Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Riepilogo

Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Abstract

Lo sviluppo di piattaforme microfluidica per l'esecuzione di chimica e la biologia è in gran parte stata guidata da una serie di potenziali benefici che accompagnano la miniaturizzazione del sistema. I vantaggi includono la capacità di elaborare in modo efficiente nano-to femoto litri volumi di campione, l'integrazione facile di componenti funzionali, una predisposizione intrinseca verso la grande scala multiplexing, maggiore velocità di analisi, un miglior controllo e ridotta impronta strumentale ^1.

Negli ultimi anni molto interesse si è concentrato sullo sviluppo di goccia-based (o flusso segmentato) sistemi microfluidica e il loro potenziale come piattaforme in high-throughput di sperimentazione. ^2-4 Qui l'acqua in olio emulsioni sono fatti per formarsi spontaneamente nei canali microfluidica a seguito di instabilità capillare tra le due fasi immiscibili. Importante, microgocce di volumi ben definiti e composizioni possono essere generati a frequenzedi parecchi kHz. Inoltre, incapsulando i reagenti di interesse all'interno di compartimenti stagni separati da una fase continua immiscibili, sia del campione cross-talk e la dispersione (diffusione e Taylor-based) può essere eliminato, che porta alla minima contaminazione incrociata e la possibilità di processi in tempo di analisi con grande accuratezza. Inoltre, poiché non vi è alcun contatto tra il contenuto delle goccioline e le pareti del canale (che sono bagnate dalla fase continua), l'assorbimento e la perdita di reagenti sui muri canale è impedito.

Una volta che le goccioline di questo tipo sono state prodotte ed elaborate, è necessario estrarre le informazioni richieste analitiche. In questo senso il metodo di rilevazione di scelta deve essere rapida, forniscono ad alta sensibilità e bassi limiti di rilevabilità, applicabile a una vasta gamma di specie molecolari, essere non distruttiva ed essere in grado di essere integrato con dispositivi microfluidici in maniera facile. Per rispondere a questa esigenza abbiamo sviluppato comeuite di strumenti sperimentali e protocolli che permettono l'estrazione di grandi quantità di informazioni fotofisiche da piccoli volumi degli ambienti, e sono applicabili per l'analisi di una vasta gamma di parametri fisici, chimici e biologici. Qui due esempi di questi metodi sono presentati e applicati alla rilevazione di singole cellule e la mappatura dei processi di miscelazione all'interno picolitri volumi goccioline. Riportiamo l'intero processo di fabbricazione di chip sperimentali, tra cui microfluidica, la configurazione ottica e il processo di generazione delle gocce e la rilevazione.

Protocollo

1. Microchip fabbricazione

1. SU8 maestro fabbricazione.
   Per ottenere i canali microfluidica altezza di 40 micron, cappotto di spin SU8-50 (MicroChem Corp.) su un wafer di silicio a 3000 rpm per 30 s. Cuocere morbido su un piatto caldo a 65 ° C per 5 minuti e 95 ° C per 30 minuti per far evaporare il solvente e densificare il film. Dopo il raffreddamento, esporre il SU8 resistere con radiazioni 360-440 nm a 300 mJ / ² sotto la maschera appropriata. Dopo l'esposizione, cuocere il wafer a 65 ° C per 2 minuti e 95 ° C per 4 minuti. Dopo il raffreddamento, sviluppare le aree non esposte (CE Micrpoposit solvente, Chestech) per 5 minuti, mescolando. ⁵ Utilizzare fresca solvente per sciacquare il wafer e poi asciugatelo con il gas per generare una superficie pulita CE. Trattare il wafer con lavaggi esano e metanolo. Completare il processo di fabbricazione SU8 maestro con una fase finale di evaporazione tricloro (1,1,2,2-perfluoocytl) silano sulla superficie (in un essiccatore per 40 minuti).
2. PDMS Curing, dadi e la foratura.
   A forma strutturata substrati microfluidica, mescoliamo Sylgard 184 (Dow Corning) in una (w / w) rapporto 10:1 di resina a reticolante e poi versarvi sopra il maestro. Degas in un essiccatore, e poi curare il dispositivo (strato superiore) per un'ora a 65 ° C. Tagliare il curato PDMS e staccatelo il maestro. Creare fori di accesso per i tubi fluidica utilizza una biopsia. Curare un altro strato di PDMS (8 g di resina uniformemente diffuso in un piatto 10x10 centimetri Petri) per 20 minuti a 65 ° C. Posizionare lo strato preparato in alto sullo strato di fondo e poi curare tutta la notte a 65 ° C. Sbucciare le fiches dal piatto di Petri e dadi per l'uso.

