أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em&gt; خارج الحي</em&gt; رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية

Summary

لإجراء تقييم سريع وظيفة الجينات في تطور قشرة الدماغ، ونحن تصف الأساليب التي تنطوي على خارج الحي electroporation من البلازميدات المشترك معربا عن الحمض النووي الريبي المثبطة (رني) وGFP في قشرة الفئران الجنينية. هذا البروتوكول هو قابل لدراسة مختلف جوانب النمو العصبي مثل الخلايا العصبية، والهجرة الخلايا العصبية والخلايا العصبية بما في ذلك التشكل التغصنات وثمرة محور عصبي.

Abstract

قشرة الدماغ يوجه الوظائف العقلية العليا. يتم إنشاء هذا الهيكل 6 الطبقات بطريقة داخل والعشرين خارج الأخير، والذي الخلايا العصبية أول مولود تظل أقرب إلى البطين في حين أن الخلايا العصبية مشاركة لدت تهاجر الخلايا العصبية الماضي أول مولود نحو سطح الدماغ ^1. بالإضافة إلى هجرة الخلايا العصبية ^2، وهي عملية أساسية لوظيفة القشرية العادي هو تنظيم التشكل العصبية ^3. بينما يمكن دراسة التشكل الخلايا العصبية في المختبر في الثقافات الأولية، وهناك الكثير الذي يمكن تعلمه من كيف يتم تنظيم هذه العمليات في بيئات الأنسجة.

وصفنا التقنيات لتحليل الهجرة العصبية و / أو التشكل في شرائح عضوي النمط من قشرة الدماغ ^4،6. وتستخدم ناقلات pSilencer المحور الذي يحتوي على كل مروج U6 الذي يدفع الحمض النووي الريبي مزدوج منعطف حاد الذين تقطعت بهم السبل وشريط التعبير الذي يشفر بروتين منفصلة GFP مدفوعة بيا CMV المروج ^7-9. نهجنا يسمح للتقييم السريع لعيوب في نمو neurite على ضربة قاضية محددة من الجينات مرشح واستخدمت بنجاح في شاشة للمنظمين من ثمرة neurite ^8. فقط لمجموعة فرعية من الخلايا سوف تعبر عن ثوابت رني، شرائح عضوي النمط تسمح لتحليل فسيفساء من الظواهر المحتملة. وعلاوة على ذلك، لأن هذا يتم التحليل في تقريب بالقرب من بيئة في الجسم الحي، ويوفر التكلفة المنخفضة وبديل سريع لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب للجينات وظيفة القشرية غير معروف. أخيرا، بالمقارنة مع التكنولوجيا في electroporation المجراة، فإن نجاح التجارب السابقة electroporation فيفو لا يعتمد على مهارة جراحة تنمية المهارات ويمكن القيام بها مع وقت أقصر التدريب والمهارة.

Protocol

1. إعداد حلول الثقافة والإعلام (وليس في الفيديو)

1. تحضير 1 لتر من محلول هانك كاملة للملح متوازن (HBSS) التي تحتوي على HBSS 1X، 2.5 Hepes ملم (pH7.4)، 30 مم D-جلوكوز، 1 ملم CaCl _2، 1 ملم MgSO ₄ و 4 ملم NaHCO _3. إضافة الماء المقطر مزدوجة (DDH ₂ O). تصفية تعقيم مع فلتر 0،2 ميكرون، ومخزن في 4 درجات مئوية.
2. إعداد شريحة المتوسطة ثقافة باستخدام 35 مل من بصل متوسطة النسر وسائل الإعلام، و 12.9 مل من HBSS كاملة، و 20 ملي مد الجلوكوز (1.35 مل من محلول م 1)، 1 ملم Glutamax (0.25 مل من محلول 200 مم)، و 0.5 مل من البنسلين -100X الستربتومايسين الأوراق المالية. تصفية تعقيم مع فلتر 0.2 ميكرون، ثم تضاف للحرارة المعطل حصان المصل إلى تركيز النهائي من 5٪.
3. إعداد Laminin حل الفريق بجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون Laminin مع الماء المعقم منزوع الأيونات المقطر. إعداد 100 aliquots ميكرولتر في أنابيب 0.5 مل إيبندورف وتجميدها عند -80 درجة مئوية.
4. تحضير بولي-L-يسين العامل حتىlution بإضافة 5 مل من عقيم O ₂ H إلى 5 ملغ من بولي يسين-L لجعل 1 ملغ / مل حل الأوراق المالية. 1 إعداد aliquots مل وتجميد في -20 درجة مئوية.
5. يعد حل طلاء بواسطة تمييع 1 مل من بولي-L-يسين و 100 ميكرولتر من laminin إلى وحدة تخزين النهائي من 12 مل مع الماء المعقم. جعل هذا الحل جديد في كل مرة.

