحمر.
   4. استخدام المحمول ، مصغرة النمام المغناطيسي (يوتا وقود الديزل الحيوي التموين ، ويوتا) لتحريك تعليق خلية داخل حقنة 3mL plastipak دينار بحريني مزودة بقضيب مغناطيسي 7mm لمنع الترسيب الخلية.
2. رسم خرائط لأحداث خلط به فليم
   1. تركيز وحدة التخزين الضوئية في تحقيق ارتفاع نصف طول متناهية التي تتدفق قطرات.
   2. قطرات شكل من اثنين من المحاليل المائية (كما في الشكل 3C) ، تحتوي على كل fluorophore (غير المتفاعلة) مع أعمار مختلفة الفلورسنت مميزة.
   3. بداية من جانب واحد من قناة ، تنفيذ كل تجربة على طول كامل عرض القناة على فترات ميكرون 1. القناة إدويمكن التعرف عليها بسهولة كما غيس كثافة مضان يسقط مرة واحدة بشكل كبير وتركز شعاع الليزر في قربها.
   4. تنفيذ خوارزمية لرشقات نارية التفريق إشارة (المرتبطة قطرات) من الضوضاء الخلفية للمرحلة النفط وإقامة مدة كل انفجار.
   5. تنفيذ خوارزمية الثانية لاستخراج وقت التأخير وقيم الكثافة على طول كل قطرة في عرض خاص حيث أجريت التجربة من ⁹
   6. ثم استخدام مقدر الأرجحية القصوى (MLE) خوارزمية لتقييم مدى الحياة مضان لكل قطرة في التجربة. ⁸ متوسط ​​قيم مدى الحياة لجميع قطرات في التجربة ، ويقلل من الخطأ النهائي لحساب MLE (أكثر قطرات بحث و أصغر والخطأ).
   7. بمجرد الحصول على مسار حياته من أجل كل عرض ، والجمع بين جميع المسارات في خريطة 2D. منذ يرتبط كل قيمة الحياة مع particuلار خليط من fluorophores اثنين يمكن ، وبالتالي تركيز (أو خلط) يمكن الحصول على الخريطة.
   8. اختياريا ، يمكن أن خريطة 3D خلط الحبرية الحصول عليها بسهولة عن طريق تكرار هذا البروتوكول على مواقع مختلفة على طول ذروة قناة ميكروفلويديك.

5. تحليل البيانات

1. إعادة تفسير التجريبية ملفات البيانات الخام إلى لغة الحوسبة الملائمة بحيث يمكن حللوها أخرى (مثل الملفات النصية التي تحتوي على اختلاف التهم الفوتون مع مرور الوقت ، يمكن استخراجها بسهولة في مطلب لمعالجة البيانات وتحليلها). قد يكون لديك لكتابة رموز معينة من أجل الوصول إلى البيانات الواردة في ملفات أكثر تعقيدا من التجارب (مثل تلك التي لفليم) أو من أجل تشغيل خوارزميات MLE أو بناء خرائط لأنماط 2D خلط المسارات من العمر.

6. ممثل النتائج

خلية الاعتراف

أمثلة نموذجية للفاروترد ينتقم من التهم الفوتون بوصفها وظيفة من الوقت للتجارب خلية القاعدة في 4A الأرقام وج ، على مدى فترة من 200 ميلي ثانية. الأهم من مرق لوريا ، Bertani (وسط LB) بمثابة خلفية ضعيفة الاستشعاع تحديد حدود القطيرات المائية ، في حين رشقات نارية الفوتون متميزة ، المقابلة لوجود الخلايا الفردية ، ويمكن تمييز على رأس هذه الخلفية. وتتميز خلفية LB الفلورسنت من قبل شريحة مستطيلة الشكل تقريبا (تميزت الخطوط المنقطة الحمراء والخضراء).

العرض الكامل النصف كحد أقصى (FWHM) رشقات نارية من الفلورسنت الناشئة عن E. خلايا القولونية هو 30 أضعاف أقصر من الأحداث الحبرية الخلفية ، وهو ما يتسق مع الطول النسبي من قطرات (40 ميكرون ، المقابلة لحجم picolitres 30) وهاء خلايا القولونية (1،5-2،0 ميكرون) ¹⁰

مع قناة مزدوجة كشفويمكن تمييز أيون النظام ، وجود خلايا حية أو الخلايا الميتة من تحليل للقنوات خضراء وحمراء. الشكلان 4 (ب) و د تبين التوزيع الاحتمالي واصفا عددا من الخلايا في الحبرية.