2. Setup sperimentale

1. Configurazione Microfluidic
   1. Riempire le siringhe (plastica o vetro da Beckton, Dickinson and Company o da SGE Analytical Science) con le soluzioni necessarie, garantendo l'assenza di bolle d'aria restano in ogni parte del tubo. Per la generazione delle gocce due fasi vengono utilizzati. La soluzione acquosa (dispersa) PHAe contiene i reagenti di interesse (ad esempio una sospensione di cellule in terreno di coltura, o una soluzione di fluorofori molecolare). La fase di petrolio, che in questo caso funge da fase continua, è generalmente costituito da una miscela di olio e tensioattivi, ad esempio tensioattivo Raindance 2% (Tecnologie Raindance) in olio fluorurato (3M liquido Fluorinert elettronico FC-40) o 2% Span 80 (Croda) in olio minerale.
   2. Montare tubi (tubi in polietilene, Harvard Apparatus) dello stesso diametro interno punte aghi della siringa da un lato per gli aghi. Il tubo deve essere tagliato per la più breve durata possibile per minimizzare l'instabilità di flusso a causa di perturbazioni vibrazionale.
   3. Collegare le altre estremità del tubo direttamente ai fori nel substrato PDMS. Soluzioni più complesse, come l'uso di porte capillare in silice o connettori (ad esempio Nanoports Upchurch) possono essere realizzati anche per un'interfaccia più robusto tra il dispositivo microfluidica e il tubo. Collegare la presaporta del chip di tubi e diretta in un collettore (per la raccolta dei rifiuti o la trasformazione ulteriore analita).
   4. Montare le siringhe in una pompa a siringa (ad esempio pompe siringa PHD 4400 Hpsi programmabile, Harvard Apparatus) e definire la infondendo desiderato portata per ciascuna fase (di solito dell'ordine di microlitri al minuto). Un rapporto minimo di olio / acquose portate da 1 si consiglia di evitare di bagnare il PDMS dalla fase acquosa, che porterebbe alla formazione di goccioline instabile (a seconda della geometria del dispositivo). Per lo stesso motivo, si raccomanda anche per irrigare la prima fase oleosa da solo, attraverso qualsiasi canale microfluidica, prima dell'introduzione della fase acquosa. La configurazione finale utilizzato per la sperimentazione nel presente documento è illustrato in Figura 2a.
2. Configurazione del sistema ottico
   1. Per sondare piccoli volumi (fino a un paio di picolitri) all'interno dei canali microfluidica con elevata risoluzione spaziale e temporale usare un microscopio confocale (con distributore automaticondr capacità di posizionamento inferiori al micron).
   2. Utilizzare molecole fluorescenti solubili in acqua con rendimenti particolarmente elevati quantistica. Eccitare le molecole con un funzionamento laser a una lunghezza d'onda che corrisponde l'assorbimento del fluoroforo coinvolti. Per esempio, comuni molecole fluorescenti come il 5-isotiocianato di fluorescina (FITC) e Alexa Fluor-488 può essere efficacemente eccitati con un laser a diodo di 488 nm (per esempio PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Molecole fluorescenti, come il Texas Red o Allophycocyanin (APC) può essere efficacemente uscito a 633 nm usando un He / Ne laser (per esempio, a Newport R-31425).
   3. Utilizzare il laser pulsato che operano a tassi di ripetizione di diversi MHz (con distacchi diversi impulsi ns) e fluorofori con proprietà a vita sufficientemente differenziati per Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) esperimenti.
   4. Usa fascio-direzione specchi e ottiche per controllare l'altezza del fascio così come la direzione del fascio.
   5. Utilizzare uno specchio dicroico per riflettere il raggio laser nel l obiettivoente. Se due laser sono usati simultaneamente, il mirroring di un dual-band dicroici possono essere installati per consentire la riflessione dei due fasci laser (ad esempio per 488 e 633 nm travi uno specchio z488/633rdc da Technology Corporation Chroma è l'ideale).
   6. Utilizzare una infinità-corretti, apertura numerica elevata (NA) obiettivo microscopio (cioè Olympus 60 x / 1,2 NA, immersione in acqua) per portare la luce laser per un focus ristretto all'interno di un canale microfluidica. Quando si lavora con microcanali alti (> 100 micron), l'obiettivo usato deve essere opportunamente selezionati per garantire che la sua distanza di lavoro effettivamente copre l'intera altezza del microcanali.
   7. Raccogliere fluorescenza emessa dal campione (all'interno del canale microfluidica) utilizzando lo stesso obiettivo alto NA e trasmessa attraverso lo specchio dicroico stesso.
   8. Rimuovere eventuali luce residua eccitazione con un singolo o dual-band emissione filtro (ad esempio un filtro z488/633 da Chroma Technology Corporation).
   9. Concentrare la fluorescenza emission su un foro stenopeico 75 micron utilizzando una lente piano-convessa (ad esempio 50,2 F; Newport Ltd.). Posizionare il foro nel piano confocale dell'obiettivo microscopio.
   10. Utilizzare un altro specchio dicroico (ad esempio 630dcxr, Chroma Technology Corporation) per dividere il segnale fluorescente su due rivelatori.
   11. Filtrare il fluorescenza riflessa dallo specchio dicroico con un filtro per le emissioni (ad esempio m hq540/80 filtro Chroma Technology Corporation) e mettere a fuoco con una lente piano-convessa (ad esempio f = 30.0, id 25.4 mm, Thorlabs) sulla prima ( 'verde'), rivelatore. Per gli esperimenti che comportano un fluoroforo secondaria filtro rosso la fluorescenza trasmessa dallo specchio dicroico con un altro filtro per le emissioni (ad esempio un filtro hq640lp da Chroma Technology Corporation) e poi mettere a fuoco con un'altra lente piano-convessa verso la seconda ('rosso'), rivelatore.
   12. Usa fotodiodi a valanga (ad esempio AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) per la rilevazione di fotoni di fluorescenza. La configurazione finale è illustrato nella Figura 2b.