2. إعداد إدراج شريحة عضوي النمط (وليس في الفيديو)

1. 2 إعداد ست لوحات جيدة مع ادخال ثقافة واحدة لكل جيدا باستخدام ملقط معقم. إضافة 2 مل من عقيم O ₂ DDH تحت إدراج الثقافة.
2. إضافة 1 مل من محلول طلاء على رأس الغشاء مع الحرص على عدم ثقب في الغشاء. احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
3. إزالة طلاء وسائل الإعلام وغسل غشاء مع معقم مرات H 0 3 _2. السماح بإدراج جافة قبل الاستخدام. إضافة 1.8 مل من المتوسط ​​ثقافة شريحة وضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية. التفاف على لوحات غير المستخدمة مع Parafilmوتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.

3. التحضير لElectroporation (وليس في الفيديو)

1. إعداد البنى رني لelectroporation. وتم استنساخ الحمض النووي الريبي مزدوج منعطف حاد يدرج حبلا في ناقلات pSilencer. ويحتوي على البلازميد: 1) مروج U6 الذي يدفع ضعف توليد الحمض النووي الريبي حبلا، و 2) التعبير GFP كاسيت 1 مدفوعا المروج CMV ^8،9. وقد تم هذا البلازميد التي سبق وصفها من قبل كونيشي وزملاؤه ⁽⁹⁾ وآخرون ^7،8. ويجري تنقية البلازميدات باستخدام ماكسي الإعدادية QIAGEN عدة، وتستخدم بتركيز 1 ملغ / مل.
2. من أجل تصور الحمض النووي في حين حقنه، وإعداد 0.5٪ بسرعة حل الصبغة الخضراء واستخدامها في 1:20 مع الحمض النووي ليتم حقنه (عادة 20 ميكرولتر من الحمض النووي مع 1 ميكرولتر من أخضر سريع). غادر أكثر من الحمض النووي يمكن أن يتم تخزين سريع خليط الصبغة الخضراء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
3. تنظيف منطقة تشريح، dissectiنانوغرام الأدوات وسفينة vibratome مع الايثانول 70٪. البرد HBSS كاملة بحيث يصبح باردا. البرد vibratome السفينة بواسطة التعبئة جليد حولها داخل vibratome مع بعض الماء للتبريد السريع. إعداد 3٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز باستخدام HBSS كاملة. الميكروويف لمدة 1 دقيقة. تجنب الإفراط الغليان. تبقي في بالحمام المائي 42 درجة مئوية حتى استخدامها.
4. يتم تعيين المعلمات Electroporation على النحو التالي. للحصول على E15 V جنين 35 استخدام (5)، والبقول، وطول 100 مللي و 900 مللي الفاصلة بين النبضات. لكبار السن من الحيوانات، لضمان electroporation، واستخدام الجهد العالي يصل إلى 50 فولت أو زيادة عدد نبضات يصل إلى 8 البقول. لمنع تلف الأنسجة في الحيوانات الأصغر سنا، واستخدام عدد أقل من البقول أو الحبوب لتصل إلى 2، وانخفاض التيار الكهربائي يصل الى 25 خامسا قد تختلف هذه المعلمات وتحدد تبعا تجريبيا على عمر الحيوان.