رسم خرائط لأحداث خلط به فليم

عمر مضان الجزيئية هي الخاصية الجوهرية لfluorophore الفردية التي تتأثر فقط من خلال بيئة الكيميائية. ويمكن تبعا لذلك يمكن استخدام قياسات من أجل الحصول على المعلومات البيئية (مثل درجة الحموضة الحل ، درجة الحرارة ، واللزوجة قطبية) مع دقة فائقة ودقة من القياسات الوقت مضان المتكاملة ، والتي تعتمد على عوامل التجريبية (مثل التركيز ، وشدة الإثارة ، وجمع البصرية الكفاءة). ^9،11

كما عرضت في مكان آخر ⁽⁸⁾ ، فمن الممكن لتعيين أنماط الاختلاط داخل قطرات باستخدام اثنين fluorophores مع ديقيم عمر fferent. في مزيج يحتوي على اثنين (غير المتفاعلة) الأنواع الفلورسنت واضمحلال تأخذ على شكل biexponential كما هو مبين في المعادلة 1 :

يتم تعريف عمر الفرد هو τ1 وτ2 ؛ ونظرا لاتساع كل مكون من قبل α1 وα2 على التوالي. ويمكن بعد ذلك أن متوسط ​​عمر محدد على النحو التالي :

حيث β1 وβ2 هي جزء من كل مكون ويتم تعريفها على النحو التالي :

منذ أن تم إصلاح حجم قطرات التحقيق وتتدفق عبر هذا الموقف ، وهو مسار من عمر القيم على طول قطرات في ذلك عرض خاص يمكن الحصول عليها الآن. مسار مميزة لعرض خاص ، averagويمكن ملاحظة إد بين قطرات 6000 ، في الشكل 5A.

الجمع بين المسارات في جميع أنحاء كامل عرض القناة يؤدي إلى تشكيل تركيز 2D (أو خلط) الخريطة. وتعرض نتيجة نموذجية في الشكل 5B.

عن طريق حساب متوسط ​​النتائج بين عدد كبير من قطرات ، ويمكن أن يكون الخطأ المعياري للنتائج التي تم الحصول عليها تقلص إلى حد كبير (1 ٪ من الخطأ القياسي مع فاصل الثقة 95 ٪ لل5A الشكل). طريقة تحديد مسار حياته يفترض أن كل قطرات متطابقة تقريبا. وقد ثبت أن هذا صحيح إلى حد كبير لسببين رئيسيين : إذا كانت قطرات مختلفة بشكل ملحوظ ، وبلغ متوسط ​​عمر المسارات التي تم الحصول عليها سيكون أكثر انبساطا ، وأقل ملامح متباينة (وجود خلافات حادة في حياته على طول قطرات متوسط ​​يتم الكشف عنها على الدوام). وعلاوة على ذلك ، فإن النتائج هي تكرار بغض النظر عن الفردتحليل قطرات أو كمية قطرات المستخدمة في العمليات الحسابية. ⁸

عملية تدفق الرقم 1. على تصنيع رقائق ميكروفلويديك.

الشكل 2 رسم تخطيطي) الذي يمثل مضخات الحقن والمحاقن ، متصلا رقاقة ميكروفلويديك لتشكيل الحبرية ؛ ب) التمثيل التخطيطي للإعداد بصري نموذجي ليزر 2-2 fluorophore (الأخضر والأحمر) ، والكشف عن الإثارة. DC = مرآة مزدوج اللون ، EM = الانبعاثات التصفية ، L = لنس ، PH = ثقب الدبوس ، APD الضوئي أفالانش = كاشف.

الشكل 3 في رقاقة استراتيجيات تشكيل الحبرية : أ) تدفق تركيز التكوين ؛ ب) T - مفترق التكوين. ج) وفي التغليف في رقاقة الدكتورoplets الكواشف two مائي منفصلة أصلا.

الشكل 4 قراءة البصرية للآثار 0.2 المسجلة ليالي (أ) قتيلا و (ج) الخلايا الحية (معدلات تدفق لتعليق الخلية : 1 دقيقة ميكرولتر ^-1 ، والنفط : 2 دقيقة ميكرولتر ^-1). كل إشارة مقوس يناظر المتوسطة LB الفلورسنت ضعيف التي تشكل قطرات مائية ، مع حدود الحبرية ملحوظ مع الخطوط المتقطعة. إشارات خضراء تمثل قراءة الاشارات تحت الحمراء 633nm وأكثر من 633 نانومتر موجات. وتتميز الخلايا الارتفاع الرأسي الناجمة عن الحمض النووي الأصباغ الإقحام. التوزيع الاحتمالي لشغل الخلوية داخل قطرات واحد ل (ب) الخلايا الميتة و (د) الخلايا الحية.