3. Droplet generazione e acquisizione dati

1. Droplet generazione metodi
   1. È possibile utilizzare due configurazioni principali di microcanali di generare gocce: un flusso di messa a fuoco o di incrocio a T formato (Figura 3a e 3b) ^6,7 Entrambi i metodi sono equivalenti fino a quando le goccioline che si formano sono larga quanto la stessa microcanali.. Come risultato delle forze di taglio che derivare dall'uso queste geometrie di portare i due fluidi immiscibili insieme e la conseguente instabilità capillare che si sviluppano nell'interfaccia, gocce monodisperse (piccolo come un femtoliters pochi) sono generati spontaneamente.
   2. Si può incapsulare i reagenti in diversi modi: i reagenti possono essere preparati e mescolati off chip per la miscela desiderata / concentrazione, o possono essere portati separatamente nel chip e poi combinati insieme prima che la formazione di goccioline (Figura 3c). Questoultimo metodo prevede una maggiore flessibilità in quanto miscele / concentrazioni può essere modificata con la semplice messa a punto del relativo portate. Si sottolinea che per l'incapsulamento delle cellule, la sospensione di cellule in siringa deve essere mescolato per evitare la condensa delle cellule oltre i tempi dell'esperimento.
2. Fluorescenza di acquisizione dati.
   1. Accoppiare il segnale elettronico dal rivelatore fotodiodo valanga (descritto in 2.2.12) ad un dispositivo DAQ multifunzione per la registrazione dei dati (ad esempio una scheda PCI 6602, National Instruments), in esecuzione su un personal computer.
   2. Per gli esperimenti FLIM collegare i rivelatori di un tempo-correlate conteggio singolo fotone (TCSPC) carta (ad esempio TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) in esecuzione su un PC separato. Questa scheda consente di effettuare il corso della vita di fluorescenza di essere ottenuti utilizzando un TCSPC metodologia: ogni fotone rilevato fluorescente è correlata ad un impulso laser incidente, e quindi ogni fotone emesso fluorescente è assegnato un tempo di ritardo. Questi datipuò essere montato su una curva di decadimento singola o multi-esponenziale di ottenere una stima del fluoroforo / s coefficiente di irraggiamento / s. Deconvolute i dati grezzi con la funzione di risposta dello strumento (IRF) del rivelatore: questo si ottiene utilizzando una bassa concentrazione di auramina-O soluzione (che espone una vita di fluorescenza di pochi picosecondi) ^8.

