의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

요약

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을 설명 예 생체내 electroporation 억제 RNA (RNAi)와 murine 배아 피질에서 GFP를 공동 표현. 이 프로토콜은 neurogenesis,의 연결을 마이 그 레이션 및 dendrite와 축삭의 파생물을 포함하여의 연결을 morphogenesis 등 neurodevelopment의 다양한 측면의 연구를 의무이다.

초록

대뇌 피질은 고등인지 기능을 연결해줍니다. 이 여섯 계층 구조는 마지막으로 태어난 뉴런은 뇌의 ^1의 표면을 향해 첫 번째 태어난 뉴런 지났 마이 그 레이션하는 동안 첫 번째 태어난 뉴런은 뇌실에 가깝게 유지하는 내부 - 먼저, 외부 - 지난 방식에 생성됩니다. 의 연결을 마이 그 ^레이션이 이외에, 정상적인 대뇌 피질의 기능을위한 핵심 프로세스의 연결을 morphogenesis ^3의 규정입니다. 의 연결을 morphogenesis는 기본 문화권의 체외에서 공부 할 수 있지만,이 프로세스가 조직 환경에서 규제하는 방식으로부터 배울 것이 많이 있습니다.

우리는 대뇌 피질 ^4,6의 organotypic 조각에의 연결을 마이 그 레이션 및 / 또는 morphogenesis을 분석하는 기법을 설명합니다. pSilencer 수정된 벡터는 이중 좌초된 머리 핀의 자형으로 RNA를 몰고 U6업자와 B를 구동 GFP 단백질을 암호화 별도의 표현 카세트를 모두 포함하는 데 사용됩니다또 CMV 프로 모터 ^7-9. 우리의 접근법은 후보 유전자의 특정 최저시 neurite 가지 결함의 신속한 평가를 허용하고 성공적으로 neurite의 파생물 ⁸ 규제에 대한 화면에 사용되었습니다. 세포만을 집합은 RNAi 구조를 표현하므로, organotypic 조각은 잠재 phenotypes의 모자이크 분석을 위해 수 있습니다. 이 분석은 생체내 환경의 가까운 근사치에 완료되기 때문에 더구나, 그것은 미지의 대뇌 피질 기능의 유전자에 대한 낮은 비용과 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 마지막으로 생체내의 electroporation 기술에 비해, 전직 생체내의 electroporation 실험의 성공 여부는 능숙하게 수술 기술 개발에 의존 아니므로 짧은 훈련 시간과 기술이 함께 수행할 수 있습니다.

프로토콜

1. (아니라 비디오) 문화 솔루션 및 미디어 준비하기

1. 1X HBSS, 2.5 MM Hepes (pH7.4), 30 MM D-글루코오스, 1 ㎜ CaCl _2, 1 ㎜ MgSO _4와 4 MM NaHCO _3을 포함하는 완전한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 리터를 준비합니다. 이중 증류수 (ddH ₂ O)를 추가합니다. 4에 0.2-μm의 필터 및 매장 ° C.로 소독을 필터링
2. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 이글 매체의 35 ML을 사용하여 슬라이스 문화 매체, 전체 HBSS의 12.9 ML, 20 MM D-글루코오스 (1 M 솔루션의 1.35 ML), 1 ㎜ Glutamax (200 MM 솔루션의 0.25 ML), 페니실린 0.5 ML 준비 - 스트렙토 마이신 100x 주식. 0.2-μm의 필터로 멸균을 필터링한 후 5 % 최종 농도로 혈청 열 inactivated 목마를 추가합니다.
3. 1 MG / 멸균 증류수 탈이온수와 ML Laminin 주식 솔루션을 만들어 Laminin 작업 솔루션을 준비합니다. -80에서 0.5 ML eppendorf 튜브에서 100 μL aliquots을 준비하고 동결 ° C.
4. 그래서 폴리-L-라이신 작업 준비1 MG / ML 주식 솔루션을 만들기 위해 폴리-L-라이신의 5 MG로 멸균 H ₂ O 5 ML를 추가하여 lution. -20 ° C.에서 1 ML aliquots과 프리즈를 준비
5. 멸균 물 12 ML의 최종 볼륨 폴리-L-라이신 1 ML과 laminin의 100 μL를 diluting하여 코팅 용액을 준비한다. 매번 신선이 솔루션을 확인하십시오.