الشكل 5 أ) متوسط ​​العمر مسار نموذجي على طول قطرة في عرض خاص ؛ ب)بحث تمثيل نموذجي من مزيج من جميع المسارات في المتوسط ​​على طول العرض الكامل للقطيرات في حياته 2D (أو الاعتقال ، كما أعرب عن STR - AF488 FITC / ٪) الخريطة.

Discussion

وقد وصفت نحن تصنيع جهاز ميكروفلويديك ، والإعداد التجريبية والبروتوكولات المرتبطة بها لتشكيل microdroplet والتغليف كاشف وكشف بصري من قطرات معالجتها. والمثالان مختارة (الكشف عن خلايا واحدة في قطرات ورسم خرائط لعمليات الخلط داخل قطرات ينساب) تمثل التطبيقات الشائعة التي يجري التحقيق مع على microfluidics الحبرية.

كما عرضت تجارب لتوضيح ، واستخدام منصات ميكروفلويديك الحبرية الحاضر خصائص جذابة معينة ، مثل إنتاجية عالية ، والحبس شبه الكمال ، واستنساخ عالية... وكمية كبيرة من المعلومات المنتجة وسرعة عالية في الذي يجري إنشاؤه على هذه المعلومات ، رغم ذلك ، تتطلب استخدام طرق الكشف السريع للقرار spatiotemporal عالية إذا كان هو الاستفادة الكاملة التي يمكن الحصول عليها من هذه المنصات المنمنمة. في هذه الحالة علينا أن نظهر أن هذا هومن الممكن استخدام تقنيات عالية الدقة الطيفية الفلورية. على وجه الخصوص ، تقنية الكشف عن فليم (والذي يجعل من استخدام ليزر نابض مع تكرار فترات قصيرة باعتبارها نانوثانية قليلة) يكشف عن القدرة على الحصول على معلومات سريعة جدا من قطرات المتدفقة بسرعة (من نحو 200 في الثانية الواحدة). في هذه الحالة كان القرار وقت الكشف عن الأحداث منخفضة مثل 1 ميكروثانية. من حيث الحدود في حجم القطيرات والتركيز ، فإن استخدام العدسات ذات الفتحة العددية الأكبر والليزر أكبر قوة تسمح بسهولة الكشف عن تركيزات نانومتر داخل قطرات صغيرة مثل 5 ميكرون (يتم فرض قيود على حجم قطرات من قرارات الطباعة بصفائح معدة ضوئيا وعملية التصنيع من مرحلة submicron تحديد المواقع).

قطرات ميكروفلويديك المرشحين المثالي للقيام بعمليات واسعة النطاق تشمل التجارب كميات صغيرة من المواد الكاشفة ، وصولا الى هدف واحد / الحدث. القيود الحالية لهذه التكنولوجيا تنطوي على صعوبة لتوليد الدكتورoplets من مجموعة كبيرة ومتنوعة (عشرات أو مئات) من مصادر مختلفة على نحو الإنتاجية العالية. بالإضافة إلى ذلك ، صعوبة في التعامل مع كل هدف واحد ولدت الحبرية يفرض قيودا شديدة على التطبيق العملي لهذه التقنيات. ولذلك ، فإن هذه القضايا هي في صلب الجهود البحثية الهامة التي تهدف إلى تطوير الحلول التكنولوجية اللازمة التي ستمكن منصات الحبرية ميكروفلويديك لتصبح وسيلة مرجعية معيارية للبحث والتحليل في التطبيقات الإنتاجية العالية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	نوع	شركة	فهرس العدد
فلوريسئين 5 ثيوسيانات (FITC)	الكاشف	سيغما الدريخ	F3651
Streptavidin اليكسا فلور - 488	الكاشف	المسابر الجزيئية	S11223
Perfluorodecalin	الكاشف	سيغما الدريخ	P9900
1H ، 1H ، 2H ، 2H - perfluorooctanol	الكاشف	سيغما الدريخ	370533
Sylgard الاستومر سيليكون 184 طقم	الكاشف	رئيس وزراء المملكة المتحدة المحدودة Farnell	1673921
auramine - O	الكاشف	سيغما الدريخ	861030
نابض 485 نانومتر ليزر ديود	معدات	PicoQuant	LDH - PC - 485
بطاقة TCSPC	معدات	PicoQuant	TimeHarp 100
مزدوج اللون المرآة	معدات	صفاء شركة تكنولوجيا	z488rdc ،
الهدف المجهر	معدات	اوليمبوس	UPLSAPO 60XW
انهيار جليدى الضوئي	معدات	عقر - 141 ، EG & G ، بيركن ، إلمر).	عقر - 141
DMEM	الكاشف	Invitrogen	ABCD1234
SYTO9	الكاشف	Invitrogen	S34854
Propidium التأيد	الكاشف	Invitrogen	P3566
كولاي أعلى 10 سلالة	الخلايا	Invitrogen	C4040 - 10