Методы изучения морфогенеза нейронов:<em&gt; Ex естественных условиях</em&gt; RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей

Резюме

Для проведения экспресс-оценки функции генов в развитии коры головного мозга, мы опишем методы, связанные с Бывший естественных условиях Электропорации плазмид совместно выразить тормозные РНК (РНК-интерференции) и GFP в мышиных эмбриональных мозга. Этот протокол поддается изучению различных аспектов развития нервной системы, таких как нейрогенез, миграцию нейронов и нейронных морфогенеза в том числе дендритов и аксонов результат.

Аннотация

Кора головного мозга направляет высших когнитивных функций. Это шесть слоистая структура создается в в первой, за пределами последней манере, в которой родился первый нейроны остаются ближе к желудочка в то время как последний родился нейроны мигрировать прошлом первенца нейронов на поверхности мозга ^1. В дополнение к миграции нейронов ^2, ключевой процесс для нормальной корковой функции регуляции морфогенеза нейронов ^3. В то время как нейронные морфогенеза могут быть изучены в пробирке в первичных культурах, есть много можно извлечь из того, как эти процессы регулируются в тканях среды.

Мы опишем методы для анализа миграции нейронов и / или морфогенеза в органотипической кусочки коры головного мозга ^4,6. PSilencer изменение вектора используется в который входят и промоутер U6, которая управляет двухцепочечной РНК шпильку и отдельные кассеты выражение, которое кодирует белок GFP приводом бя CMV промотора ^7-9. Наш подход позволяет оперативно оценить дефекты в аксонов от конкретных нокдауна генов-кандидатов и успешно используется в экран для регуляторов аксонов ^8. Потому что только часть клеток будет выражать RNAi конструкции, органотипической ломтиками позволяет мозаика анализ потенциальных фенотипов. Кроме того, поскольку этот анализ делается в ближайшем приближении в окружающую среду естественных условиях, он обеспечивает низкую стоимость и быстрая альтернатива поколение трансгенных животных или нокаут генов неизвестных корковых функций. Наконец, в сравнении с технологией электропорации в естественных условиях, успех бывшего экспериментов электропорации естественных условиях не зависит от развития навыков опытными хирургии и может быть выполнена с более короткие сроки подготовки и повышения квалификации.

протокол

1. Подготовка решения культуры и средств массовой информации (не видео)

1. Подготовить 1 л сбалансированный солевой Полный Хэнка решение (HBSS), содержащий 1x HBSS, 2,5 мм Hepes (pH7.4), 30 мМ D-глюкозы, 1 мМ CaCl _2, 1 мМ MgSO ₄ и 4 мМ NaHCO _3. Добавить бидистиллированной воды (DDH ₂ O). Фильтр стерилизовать с 0,2-мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° C.
2. Подготовить часть культуры среде с использованием 35 мл основной среды Eagle СМИ, 12,9 мл Полный HBSS, 20 мМ D-глюкозы (1,35 мл 1 М раствора), 1 мМ Glutamax (0,25 мл 200 мМ раствора), 0,5 мл пенициллина стрептомицин-100x акций. Фильтр стерилизовать с 0,2-мкм фильтр, а затем добавить тепла инактивированной лошадиной сыворотки до конечной концентрации 5%.
3. Подготовить Ламинин рабочего раствора, делая 1 мг / мл Ламинин маточного раствора стерильной дистиллированной деионизированной водой. Подготовить 100 мкл аликвоты в 0,5 мл пробирок Эппендорф и заморозить при температуре -80 ° C.
4. Подготовка поли-L-лизин работает такlution добавлением 5 мл стерильной H ₂ O до 5 мг поли-L-лизин, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора. Подготовить 1 мл аликвоты и заморозить при температуре -20 ° C.
5. Подготовить раствор для покрытия путем разбавления 1 мл поли-L-лизина и 100 мкл ламинин до конечного объема в 12 мл стерильной воды. Сделать это решение каждый раз свежее.

