Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Resumen

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Resumen

El desarrollo de plataformas de microfluidos para la realización de la química y la biología ha sido en gran parte impulsado por una serie de beneficios potenciales que acompañan a la miniaturización del sistema. Las ventajas incluyen la capacidad de procesar de manera eficiente a la nano-femoto litros el volumen de la muestra, la integración fácil de los componentes funcionales, una predisposición intrínseca a gran escala de multiplexación, el rendimiento analítico mejorado, un mejor control y reducción de huellas instrumentales ^1.

En los últimos años un gran interés se ha centrado en el desarrollo de la gota basado (o flujo segmentado) los sistemas de microfluidos y su potencial como plataformas de alto rendimiento de la experimentación. ^2-4 Aquí el agua en aceite se hacen para formar de forma espontánea en los canales de microfluidos como resultado de la inestabilidad capilar entre las dos fases inmiscibles. Es importante destacar que las microgotas de volúmenes definidos con precisión y las composiciones se pueden generar en las frecuenciasde varios kHz. Además, mediante la encapsulación de los reactivos de interés dentro de compartimentos estancos separados por una fase continua inmiscible, tanto de la muestra transversal de conversación y de dispersión (difusión y Taylor base) puede ser eliminado, lo que conduce a un mínimo la contaminación cruzada y la capacidad de tiempo de los procesos analíticos con gran precisión. Además, dado que no hay contacto entre el contenido de las gotas y las paredes del canal (que se han humedecido por la fase continua) la absorción y la pérdida de reactivos en las paredes del canal se previene.

Una vez que las gotas de este tipo se han generado y procesado, es necesario extraer la información analítica necesaria. En este sentido, el método de detección de elección debe ser rápida, proporciona alta sensibilidad y bajos límites de detección, se aplica a una variedad de especies moleculares, que no destructivo y ser capaz de integrarse con dispositivos de microfluidos de una manera fácil. Para satisfacer esta necesidad hemos desarrollado comouite de herramientas experimentales y protocolos que permiten la extracción de grandes cantidades de información fotofísicos de entornos de pequeño volumen, y son aplicables al análisis de una amplia gama de parámetros físicos, químicos y biológicos. Aquí dos ejemplos de estos métodos se presentan y se aplica a la detección de células individuales y el mapeo de los procesos de mezcla dentro de las gotas de volumen picolitros. Se describe el proceso experimental completo, incluyendo la fabricación de chips de microfluidos, la configuración óptica y el proceso de generación y detección de gota.

Protocolo

1. Microchip de fabricación

1. SU8 maestro de fabricación.
   Para obtener canales de microfluidos de altura m 40, abrigo spin SU8-50 (MicroChem Corp.) en una oblea de silicio a 3000 rpm durante 30 s. Horno suave sobre una placa caliente a 65 ° C durante 5 minutos y 95 ° C durante 30 minutos para evaporar el solvente y densificar la película. Después del enfriamiento, exponer la SU8 resistir a la radiación 360-440 nm a 300 mJ / ² bajo la máscara adecuada. Tras la exposición, hornear la hostia a 65 ° C durante 2 minutos y 95 ° C durante 4 minutos. Después de enfriar, desarrollar las zonas no expuestas (CE Micrpoposit solvente, Chestech) durante 5 minutos, con agitación. ⁵ Utilice solvente fresco para enjuagar la oblea y luego séquela con gas para generar una superficie limpia y CE. El tratamiento de la oblea con lavados hexano y metanol. Completar el proceso de dominar SU8 la fabricación con un paso final de la evaporación de tricloro (1,1,2,2-perfluoocytl) silano sobre la superficie (en un desecador durante 40 minutos).
2. PDMS Curing, cortar en cubitos y perforación.
   De forma estructurada sustratos de microfluidos, que mezcla Sylgard 184 (Dow Corning) en un 10:1 (w / w) La proporción de resina reticulante y luego vierta sobre el maestro. Degas en un desecador, y luego curar el dispositivo (capa superior) durante una hora a 65 ° C. Cortar el curado PDMS y despegarlo del maestro. Crear agujeros de acceso para la tubería de fluidos con una biopsia por punción. Cure otra capa de PDMS (8 g de la resina distribuida uniformemente en un plato de 10x10 cm Petri) durante 20 minutos a 65 ° C. Coloque la capa superior preparada en la capa inferior y curar toda la noche a 65 ° C. Pelar las papas fritas de la placa de Petri y los dados para su uso.