4. Cellule riconoscimento e la mappatura di miscelazione all'interno gocce

1. Cellule riconoscimento e la mappatura di miscelazione all'interno gocce
   1. Usa Escherichia coli Top 10 ceppo per l'esperimento test vitalità. Le cellule in coltura Luria-Bertani brodo durante la notte e abbinare la densità ottica a 0,5 prima degli esperimenti.
   2. Usa 0,4 mM SYTO9 e 1 microM propidio ioduro per rilevare la vitalità delle cellule. Entrambi sono DNA intercalanti coloranti e la loro intensità di fluorescenza aumenta di oltre il 20 ripiega su di legame al DNA. SYTO9 è un colorante fluorescente verde che mi èmbrane permeabile e ioduro di propidio è un colorante rosso fluorescente che è membrana impermeabile. Così le cellule vive fluorescenza 'verde', mentre le cellule morte mostra sia 'verde' e 'rosso' delle emissioni.
   3. Utilizzare l'impostazione introdotta nel 2.2) per il verde / rosso fluorescenza.
   4. Utilizzare un portatile, mini-agitatore magnetico (Utah Biodiesel Chain, Utah) per mescolare le sospensioni celle all'interno di un 3 ml siringa BD Plastipak dotato di una barra di 7 millimetri ancoretta magnetica per evitare la sedimentazione delle cellule.
2. Mappatura degli eventi di miscelazione con FLIM
   1. Messa a fuoco il volume sonda ottica a metà altezza di un microcanali lungo la quale scorrono le goccioline.
   2. Gocce di forma da due soluzioni acquose (come in figura 3c), ciascuno contenente un (non interagenti) fluoroforo con differenti durate caratteristica fluorescenza.
   3. A partire da un lato del canale, effettuare ogni esperimento su tutta la larghezza del canale a intervalli di 1 micron. Il canale edGES può essere facilmente identificato come l'intensità di fluorescenza diminuisce drasticamente una volta che il fascio laser viene focalizzato in loro prossimità.
   4. Implementare un algoritmo per differenziare scoppia segnale (associata con gocce) dal rumore di fondo della fase di olio e di stabilire la durata di ogni raffica.
   5. Implementare un secondo algoritmo per estrarre il tempo di ritardo e di valori di intensità per tutta la lunghezza di ogni goccia alla larghezza particolare quando l'esperimento è stato effettuato ^9.
   6. Quindi utilizzare una stima di massima verosimiglianza (MLE) algoritmo per valutare la durata della fluorescenza per ogni goccia per l'esperimento. ⁸ la media dei valori di durata per tutte le goccioline di esperimento, di ridurre l'errore finale del calcolo MLE (le goccioline più sondato la l'errore più piccolo).
   7. Una volta che una traiettoria tutta la vita è stata ottenuta per ogni larghezza, unire tutte le traiettorie in una mappa 2D. Poiché ogni valore di durata è associata ad un particolareLAR miscela dei due fluorofori, una concentrazione (o la miscelazione) mappa può quindi essere ottenuto.
   8. Facoltativamente, una mappa 3D di gocce di miscelazione potrebbe essere facilmente ottenuta ripetendo questo protocollo in diverse posizioni lungo l'altezza del canale microfluidica.

5. Analisi dei dati

1. Reinterpretare le prime file di dati sperimentali nel linguaggio informatico adeguato, in modo che possano essere ulteriormente analizzati (ad esempio file di testo che contengono le variazioni della conta fotone nel tempo, può essere facilmente estratta in Matlab per l'elaborazione el'analisi dei dati). Potrebbe essere necessario scrivere codici specifici al fine di accedere ai dati contenuti nei file di esperimenti più complessi (come quelli per FLIM) o per eseguire algoritmi MLE o costruire mappe 2D di patters miscelazione da traiettorie vita.

6. Rappresentante Risultati

Riconoscimento delle cellule

Esempi tipici di variation dei conteggi di fotoni in funzione del tempo per il cell-based esperimenti sono mostrati nelle figure 4a e c, per un periodo di 200 millisecondi. È importante sottolineare che il brodo Luria-Bertani (LB medium) fa da sfondo debolmente fluorescenti definire i confini delle goccioline acquose, mentre scoppia fotone distinte, corrispondenti alla presenza di singole cellule, si possono distinguere in cima a questo sfondo. Lo sfondo LB fluorescente è caratterizzata da un circa a sezione rettangolare (contrassegnato dalle linee rossa e verde tratteggiata).