4. تشريح وElectroporation (في الفيديو)

1. بعد euthanizing امرأة حامل، تشريح الأجنة للخروج الى HBSS الجليد كاملة الباردة. كهالجيش الشعبي كل جنين في الأكياس الخاصة المشيمة الفردية.
2. تشريح الجنين خارج وقطعوا رأسه بعد فقرة الأولى. نضع في HBSS الجليد كاملة الباردة.
3. للحقن، ووضع رأسه على قطعة من Parafilm فوق طبق بيتري. استخدام العرف هاميلتون محقنة (انظر الجدول الأول) حقن حوالي 6-8 ميكرولتر من الحمض النووي: سريع مزيج الصبغة الخضراء من خلال البطين الثالث، من أجل سد في كلا البطينين الوحشي في الحويصلات القشرية. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم حقن مباشرة في كل بطين الوحشي.
4. لelectroporation المجراة سابقا، واستخدام الأقطاب الكهربائية البلاتينية BTX-منتاش. وضع القطب الموجب نحو الجانب من القشرة تريد electroporate أعلى من أي رئيس للقشرة ظهري.
5. بعد electroporation، احتضان رؤساء على الثلج لمدة لا تقل عن 5 دقائق قبل تشريح.
6. تشريح أدمغة في HBSSby الجليد الباردة جعل شق صغير على الجانب من الرأس وتقشير الجلد قبالة جانبي الرأس. المقبل، معغرامة ملقط بلطف قشر بعيدا الحنون من الدماغ. إزالة الدماغ من الجمجمة سليمة، مع الحرص على عدم الاضرار القشرة.

5. التضمين وباجتزاء من القشور Electroporated (في الفيديو)

1. نقل 3٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز في قالب كبير وضعت على الجليد. والجزء السفلي من قالب تبدأ في ترسيخ أسرع مما منع العقول من الغرق وصولا الى الجزء السفلي من العفن. بلطف، نقل أدمغة مع ملقط غرامة واحدة تلو الأخرى بعد إزالة الفائض عازلة مع Kimwipe أو ورق الترشيح. استخدام طرف الماصة 10 ميكروليتر إلى دوامة العقل المدبر داخل القالب لضمان أقصى قدر من التفاعل بين الاغاروز وأنسجة المخ.
2. توجيه العقل المدبر لضمان أن جميع العقول هي في نفس الاتجاه وعلى المستوى نفسه تقريبا في الاغاروز. السماح للالاغاروز يصلب لمدة 5 دقائق. استخدام لاصق الرابطة (الغراء مجنون) لنعلق الكتل الاغاروز بحيث بصيلات الشم واقفا. مرة واحدة وترد الكتل، إضافة على الفور أناويتم الحصول على CE HBSS الباردة وتقليم الاغاروز لجعل شرائح الفردية متأكد لكل الدماغ.
3. لشريحة وكتل، وضبط السرعة في vibratome على سرعة منخفضة (حوالي النصف كحد أقصى)، وضبط وتيرة اهتزاز شفرة على أعلى المعايير. توليد 250 ميكرون شرائح سميكة الاكليلية. استرداد شرائح باستخدام ملعقة عازمة غرامة وتحويلها إلى آبار الأنسجة بفرشاة غرامة أو ملقط.
4. في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، ونقل إلى إدراج شرائح مغلفة. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة شريحة على كل إدراج لجعل نقل سهلة. يمكن وضع ما يصل إلى 5 شرائح لكل إدراج. إزالة وسائل الاعلام يزيد من الجزء العلوي من شرائح واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب.