2. Montaje experimental

1. Configuración de microfluidos
   1. Llenar jeringas (de plástico o de vidrio de Beckton, Dickinson and Company o de la ciencia analítica SGE) con las soluciones necesarias, asegurando que no queden burbujas de aire en cualquier parte de la tubería. Para la generación de gotas dos fases se utilizan. El humor acuoso (dispersos) PHAe incluye los reactivos de interés (por ejemplo una suspensión de células en un medio de crecimiento, o una solución de fluoróforos molecular). La fase de aceite, que en este caso actúa como fase continua, se forma generalmente una mezcla de aceite y tensioactivo, por ejemplo, 2% de surfactante Raindance (RainDance Technologies) en aceite fluorado (3M líquido Fluorinert electrónico FC-40), o 2% Span 80 (Croda) en aceite mineral.
   2. En forma de tubos (tubo de polietileno, Harvard Apparatus) del mismo diámetro interno como las puntas de aguja de la jeringa en un extremo de las agujas. El tubo debe ser cortado a la longitud más corta posible para minimizar la inestabilidad del flujo debido a las perturbaciones vibratorias.
   3. Conecte el otro extremo de la tubería directamente a los agujeros en el sustrato de PDMS. Soluciones más complejas, tales como el uso de puertos capilar de sílice o conectores (por ejemplo, Nanoports Upchurch) también se puede implementar una interfaz más sólida entre el dispositivo de microfluidos y el tubo. Conecte la salidapuerto del chip de la tubería y directa en un colector (para la recolección de residuos o el procesamiento de analitos más).
   4. Monte las jeringas en una bomba de inyección (por ejemplo, PHD 4400 bombas de jeringa Hpsi programables, Harvard Apparatus) y definir la infusión deseada tasa de flujo de cada fase (por lo general en el orden de los microlitros por minuto). Una proporción mínima de aceite / acuosa caudales de 1 se recomienda para evitar que se moje el PDMS por la fase acuosa, lo que llevaría a la formación de gotas inestables (dependiendo de la geometría del dispositivo). Por la misma razón, también se recomienda para eliminar la primera fase de aceite solo, a través de cualquier canal de microfluidos, antes de la introducción de la fase acuosa. La configuración final utilizada para el presente experimentos se ilustra en la Figura 2a.
2. Configuración del sistema óptico
   1. Para profundizar en pequeñas cantidades (hasta un picolitros pocos) en los canales de microfluidos con alta resolución espacial y temporal de uso de un microscopio confocal (con autómataed la capacidad de posicionamiento de sub-micras).
   2. El uso del agua-soluble moléculas fluorescentes con alto rendimiento cuántico ideal. Excitan las moléculas con una operación láser en una longitud de onda que coincide con la absorción del fluoróforo involucrados. Por ejemplo, las moléculas fluorescentes comunes, como la fluoresceína 5-isotiocianato (FITC) y Alexa-Fluor 488 puede ser eficiente entusiasmados con un láser diodo de 488 nm (por ejemplo, PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Moléculas fluorescentes, tales como Texas Red o aloficocianina (APC) se puede salir de manera eficiente a 633 nm utilizando una de He / Ne laser (por ejemplo, Newport R-31425).
   3. Utilice láseres pulsados ​​que operan en las tasas de repetición de varios MHz (con varias separaciones ns pulso) y fluoróforos con propiedades suficientemente diferenciados por vida para toda la vida de imágenes de fluorescencia (FLIM) experimentos.
   4. Uso de orientación del haz, espejos y la óptica para controlar la altura de la viga, así como la dirección del haz.
   5. Use un espejo dicroico para reflejar el rayo láser en el l objetivoens. Si dos rayos láser se utilizan al mismo tiempo, un espejo de doble banda dicroico puede ser instalado para permitir la reflexión de los dos haces láser (por ejemplo, 488 y 633 nm haces un espejo z488/633rdc de Chroma Technology Corporation es ideal).
   6. Use una infinidad corregida, de alta apertura numérica (NA) objetivo de microscopio (es decir, Olympus 60 x / 1,2 NA, inmersión en agua) para llevar la luz del láser a un estricto enfoque dentro de un canal de microfluidos. Cuando se trabaja con microcanales alto (> 100 mm), el objetivo debe ser utilizado adecuadamente seleccionados para asegurarse de que su distancia de trabajo efectivamente cubre toda la altura de los microcanales.
   7. Recoger la fluorescencia emitida por la muestra (en el canal de microfluidos) con el mismo objetivo de alto NA y se transmite a través del espejo dicroico mismo.
   8. Eliminar cualquier luz de excitación residual con un único o doble banda de emisión de filtro (por ejemplo, un filtro de z488/633 Chroma Technology Corporation).
   9. El enfoque de la fluorescencia emission en un agujero 75 micras utilizando una lente plano-convexa (por ejemplo, 50.2 F; Newport Ltd.). La posición del agujero de alfiler en el plano confocal del objetivo del microscopio.
   10. Utilizar otro espejo dicroico (por ejemplo, 630dcxr, Chroma Technology Corporation) para dividir la señal fluorescente en dos detectores.
   11. Filtro de la fluorescencia reflejada por el espejo dicroico con un filtro de emisión (por ejemplo, un filtro de hq540/80 m Chroma Technology Corporation) y el foco con una lente plano convexa (por ejemplo, f = 30.0, 25.4 mm id, Thorlabs) en la primera ( "verde") del detector. Para los experimentos con un fluoróforo rojo secundaria filtro de la fluorescencia de transmisión por el espejo dicroico con otro filtro de emisión (por ejemplo, un filtro de hq640lp de Chroma Technology Corporation) y luego centrarse con otra lente plano-convexa en el segundo ("rojo") detector.
   12. Use fotodiodos de avalancha (por ejemplo, AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) para la detección de fotones de fluorescencia. La configuración final se ilustra en la Figura 2b.