2. Подготовка органотипической вставки фрагментов (не видео)

1. Приготовьте два шесть и плит с одной культуры на вставки и использование стерильных щипцов. Добавить 2 мл стерильной DDH ₂ O под культурой вставками.
2. Добавить 1 мл раствора для нанесения покрытия на верхней части мембраны, стараясь не проколоть мембрану. Выдержите в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
3. Удалите покрытие СМИ и мыть мембраны стерильной H ₂ 0 три раза. Давайте вставки сухой перед использованием. Добавить 1,8 мл кусочек культуральной среде и в 37 ° C инкубатора. Оберните неиспользованных плит с парафильмоми хранят при температуре 4 ° С до 4 недель.

3. Подготовка к Электропорация (не видео)

1. Подготовить RNAi конструкции для электропорации. Двухместные вставки цепи РНК шпилька были клонированы в pSilencer вектор. Плазмида содержит: 1) промоутер U6, которая управляет двойной нити РНК поколения и 2) Кассета GFP выражении обусловлен промоутер ЦМВ ^8,9. Эта плазмида ранее описываемых Кониши и коллеги ⁹ и другие ^7,8. Плазмиды очищены использованием Qiagen макси-подготовительные комплект, и используется в концентрации 1 мг / мл.
2. Для того, чтобы визуализировать ДНК при введении его, подготовить 0,5% быстрый зеленый раствор красителя и использовать его в 1:20 с ДНК для инъекций (обычно 20 мкл ДНК с 1 мкл быстро зеленый). Остатки ДНК быстро зеленый краситель смесь можно хранить при температуре от -20 ° C до недели.
3. Чистая площадь вскрытия, dissectiнг инструменты и vibratome судно с 70% этанола. Холод полный HBSS так, чтобы она ледяным холодом. Холод vibratome судна упаковки лед вокруг него внутри vibratome с небольшим количеством воды для быстрого охлаждения. Подготовить 3% с низкой температурой плавления агарозы использованием полного HBSS. Микроволновая течение 1 мин. Избегайте чрезмерного кипения. Имейте в 42 ° С водяной бане до использования.
4. Электропорация параметры задаются следующим образом. Для использования эмбрионов E15 35 V, 5 импульсов, длина 100 мс, 900 мс, интервал между импульсами. Для пожилых животных, для обеспечения электропорация, использовать более высокое напряжение до 50 В или увеличить количество импульсов до 8 импульсов. Чтобы не повредить ткани у молодых животных, использовать или меньше импульсов или до 2 импульсов и низкого напряжения до 25 В. Эти параметры могут быть изменены и определяется опытным путем в зависимости от возраста животного.

4. Вскрытие и Электропорация (в видео)

1. После эвтаназии беременных женщин, анализировать эмбрионов из в ледяной полный HBSS. Keер каждый эмбрион в своем личном плацентарный мешков.
2. Проанализируйте эмбрион, и отсекли голову после первого позвонка. Имейте в ледяной полный HBSS.
3. Для инъекций, поместить голову на кусок парафильмом в верхней части чашки Петри. Использование заказ Гамильтон шприц (см. таблицу I) вводят около 6 до 8 мкл ДНК: быстрый зеленый краситель смесь через третий желудочек, чтобы заполнить обе боковых желудочков в корковых пузырьков. Кроме того, инъекция может быть сделано непосредственно в каждой боковой желудочек.
4. Для экс электропорации естественных условиях, использовать BTX-пинцет платиновыми электродами. Поместите положительного электрода в сторону коры вы хотите electroporate т.е. верхней части головы для спинного мозга.
5. После электропорации, инкубировать руководителей на льду в течение по крайней мере, 5 минут до вскрытия.
6. Проанализируйте мозги в ледяной HBSSby сделав небольшой разрез на боковой части головы и шелушение кожи по бокам головы. Далее, сштрафа щипцы осторожно удаляйте мягкой из мозга. Удалить нетронутым мозг от черепа, стараясь не повредить кору.