6. والثقافة، والتحليل من شرائح عضوي النمط (في الفيديو)

1. من أجل الحفاظ على شرائح صحي، يجب إضافة وسائل الاعلام الجديدة على الأقل مرة كل يومين تحت الغشاء عن طريق استبدال نصف وسائل الإعلام في كل مرة.
2. من أجل تحليل شرائح بعد دأيام esired في الثقافة، وتحديد الشرائح في الغشاء. تغسل مع المياه المالحة 1X الفوسفات عازلة (PBS) في 37 درجة مئوية ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة كل مرة. المقبل، وتحديد امتصاص العرق مع 4٪ (منهاج العمل) بين عشية وضحاها في 4 أو درجة مئوية لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة.
3. ويمكن تحليل شرائح مع علامات الخلوية المختلفة أو ملطخة هويشت وحدها لتصور خلايا electroporated وغير electroporated. Permeabilize ومنع شرائح لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع مصل الماعز 10٪، 0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني 1X مع الهز لطيف.
4. وصمة عار مع هويشت لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة، ويغسل 3 مرات مع 1X 10 دقيقة في كل مرة في برنامج تلفزيوني مع الهز لطيف.
5. لتركيب شرائح قطع الغشاء مع مشرط، واستخدام الملقط غرامة لنقل غشاء التي تحتوي على شرائح لزجاج بلوري الشرائح في غرفة المياه. يمكن وضع ما يصل إلى 5 شرائح لكل شريحة زجاجية. إزالة المياه الزائدة، وإضافة قطرة من حل Flourmount إلى كل شريحة في المخ. وضع بلطف ساترة على أعلى من شرائح المخ وإزالةذ فقاعات الهواء. تحليل شرائح باستخدام مجهر متحد البؤر.

7. البديل التضمين برافين من شرائح عضوي النمط (وليس في الفيديو)

1. ويمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ شرائح عضوي النمط لالبارافين لإجراء تحليل أدق الصرفي، لتحقيق هذه الغاية أن تكون ثابتة الغشاء الذي يحتوي على شرائح عضوي النمط في 4٪ PFA كما هو موضح أعلاه.
2. هي جزء لا يتجزأ من شرائح محددة في الاغاروز٪ 1 (ما قبل حرارة إلى 37 درجة مئوية)، وتعزز في الثلج لمدة 30 دقيقة. لا يمكن للكتل الاغاروز ثم تكون مرحلة ما بعد إصلاحها في PFA 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. وبعد ذلك كتلة الاغاروز التي تحتوي على شريحة عضوي النمط تكون جزءا لا يتجزأ في البارافين ومعالجتها لالمناعي كما هو موضح سابقا ^10.

8. ممثل النتائج

ويرد تمثيل شكلي للelectroporation من قشرة الفئران وثقافة شرائح عضوي النمط في الشكل 1. هذه الطريقة هي استراتيجية مفيدة لRAPIد تقييم وظيفة الجينات التي تسهم في تنمية الخلايا العصبية ^11. اعتمادا على كمية من الحمض النووي وelectroporated المرحلة الجنينية في electroporation، فإن كفاءة ترنسفكأيشن تختلف. وسوف تبدأ شرائح معربا عن GFP 8 ساعات على الأقل في مرحلة ما بعد electroporation والخلايا سيخضع التسلسل الطبيعي للأحداث العصبية (انتشار الأسلحة النووية، والهجرة، وتمايز الخلايا العصبية في وقت مبكر) في الثقافة. ويبين الشكل 2 شريحة الدماغ electroporated أن يعبر عن عنصر تحكم pSilencer-GFP يمكن للناقلات ويلاحظ المرء أسلاف الخلايا العصبية، الخلايا العصبية والخلايا العصبية المهاجرة متباينة في شريحة. وسوف تبقي شرائح عضوي النمط مورفولوجيا بهم طالما يتم الاحتفاظ بها في واجهة وسائل الإعلام في الهواء جيدة على الأغشية ويمكن أن تستخدم ما يصل إلى 5 أيام على الأقل في الثقافة.