3. Gota de generación y adquisición de datos

1. Gota de métodos de generación de
   1. Se pueden utilizar dos configuraciones principales de microcanales para generar gotas: un flujo de enfoque o unión T-formato (Figura 3a y 3b) ^6,7 Ambos métodos son equivalentes, siempre y cuando las gotitas formadas son tan amplias como la propia microcanal.. Como resultado de las fuerzas de cizallamiento que surgen del uso de estas geometrías para que los dos líquidos inmiscibles entre sí y las inestabilidades posteriores capilares que se desarrollan en la interfaz, las gotas monodispersas (tan pequeño como un femtolitros pocos) se generan de forma espontánea.
   2. Puede encapsular los reactivos de diferentes maneras: se puede preparar reactivos y mezcla de chip para la mezcla deseada / concentración, o pueden ser llevados por separado en el chip y luego se combinan juntos antes de la formación de gotas (Figura 3c). Esteúltimo método proporciona una mayor flexibilidad ya que las mezclas / concentraciones pueden ser modificados por simple ajuste de la relación caudales. Cabe señalar que para la encapsulación de células, la suspensión de células en la jeringa debe agitarse para evitar la condensación de las células en la escala de tiempo del experimento.
2. De adquisición de datos de fluorescencia.
   1. Acoplar la señal electrónica del detector de fotodiodo de avalancha (que se describe en 2.2.12) a un dispositivo DAQ multifunción para registro de datos (por ejemplo, una tarjeta PCI 6602, National Instruments), que se ejecutan en un ordenador personal.
   2. Para los experimentos FLIM conectar los detectores a un conteo de fotones correlacionados tiempo individual (TCSPC) tarjeta (por ejemplo, TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) que se ejecuta en un PC independiente. Esta tarjeta permite que los datos de por vida de fluorescencia que se obtiene utilizando una metodología TCSPC: cada fotón detectado fluorescentes se correlaciona con un pulso de láser incidente, por lo que cada fotón emitido fluorescentes se le asigna un tiempo de retardo. Estos datospuede ser instalada en la curva de caída de una o varias exponencial para obtener una estimación del coeficiente de velocidad de fluoróforo / s radiativo / s. Deconvolute los datos en bruto con la función de la respuesta del instrumento (IRF) del detector: se obtiene utilizando una baja concentración de auramina-O la solución (que muestra la vida de fluorescencia de unos picosegundos) ^8.