5. Вложения и секционирования электропорации коры (в видео)

1. Передача 3% с низкой температурой плавления агарозы в большую форму помещают на лед. В нижней части формы начнет затвердевать быстрее, что позволит предотвратить мозг от опускаясь на дно формы. Осторожно, передают мозгу с мелким пинцетом по одному после удаления избытка буфер Kimwipe или фильтровальную бумагу. Используйте 10 мкл наконечник пипетки в водоворот мозги в форму для обеспечения максимального взаимодействия между агарозы и ткани головного мозга.
2. Восток мозги, чтобы обеспечить все мозги в той же ориентации и примерно на том же уровне в агарозы. Пусть агарозном укрепить в течение примерно 5 мин. Использование клея (клей сумасшедший), чтобы присоединить агарозном блоки таким образом, что обонятельные луковицы стоя. Когда блоки крепятся сразу добавить ясе холодным HBSS и обрезать агарозном чтобы убедиться, что отдельные кусочки получаются для каждого мозга.
3. Чтобы нарезать блоки, установить скорость vibratome на низкой скорости (около половины от максимума) и установить лезвие вибрации на максимальных настройках. Создание 250-мкм корональных ломтиками. Получение срезов при использовании изогнутой тонкой лопаточкой и передавать их на ткани скважин с тонкой кисточкой или щипцами.
4. В тканях капот культуры, передача кусочки в покрытие вставками. Добавить 500 мкл среды часть культуры каждой вставки, чтобы сделать передачу легко. До 5 ломтиков могут быть размещены на вставке. Удалите излишки средств массовой информации в верхней части ломтиками и инкубировать при температуре 37 ° C в увлажненном инкубаторе.

6. Культура и анализ органотипической фрагментов (в видео)

1. Для того, чтобы поддерживать здоровый ломтиками, свежие средства массовой информации следует добавить по крайней мере, через день под мембрану заменить половину средств массовой информации каждый раз.
2. Для того чтобы проанализировать кусочки после того, как гesired дней культуры, исправить кусочки в мембране. Промыть 1x фосфат солевом буфере (PBS) при 37 ° С три раза в течение 10 минут каждый раз. Далее, фиксируем с 4% параформальдегид (PFA) в течение ночи при температуре 4 ° С или в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Фрагменты могут быть проанализированы с различных клеточных маркеров или окрашенные Hoechst только визуализировать электропорации и не электропорации клеток. Permeabilize и блокировать кусочками в течение 2 часов при комнатной температуре с 10% сыворотки козьего, 0,1% тритона в 1x PBS с нежным тряски.
4. Пятно с Hoechst в течение 1 часа при комнатной температуре, промыть 3 раза 1x PBS 10 минут каждый раз, с нежным тряски.
5. Для установки ломтиками резать мембраны с помощью скальпеля, а также использовать тонкий пинцет для передачи мембраной, содержащей срезы матовое стекло скользит в воде камеру. До 5 ломтиков могут быть размещены на стекле. Удалите излишки воды, и добавить каплю Flourmount решение каждой мозга срез. Аккуратно поместите покровное в верхней части мозга ломтиками и удалитеу пузырьков воздуха. Анализ ломтиками помощью конфокальной микроскопии.

7. Внедрение альтернативных парафин из органотипической фрагментов (не видео)

1. Органотипической ломтиками может быть встроен в парафин для тонких морфологического анализа, с этой целью мембраной, содержащей органотипической кусочки могут быть зафиксированы в 4% PFA, как описано выше.
2. Фиксированные кусочки встроенные в 1% агарозном (предварительно нагревают до 37 ° C), а также укрепили во льду в течение 30 мин. Агарозном блоков может быть после фиксировали в 4% PFA при 4 ° С в течение 30 мин.
3. Блок агарозном содержащие органотипической часть будет затем заливали в парафин и обрабатываются для иммунофлуоресценции, как описано выше ^10.