2. Organotypic 슬라이스 삽입을합니다 (동영상) 준비

1. 한 문화 삽입마다 잘 멸균 포셉을 이용하여 2 백 6 - 웰 플레이트를 준비합니다. 문화 삽입 아래 무균 ddH ₂ O 2 ML을 추가합니다.
2. 찔린에 멤브레인 처리하지 복용 막 위에 코팅 용액 1 ML을 추가합니다. 37 humidified 배양기에서 하룻밤 품어 ° C에서 5 % CO _2.
3. 코팅 미디어를 제거하고 살균 H ₂ 0 세 번으로 멤브레인 씻는다. 사용하기 전에 건조 삽입하자. ° C 배양기에서 37 슬라이스 문화 매체와 장소의 1.8 ML을 추가합니다. Parafilm과 함께 사용하지 않는 접시 감싸주세요그리고 최대 4 주까지 4 ° C에서 저장합니다.

3. (아니라 비디오) Electroporation 준비하기

1. electroporation을 위해 RNAi의 구조를 준비합니다. 더블 스트랜드 RNA의 머리 핀의 자형 삽입은 pSilencer 벡터로 복제되었다. 플라스미드가 포함되어 있습니다 : 1) 이중 가닥 RNA 생성하게 만들수있는 U6업자, 그리고 2) GFP 발현 카세트가 CMV 프로 모터에 의해 구동 ^8,9. 이 플라스미드는 이전 코니시 및 동료 ^9, 다른 ^7,8에 의해 설명되었다. Plasmids는 Qiagen 맥시 간이 키트를 사용하여 정제, 1 밀리그램 / ML의 농도로 사용됩니다.
2. 그것을 주입하는 동안 DNA를 시각화하기 위해서는 0.5 % 빠른 녹색 염료 솔루션을 준비하고 (일반적으로 빠른 그린의 1 μL와 DNA 20 μL) 주입되는 DNA로 1시 20분에서 사용합니다. 남은 DNA가 빠른 녹색 염료 혼합물은 최대 일주일 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 깨끗한 절개 지역 dissectiNG 도구와 70 %의 에탄올과 v​​ibratome 들어왔습니다. 그것이 얼음 춥다 있도록 완벽한 HBSS를 풀어. 급속한 냉각을위한 물 vibratome에서나 주위 얼음을 포장하여 칠이 vibratome 용기. 전체 HBSS를 사용 3% 낮은 용융 점 아가로 오스를 준비합니다. 1 분 용 마이크로 웨이브. 끓는 동안 피한다. 사용할 때까지 42 ° C ~ waterbath에 두십시오.
4. Electroporation 매개 변수는 다음과 같이 설정됩니다. E15 배아 사용에 35 V의 경우, 5 펄스, 100 MS 길이, 펄스 사이의 900 MS 간격. 오래된 동물의 경우 electroporation을 위해, 50 V에 높은 전압을 사용 또는 8 펄스로 펄스의 개수를 증가시킬 수 있습니다. 어린 동물에서 조직 손상을 방지하기 위해 25 중 적은 펄스 또는 최대 2 펄스와 낮은 전압을 사용하여 V. 이러한 매개 변수는 다양하고 경험적으로 동물의 나이에 따라 결정됩니다.

4. 해부 및 Electroporation (동영상)