4. Reconocimiento celular y la cartografía de la mezcla dentro de las gotas

1. Reconocimiento celular y la cartografía de la mezcla dentro de las gotas
   1. Escherichia coli uso Inicio 10 de tracción para el experimento de ensayo de viabilidad. Cultivar las células en caldo Luria-Bertani durante la noche y coinciden con la densidad óptica de 0,5 antes de los experimentos.
   2. Use 0,4 M SYTO9 y 1 M de yoduro de propidio para la detección de la viabilidad de las células. Ambos están intercalando tintes de ADN y su intensidad de la fluorescencia se incrementa en más de 20 pliegues en la unión al ADN. SYTO9 es un colorante fluorescente verde que me estámbrane permeable y yoduro de propidio es un colorante fluorescente de color rojo que es la membrana impermeable. Así, las células vivas fluorescencia "verde", mientras que las células muertas de exhibición, tanto 'verdes' y 'rojo' de las emisiones.
   3. Utilice la configuración introducida en 2.2) para la detección de la fluorescencia verde / rojo.
   4. Uso un portátil, mini-agitador magnético (Utah Biodiesel Supply, Utah) para agitar las suspensiones de células dentro de una jeringa de 3 ml BD Plastipak equipado con una barra de agitación magnética 7mm para prevenir la sedimentación de la célula.
2. Mapeo de los eventos de mezcla usando FLIM
   1. Enfoque del volumen de la sonda óptica a la mitad de la altura de un micro a lo largo de la cual las gotas están fluyendo.
   2. Las gotas de forma a partir de dos soluciones acuosas (como en la figura 3c), cada uno con un fluoróforo (que no interactúan) con diferentes tiempos de vida fluorescente característico.
   3. A partir de un lado del canal, llevar a cabo cada experimento a lo largo de todo el ancho del canal a intervalos de 1 m. La edición de canalesGES puede ser fácilmente identificado como la intensidad de la fluorescencia disminuye drásticamente una vez que el rayo láser se centra en su proximidad.
   4. Implementar un algoritmo para diferenciar ráfagas de señales (asociado con gotas) del ruido de fondo de la fase oleosa y establecer la duración de cada ráfaga.
   5. Implementar un segundo algoritmo para extraer el tiempo de retardo y los valores de intensidad a lo largo de la longitud de cada gota en el ancho de todo cuando ha sido el experimento llevado a cabo ^9.
   6. A continuación, utilice un estimador de máxima verosimilitud (MLE) algoritmo para evaluar la vida de fluorescencia de cada gota en el experimento. ⁸ Promediando los valores de la vida para todas las partículas en el experimento, se reduce el error final del cálculo de la MLE (las gotas más investigado, la menor será el error).
   7. Una vez que una trayectoria de vida se ha obtenido para cada ancho, se combinan todas las trayectorias en un mapa 2D. Debido a que cada valor de la vida se asocia con un particularlar mezcla de los dos fluoróforos, una concentración (o mezcla) Mapa de este modo se puede obtener.
   8. Opcionalmente, un mapa en 3D de las gotas de mezcla puede ser fácilmente obtenida mediante la repetición de este protocolo en diferentes posiciones a lo largo de la altura del canal de microfluidos.

5. Análisis de datos

1. Reinterpretar los archivos RAW de datos experimentales en el lenguaje informático adecuado para que puedan ser analizadas (por ejemplo, archivos de texto que contienen la variación del recuento de fotones a través del tiempo, puede ser fácilmente extraído en Matlab para el procesamiento de datos y análisis). Usted podría tener que escribir códigos específicos con el fin de acceder a los datos contenidos en los archivos de los experimentos más complejos (como los de FLIM) o con el fin de ejecutar los algoritmos MLE o construir mapas 2D de patrones de mezcla de trayectorias de vida.

6. Resultados representante

Reconocimiento celular

Ejemplos típicos de la variableiation del recuento de fotones en función del tiempo para los experimentos basados ​​en células se muestran en las figuras 4a y C, durante un período de 200 milisegundos. Es importante destacar que el caldo Luria-Bertani (LB medio) actúa como un fondo débilmente fluorescentes definir los límites de las gotas acuosas, mientras que distintos estallidos de fotones, lo que corresponde a la presencia de células individuales, se pueden distinguir en la parte superior de este fondo. El fondo LB fluorescente se caracteriza por un aproximado de sección transversal rectangular (marcada por las líneas punteadas de color rojo y verde).