8. Представитель Результаты

Схематическое изображение электропорации мышей коры и культуры органотипической ломтиками показано на рисунке 1. Этот метод является полезным стратегии RAPIг оценки функции генов, вовлеченных в развитие нейронов ^11. В зависимости от количества ДНК электропорации и эмбриональной стадии электропорации, эффективность трансфекции будет меняться. Ломтики начнет выражения GFP не менее 8 часов после электропорации и клетки будут проходить обычную последовательность событий нейрогенный (пролиферации, миграции, и в начале дифференциации нейронов) в культуре. На рисунке 2 показан электропорации часть мозга, которая выражает контроль pSilencer-GFP вектора и можно наблюдать нейронных предшественников, миграцию нейронов и дифференцированных нейронов в срезе. Органотипической ломтики будут держать их морфологии, если они поддерживаются в хорошем медиа-воздух на мембранах и может быть использован по крайней мере до 5 дней в культуре.

Рисунок 1. Иллюстрация бывшего электропорации естественных и органотипической частькультура анализа. E14.5 эмбрионов иссекали, так и индивидуально вводили ДНК смешивается с быстрым зеленого красителя для визуализации месте инъекции. ДНК может быть введен в обоих боковых желудочков, как показано на рисунке или в третий желудочек, чтобы заполнить боковых желудочков. После инъекции мозги электропорации с квадратным электропоратора волны, размещение на положительном электроде в нужную сторону мозга. Мозги встроенные в 3% с низкой температурой плавления агарозы и секционные помощью vibratome. 250 мкм кусочки мозга помещают на 0,4 мкм вставками и культивировали в течение недели. GFP можно наблюдать через 8 часов после трансфекции.

Рисунок 2. Анализ электропорации кусочки мозга. Электропорации кусочки мозга были окрашены для Hoescht. Спинной коры показывает электропорации нейронных предшественников в желудочковой зоны (ВЗ). Нейроны в Кортикал пластины (ф) ограничиваются маргинальной зоны (МЗ). Белые стрелки показывают миграцию нейронов. В этом случае мозг вводили в E15.5 и электропорации с векторным управлением pSilencer GFP. Разделы представляют собой корковый эксплантов через 4 дня после электропорации. Шкала бар 100 мкм.

Устранение неполадок:

1. Низкая эффективность трансфекции: Регулировка концентрации ДНК использовали по крайней мере, 1 мкг / мкл. Всегда используйте очень чистой ДНК из макси подготовительные при необходимости использования эндо-бесплатно Quiagen комплект для очистки ДНК.
2. Клетки трансфекции в другой области мозга, чем хотелось бы: Убедитесь, что электроды расположены правильно с положительным электродом позиции в сторону мозга для электропорации.
3. Органотипической ломтики потеряют морфологии: Изменение СМИ каждый день, и обеспечить кусочки не плавают в СМИ
4. Ломтики оторваться агарозы как они сокращаются в VIbratome: Убедитесь, что хороший интерфейс сделан, когда вложение мозгов в низкой температурой плавления агарозы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эти методы, связанные с бывшим электропорации естественных плазмид кодирования двухцепочечной РНК шпильки ⁸ и культуры органотипической ломтиками ⁴ обеспечивают несколько явных преимуществ. Во-первых, эти методы позволяют быстро оценить RNAi производных фенотипо?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Гамильтон шприц	HAMILTON	80008	31 датчика, 0,5 дюйма длиной, ПТ-4 (уровень точки фаски), 10 мкл объема
Платиновый tweezertrodes	BTX	45-0489	5 мм, размер
ECM830 электропоратора	BTX	45-0002
BTX переключатель	BTX	45-0208	Для использования с ECM830 электропоратора
Вибрационный лезвие микротома	LEICA	VT1000 S
6 - и блюдо для использования с вставками	FALCON	353502	Содержит вырезы, чтобы соответствовать вставками
Вставками культуры ткани	FALCON	353090	0,4 мкм
Быстрый зеленый	SIGMA	F7252
Низкой температурой плавления агарозы	FISHER	BP165-25	ДНК класса
Ламинин	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-лизин	Sigma-Aldrich	P5899
Базальной среды Eagle	Sigma Aldrich	B-1522
HBSS 10x без кальция и магния	GIBCO	14180-046
HEPES-свободной кислоты	Sigma-Aldrich	H4034