La piena massima metà larghezza (FWHM) di esplosioni fluorescenti derivanti da E. coli è di 30 volte inferiore a goccia eventi sullo sfondo, che è coerente con la lunghezza relativa delle gocce (40 micron, corrispondenti a un volume di 30 picolitri) ed E. coli (1.5-2.0 micron) ^10.

Con il doppio canale di rilevareione del sistema, l'esistenza di cellule vive o le cellule morte si distingue dall'analisi dei canali verde e rosso. figure 4 B e D mostrano la distribuzione di probabilità descrive il numero di cellule per goccia.

Mappatura degli eventi di miscelazione con FLIM

La durata della fluorescenza molecolare è una proprietà intrinseca di un fluoroforo individuale che è influenzato solo dal suo ambiente chimico. Di conseguenza le sue misurazioni possono essere utilizzati per ottenere informazioni ambientali (come pH, temperatura, polarità e viscosità) con risoluzione superiore e precisione di misure in tempo integrato a fluorescenza, che dipendono da fattori sperimentali (come la concentrazione, l'intensità di eccitazione, e la raccolta ottica efficienza). ^9,11

Come presentato altrove, ⁸ è possibile mappare i modelli di miscelazione all'interno gocce utilizzando due fluorofori con Divalori di durata fferent. In una miscela contenente due (non interagenti) specie fluorescenti il ​​decadimento assumerà una forma biesponenziale come la formula 1:

Le vite individuali sono definiti come τ1 e τ2, e l'ampiezza di ogni componente è data dalla α1 e α2 rispettivamente. La durata media può quindi essere definito come segue:

Dove β1 e β2 sono la frazione di ogni componente e sono definiti come segue:

Dal momento che il volume della sonda è fisso e le goccioline scorrono attraverso quella posizione, una traiettoria di vita i valori per tutta la lunghezza delle gocce in quel particolare larghezza può essere così ottenuta. Un percorso caratteristico per una larghezza particolare, Averagtra i 6000 ed goccioline, si può osservare nella figura 5a.

Combinando le traiettorie per tutta l'intera larghezza del canale porta alla formazione di una concentrazione 2D (o miscela) mappa. Un risultato tipico è presentato in figura 5b.

Facendo la media dei risultati tra un gran numero di goccioline, l'errore standard dei risultati ottenuti può essere notevolmente ridotta (1% di errore standard con un intervallo di confidenza al 95% per figura 5a). Il metodo di determinazione della traiettoria di vita presuppone che tutte le gocce sono praticamente identici. Questo è dimostrato di essere in gran parte corretto per due motivi principali: se le gocce erano significativamente differenti, le traiettorie vita media ottenuto sarebbe più piatto, meno divergenti profili (e le differenze forte vita per tutta la lunghezza delle gocce media sono costantemente rilevati). Inoltre, i risultati sono riproducibili a prescindere dal singoloha analizzato le gocce o la quantità di gocce utilizzate nei calcoli ^8.

Figura 1. Flusso di processo per la fabbricazione di chip microfluidico.

Figura 2 a) Schema che rappresenta le pompe siringa e siringhe, collegato al chip microfluidico per la formazione di goccioline; b) Rappresentazione schematica di una tipica configurazione ottica di un laser 2-2 fluoroforo (verde e rosso) eccitazione e di rilevamento.. DC = specchio dicroico, EM = emissione filtro, L = Lens, PH = foro Pin, APD = rivelatore fotodiodo valanghe.

Figura 3 On-chip strategie di formazione delle gocce: a) il flusso di messa a fuoco di configurazione; b) T-giunzione di configurazione.. c) Il incapsulamento chip droplets dei due reagenti originariamente separati acquosa.

Figura 4 lettura ottica di 0,2 s tracce registrate per (a), morto e (c) cellule vive (portate per sospensione di cellule: 1 ml min ^-1, olio: 2 min microlitri ^-1).. Ogni arco a forma di segnale corrisponde alla media LB debolmente fluorescenti che forma la goccia acquosa, con i confini goccia contrassegnati con linee tratteggiate. Segnali verdi rappresentano i segnali di lettura sotto 633nm e rosso oltre 633 lunghezze d'onda nm. Le cellule si distinguono per il picco verticale derivanti dalla coloranti intercalanti del DNA. Distribuzione di probabilità per una persona cellulari all'interno gocce unico per (b) le cellule morte e (d) cellule vive.