El ancho máximo de la mitad (FWHM) de los estallidos de fluorescentes derivados de E. células de E. coli es de 30 veces más corta que los eventos de fondo gota, lo cual es consistente con la longitud relativa de las gotas (40 micras, que corresponde a un volumen de 30 picolitros) y E. células de E. coli (1,5 a 2,0 micras). ¹⁰

Con la detección de doble canalión del sistema, la existencia de células vivas o las células muertas se pueden distinguir a partir del análisis de los canales verde y rojo. Figuras 4 B y D muestran la distribución de probabilidad que describen el número de células por gota.

Mapeo de los eventos de mezcla usando FLIM

La vida de fluorescencia molecular es una propiedad intrínseca de un fluoróforo individuales que sólo se ve afectada por su entorno químico. En consecuencia, sus medidas se pueden utilizar para obtener información sobre medio ambiente (como el pH de la solución, la temperatura, la polaridad y viscosidad) con una resolución superior y precisión que el tiempo de las medidas de fluorescencia integrado, que dependen de factores experimentales (como la concentración, la intensidad de la excitación, y la colección de ópticas eficiencia) ^9,11.

Tal como se presenta en otros lugares, ⁸ es posible mapear los patrones de mezcla dentro de las gotas a través de dos fluoróforos con diferentes valores de toda la vida. En una mezcla que contiene dos (que no interactúan) especies fluorescentes de la decadencia se enfrentará a una forma biexponencial como se muestra en la ecuación 1:

Los tiempos de vida individuales se definen como τ1 y τ2, y la amplitud de cada componente está dado por α1 y α2 respectivamente. El promedio de vida se puede definir de la siguiente manera:

Β1 y β2, donde son la fracción de cada componente y se definen como sigue:

Dado que el volumen de la sonda es fijo y las gotas están fluyendo a través de esa posición, la trayectoria de la vida de los valores a lo largo de las gotas en ese ancho en particular puede ser obtenida. Una trayectoria característica de un ancho especial, Averaged entre 6000 gotas, se puede observar en la figura 5a.

La combinación de las trayectorias a lo largo de todo el ancho del canal conduce a la formación de una concentración en 2D (o mezcla) del mapa. Un resultado típico se presenta en la Figura 5b.

El promedio de los resultados entre un gran número de gotas, el error estándar de los resultados obtenidos pueden ser muy reducido (el 1% de error estándar, con un intervalo de confianza del 95% de la Figura 5a). El método de determinación de la trayectoria de toda la vida supone que todas las gotas son prácticamente idénticos. Esto se demuestra en gran medida correcta por dos razones principales: si las gotas fueron significativamente diferentes, las trayectorias de vida promedio obtenido habría más plano, menos los perfiles divergentes (y las fuertes diferencias en la vida a lo largo de las gotas son un promedio detectado consistentemente). Además, los resultados son reproducibles, independientemente de la personagotas de analizar o de la cantidad de gotas utilizadas en los cálculos. ⁸

Figura 1. Proceso de flujo en la fabricación de chips de microfluidos.

La figura 2 un diagrama), que representan las bombas de jeringa o jeringas, conectado al chip de microfluidos para la formación de gotas, b) Representación esquemática de una configuración típica de un láser óptico para dos-dos fluoróforo (verde y rojo) de excitación y de detección.. DC = espejo dicroico, EM = emisiones de filtro, L = Lente, PH = agujero, APD = detector de fotodiodo de avalancha.

En la figura 3-chip estrategias de formación de gotas: a) la configuración del flujo de enfoque, b) cruce de configuración.. c) El encapsulado de chip en la Repúblicaoplets de dos reactivos acuosos, originalmente separadas.

Figura 4 lectura óptica de 0,2 s rastros registrados para (a) muertos y (c) las células vivas (las tasas de flujo para la suspensión de células: 1 min l ^-1, el aceite: 2 min l ^-1).. Cada señal en forma de arco se corresponde con el medio LB débilmente fluorescentes que se forma la gota acuosa, con los límites de las gotas marcadas con líneas discontinuas. Señales verdes representan las señales de lectura en 633 nm y el rojo en 633 nm longitud de onda. Las células se distinguen por el aumento vertical que surge de los tintes intercalantes del ADN. Distribución de probabilidad de ocupación de celulares dentro de las gotas individuales de (b) las células muertas y (d) las células vivas.