1. 임신 여성 euthanizing 후, 얼음 추위 전체 HBSS로 배아를 해부. 별처럼그들의 개인 placental 주머 니나 각 배아를 EP.
2. 배아를 해부하고 첫 번째 척추 후 머리를 잘라. 얼음 추위 전체 HBSS에 두십시오.
3. 주사의 경우 배양 접시 위에 Parafilm의 조각에 머리를 놓습니다. 피질 vesicles의 두 측면 심실을 작성하기 위해 세 번째 뇌실을 통해 빠른 녹색 염료 믹스 : 사용자 정의를 사용하면 해밀턴 주사기 DNA의 8-6에 대한 μL를 주입 (제가 표 참조)했다. 또는 주사는 각 측면 뇌실에 직접 수행할 수 있습니다.
4. 전직 생체내 electroporation의 경우, BTX-트위터의 백금 전극을 사용합니다. 당신 지느러미 피질을 위해 머리 즉, 상단을 electroporate하려는 피질의 편으로의 긍정적인 전극을 배치합니다.
5. electroporation 후 해부하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 머리를 품어.
6. 얼음 추위 HBSSby은 머리의 측면에 작은 절개를 만들고 머리의 측면 떨어져 피부를 필링으로 뇌를 해부. 와 다음부드럽게 벗겨 버릴 미세 포셉 두뇌에서 PIA. 피질을 손상하지 않도록 돌보는 두개골에서 그대로 두뇌를 제거합니다.

5. (비디오) 삽입 및 Electroporated Cortices의 Sectioning

1. 빙판에 놓여 대형 금형에 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 전송합니다. 금형의 하단보다 빠르게 금형의 하단 아래로 가라앉고에서 머리를 방지할 수있는 응고하기 시작합니다. 부드럽게, 알았어 포셉 Kimwipe 또는 여과지로 여분의 버퍼를 제거 후 하나씩 함께 머리를 전송합니다. 아가로 오스와 뇌 조직 사이의 최대 인터페이스를 보장하기 위해 금형 내부의 소용돌이 머리에 10 μL pipet 팁을 사용합니다.
2. 모든 머리를 보장하는 동양 두뇌가 같은 방향으로하고 아가로 오스에 대해 동일한 수준입니다. 아가로 오스는 약 5 분 동안 응고하자. 후각 전구가 서되도록 아가로 오스 블록을 부착하는 본딩 접착제 (미친 접착제)를 사용합니다. 블록이 첨부되면, 즉시 전 추가CE 감기의 HBSS와 반드시 개별 조각을 만드는 아가로 오스 잘라 각 뇌를 얻을 수 있습니다.
3. , 블록을 썰어 저속 (반 최대 약)에 vibratome의 속도를 설정하고 가장 높은 설정에 날개 진동 주파수를 설정합니다. 250 μm의 두께 코로나 슬라이스를 생성합니다. 구부러진 미세 주걱을 사용하여 조각을 검색하고 벌금 브러시 또는 집게로 조직 우물로 전송할 수 있습니다.
4. 조직 문화 후드에 코팅된 인서트로 조각을 전송. 전송이 용이하도록 각 인서트로 슬라이스 문화 미디어 500 μL를 추가합니다. 최대 5 조각까지가 삽입마다 배치될 수 있습니다. 조각의 위로부터 초과 미디어를 제거하고 37 ° C에서 humidified 인큐베이터에서 부화.

6. 문화 Organotypic 조각의 분석 (동영상)

1. 건강한 조각을 유지하기 위해서는 신선한 미디어는 미디어 매번의 절반을 대체하여 멤브레인 밑에 적어도 매일 추가됩니다.
2. D 이후 조각을 분석하기 위해서는문화 esired 일, 멤브레인에서 슬라이스를 수정. ° C에서 세 번 10 분, 각 시간을 37 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다음, 4 ° C에 또는 상온에서 1 시간을위한 야간 4 % Paraformaldehyde (PFA)로 수정 프로그램입니다.
3. 조각이 다른 세포 마커로 분석하거나 electroporated 및 비 electroporated 세포를 시각화하는 혼자 Hoechst 물들일 수있다. Permeabilize와 10 % 염소 혈청, 부드러운 진동과 1X PBS에 0.​​1 %의 트리톤과 함께 실온에서 2 시간을위한 조각을 차단합니다.
4. 상온에서 1 시간 동안 Hoechst와 청바지, 때마다 부드러운 진동과 함께 1X PBS로 10 분들과 3 회 씻는다.
5. 조각은 메스와 멤브레인를 잘라 마운트하고, 서리 낀 유리 조각을 포함 멤브레인를 전송하는 멋진 집게를 사용하는 것은 물 챔버에서 슬라이드. 최대 5 조각은 유리 슬라이드마다 배치될 수 있습니다. 여분의 물을 제거하고, 각 뇌 슬라이스에 Flourmount 용액 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 뇌 조각 위에 coverslip을 배치하고를 제거Y 공기 거품이. 공촛점 현미경을 사용하여 슬라이스를 분석합니다.