Figura 5 a) traiettoria tipica vita media per tutta la lunghezza di una goccia con una larghezza particolare;. B)Rappresentazione tipica della combinazione di tutte le traiettorie media sondato lungo l'intera larghezza delle gocce in una vita 2D (o di concentrazione, espresso in% FITC /% Str-AF488) mappa.

Discussione

Abbiamo descritto la fabbricazione di un dispositivo a microfluidi, un apparato sperimentale e protocolli associati per la formazione e l'incapsulamento microdroplet reagente e la rilevazione ottica delle gocce elaborati. I due esempi selezionati (la rilevazione di singole cellule in goccioline e la mappatura dei processi di miscelazione all'interno gocce che scorre) rappresentano applicazioni più comuni che sono attualmente in fase di studio con microfluidica goccia.

Come gli esperimenti presentati illustrano l'utilizzo di piattaforme goccia microfluidica presenti alcune caratteristiche interessanti, come ad esempio un throughput elevato, quasi perfetto isolamento, alta riproducibilità ... La grande quantità di dati prodotti e la rapidità con cui queste informazioni vengono generate, però, richiedono l'uso di metodi di rilevamento veloce ad alta risoluzione spazio-temporale se il vantaggio è che si possono ottenere da queste piattaforme miniaturizzati. In questo caso si dimostra che questo èpossibile utilizzando tecniche di spettroscopia a fluorescenza ad alta precisione. In particolare, la tecnica di rilevazione FLIM (che fa uso di un laser pulsato con periodi di ripetizione breve come un ns pochi) rivela la capacità di ottenere informazioni molto velocemente dal rapido fluire gocce (circa 200 al secondo). In questo caso la risoluzione temporale degli eventi è stato rilevato fino a 1 ms. In termini di limiti di dimensioni delle gocce e la concentrazione, l'uso di lenti più grandi apertura numerica e laser di potenza più grande sarebbe facilmente consentono la rilevazione delle concentrazioni nM in goccioline di soli 5 micron (i limiti di dimensioni delle gocce essere imposte dalle risoluzioni della fotolitografia processo di fabbricazione e della fase di posizionamento inferiori al micron).

Gocce Microfluidic sono i candidati ideali per effettuare la sperimentazione su vasta scala con piccole quantità di reagenti, fino al singolo bersaglio / evento. Attuali limiti di questa tecnologia comporta la difficoltà di generare droplets da una varietà di grandi dimensioni (decine o centinaia) di diverse fonti in un high-throughput modo. Inoltre, la difficoltà di indirizzare e manipolare ogni singola goccia generato impone severe limitazioni alla applicabilità pratica di queste tecniche. Pertanto, questi temi sono al centro degli sforzi di ricerca importanti volti a sviluppare le necessarie soluzioni tecnologiche che permetteranno piattaforme goccia microfluidica per diventare un metodo di riferimento standard di ricerca e analisi in applicazioni ad elevato throughput.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Tipo	Azienda	Numero di catalogo
Fluoresceina 5-isotiocianato (FITC)	Reagente	Sigma-Aldrich	F3651
Streptavidina-Alexa Fluor 488	Reagente	Molecular Probes	S11223
Perfluorodecalin	Reagente	Sigma-Aldrich	P9900
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol	Reagente	Sigma-Aldrich	370533
Sylgard 184 kit di silicone elastomero	Reagente	Premier Farnell UK LTD	1673921
auramina-O	Reagente	Sigma-Aldrich	861030
485 nm ad impulsi laser a diodi	Attrezzatura	PicoQuant	LDH-PC-485
TCSPC Carta	Attrezzatura	PicoQuant	TimeHarp 100
specchio dicroico	Attrezzatura	Chroma Technology Corp.	z488rdc,
Microscopio obiettivo	Attrezzatura	Olimpo	UPLSAPO 60XW
Avalanche fotodiodo	Attrezzatura	AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer).	AQR-141
DMEM	Reagente	Invitrogen	ABCD1234
SYTO9	Reagente	Invitrogen	S34854
Propidio ioduro	Reagente	Invitrogen	P3566
Escherichia coli ceppo top 10	Cellule	Invitrogen	C4040-10