Figura 5 a) la trayectoria típica de por vida un promedio a lo largo de una gota en un ancho particular;. B)Representación típica de la combinación de todas las trayectorias promedio investigado a lo largo de todo el ancho de las gotas en una vida en 2D (o de concentración expresados ​​en% FITC /%-Str AF488) mapa.

Discusión

Hemos descrito la fabricación de un dispositivo de microfluidos, un montaje experimental y los protocolos asociados para la formación de microgotas y la encapsulación del reactivo y de detección óptica de las gotas de procesado. Los dos ejemplos seleccionados (la detección de células individuales en gotas y el mapeo de los procesos de mezcla dentro de las gotas de fluido) representan las aplicaciones más comunes que se están investigando con la microfluídica gota.

Como los experimentos presentados ilustran el uso de plataformas de microfluidos gota presentan ciertas características atractivas, tales como un alto rendimiento, el confinamiento cuasi-perfecta, alta reproducibilidad ... La gran cantidad de información producida y la alta velocidad a la que se proyecta esta información que se genera, sin embargo, requieren el uso de métodos de detección rápida con una resolución espacio-temporal de alta si la ventaja es que se derivan de estas plataformas en miniatura. En este caso se demuestra que esto esposible con alta precisión las técnicas espectroscópicas fluorescentes. En particular, la técnica de detección FLIM (que hace uso de un láser pulsado con períodos de repetición a intervalos de un ns pocos) pone de manifiesto la capacidad de obtener información muy rápidamente a partir de las gotas que fluyen rápidamente (de alrededor de 200 por segundo). En este caso, la resolución temporal de los eventos detectados fue de tan sólo 1 ms. En cuanto a los límites en el tamaño de la gota y la concentración, el uso de lentes de mayor apertura numérica y mayor potencia láser fácilmente permitir la detección de concentraciones nM en gotas tan pequeñas como 5 micras (las limitaciones en el tamaño de la gota impuestas por las resoluciones de la fotolitografía proceso de fabricación y de la etapa de posicionamiento de sub-micras).

Gotas de microfluidos son candidatos ideales para llevar a cabo experimentos a gran escala de pequeños importes de los reactivos, hasta un solo objetivo / evento. Las limitaciones actuales de esta tecnología incluyen la dificultad para generar droplets de una gran variedad (decenas o cientos) de distinta procedencia en una forma de alto rendimiento. Además, la dificultad para seleccionar y manipular cada sola gota generada impone severas limitaciones a la aplicación práctica de estas técnicas. Por lo tanto, estos temas están en el centro de importantes esfuerzos de investigación destinados a desarrollar las soluciones tecnológicas necesarias que permitan a las plataformas de microfluidos gota para convertirse en un método estándar de referencia de investigación y análisis de aplicaciones de alto rendimiento.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Tipo	Empresa	Número de catálogo
Fluoresceína 5-isotiocianato (FITC)	Reactivo	Sigma-Aldrich	F3651
Estreptavidina-Alexa Fluor 488	Reactivo	Las sondas moleculares	S11223
Perfluorodecalina	Reactivo	Sigma-Aldrich	P9900
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol	Reactivo	Sigma-Aldrich	370533
Sylgard 184 kit de silicona de elastómero	Reactivo	Premier Farnell Reino Unido LTD	1673921
auramina-O	Reactivo	Sigma-Aldrich	861030
485 nm láser pulsado de diodo	Equipo	PicoQuant	LDH-PC-485
TCSPC tarjeta	Equipo	PicoQuant	TimeHarp 100
espejo dicroico	Equipo	Chroma Technology Corp.	z488rdc,
Microscopio objetivo	Equipo	Olimpo	UPLSAPO 60XW
Fotodiodo de avalancha	Equipo	AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer).	AQR-141
DMEM	Reactivo	Invitrogen	ABCD1234
SYTO9	Reactivo	Invitrogen	S34854
Yoduro de propidio	Reactivo	Invitrogen	P3566
Escherichia coli cepa top 10	Las células	Invitrogen	C4040-10