الشكل 1. توضيح من electroporation فيفو السابقين وشريحة عضوي النمطيتم تشريح ثقافة الفحص. E14.5 أجنة خارج، وحقنها بشكل فردي مع الحمض النووي مختلطة مع صبغة خضراء سريع من أجل تصور في موقع الحقن. ويمكن حقن الحمض النووي في كل من جانبي البطينين كما هو مبين في الرسم التوضيحي أو في البطين الثالث، من أجل ملء البطينات الجانبية. بعد الحقن، وelectroporated أدمغة مع electroporator موجة مربع، ووضع القطب الموجب على الجانب المطلوب من الدماغ. هي جزء لا يتجزأ العقول في 3٪ انخفاض ذوبان الاغاروز نقطة ومقطوع باستخدام vibratome. توضع شرائح الدماغ 250 ميكرون في إدراج 0،4 ميكرون، ومثقف تصل إلى أسبوع. ويمكن ملاحظة GFP بعد 8 ساعات ترنسفكأيشن آخر.

الشكل 2. تم صبغ تحليل شرائح الدماغ electroporated. شرائح الدماغ Electroporated لHoescht. قشرة ظهري يبين الأسلاف العصبية electroporated في منطقة البطين (VZ). الخلايا العصبية في كورتيكال لوحة (اف ب) هي محددة من قبل المنطقة الهامشية (MZ). السهام البيضاء تظهر الخلايا العصبية المهاجرة. في هذه الحالة، تم حقن العقول في E15.5 وelectroporated مع عنصر تحكم pSilencer ناقلات GFP. المقاطع تمثل explants القشرية بعد 4 ايام electroporation. مقياس شريط 100 ميكرون.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها:

1. انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن: ضبط تركيز الحمض النووي تستخدم في ما لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكروليتر. دائما استخدام الحمض النووي نظيفة جدا من الإعدادية ماكسي إذا استخدام ضروري 1 إندو خالية Quiagen عدة لتنقية الحمض النووي.
2. transfected خلايا الدماغ في منطقة مختلفة عن المطلوب واحد: تأكد من أن يتم وضع أقطاب كهربائية بشكل صحيح مع الموقف القطب الموجب نحو الجانب من الدماغ إلى أن electroporated.
3. شرائح عضوي النمط يفقد مورفولوجيا: وسائل الاعلام تتغير كل يوم والتأكد من شرائح لا يتحرك في وسائل الإعلام
4. شرائح تأتي قبالة الاغاروز كما يجري قطعوا في السادسbratome: تأكد من أن يتم على واجهة جيدة عندما تضمين العقول في الاغاروز ذوبان نقطة منخفضة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذه الأساليب التي تنطوي على electroporation المجراة سابقا من البلازميدات ترميز مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر ⁽⁸⁾ وثقافة شرائح عضوي النمط ⁴ توفر مزايا عدة متميزة. أولا، هذه الطرق تسمح لإجراء تقييم سريع للرني المستمدة من الظواهر. إدراج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
هاميلتون محقنة	HAMILTON	80008	31 مقياس، و 0.5 بوصة طويلة، PT-4 (مستوى تجليف نقطة)، وحجم 10μl
البلاتين tweezertrodes	BTX	45-0489	5mm حجم
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX Footswitch	BTX	45-0208	للاستخدام مع ECM830 electroporator
تهتز مشراح شفرة	LEICA	VT1000 S
6 - طبق جيد للاستخدام مع إدراج	FALCON	353502	يحتوي على الشقوق لتتناسب مع إدراج
إدراج زراعة الأنسجة	FALCON	353090	0.4 ميكرومتر
سريع الأخضر	SIGMA	F7252
منخفض الانصهار الاغاروز	FISHER	BP165-25	الحمض النووي الصف
Laminin	سيغما الدريخ	L2020
بولي-L-يسين	سيغما الدريخ	P5899
القاعدية المتوسطة النسر	سيجما ألدريتش	B-1522
10X بدون الكالسيوم والماغنسيوم HBSS	GIBCO	14180-046
HEPES خالية من حمض	سيغما الدريخ	H4034