7. Organotypic 조각의 대체 파라핀의 임베딩합니다 (동영상)

1. Organotypic 조각도이를 위해 세밀한 형태학의 분석을 위해 파라핀을 위해 임베디드 수 organotypic 조각이 들어있는 막은 PFA는 위에서 설명한 것처럼 4%에서 수정하실 수 있습니다.
2. 고정 조각은 1퍼센트 아가로 오스 (37 ° C로 미리 예열)에 임베디드, 그리고 30 분 동안 얼음에서 확정됩니다. 아가로 오스 블록 그런 다음 30 분 동안 4 ° C에서 4퍼센트 PFA에서 사후 해결할 수 있습니다.
3. organotypic 슬라이스를 포함하는 아가로 오스 블록 후 파라핀에 포함된하고 이전 ¹⁰ 설명된대로 immunofluorescence을위한 처리됩니다.

8. 대표 결과

organotypic 조각의 murine 피질과 문화 electroporation의 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 이 방법은 rapi를위한 유용한 전략입니다의 연결을 개발 ^11에 관련된 유전자의 기능의 D 평가. DNA electroporated의 양과 electroporation에서 배아 단계에 따라 transfection 효율이 달라집니다. 조각은 적어도 8시간 포스트 electroporation과 세포 문화 neurogenic 이벤트 (증식, 이주, 그리고 초기의 연결을 분화)의 정상적인 순서를 받게 될 것이다 GFP를 표현하기 시작합니다. 그림 2는 pSilencer-GFP 컨트롤을 표출하는 electroporated 뇌의 슬라이스를 보여줍니다 벡터와 하나의 연결을 progenitors, 마이 그 레이션 뉴런과 슬라이스의 차별화된 뉴런을 관찰하실 수 있습니다. 그들이 세포막에 좋은 미디어 에어 인터페이스에 유지하고 있으며 문화에 적어도 5 일 이내에 사용할 수있는 Organotypic 조각은 긴 것처럼 그들의 형태를 유지합니다.

1 그림. 전직 생체내의 electroporation과 organotypic 슬라이스의 삽화문화 분석. E14.5 배아 밖을 해부하고, 개별적으로 사출 사이트를 시각화하기 위해 빠른 녹색 색소가 섞인 DNA에 주입하고 있습니다. 측면 심실을 채우기 위해 그림에 또는 제 3 뇌실에 묘사된대로 DNA가 측면 심실 모두에서 주입 수 있습니다. 주사 후, 두뇌는 두뇌의 원하는 측면에 긍정적인 전극을 배치 평방 파도 electroporator로 electroporated있다. 두뇌는 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스와 vibratome를 사용 sectioned에 포함됩니다. 250 μm의 뇌 조각은 0.4 μm의 삽입에 위치하고 주일까지 배양해 있습니다. GFP는 8 시간 포스트 transfection 후 볼 수 있습니다.

그림 2. electroporated 뇌 슬라이스의 분석. Electroporated 뇌 조각이 Hoescht 위해 물들어 있었다. 등 부분의 피질 심실 구역 (VZ)에서 electroporated의 연결을 progenitors를 보여줍니다. corti의 뉴런칼 플레이트 (CP)는 한계 구역 (MZ)로 구분된 있습니다. 흰색 화살표가 이주 뉴런을 보여줍니다. 이 경우, 두뇌는 E15.5에 주입되었고 pSilencer GFP 제어 벡터와 electroporated. 섹션 4 일 electroporation 후 피질 explants를 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의.

문제 해결 :

1. 낮은 transfection 효율 : 최소 1 μg / μL에 사용된 DNA의 농도를 조정합니다. 필요한 사용 엔도 무료 Quiagen 키트는 DNA를 정화하는 경우에는 항상 맥시의 초등학교에서 매우 깨끗한 DNA를 사용합니다.
2. 한 원하는 아닌 다른 뇌 영역에 transfected 세포가 : 전극이 electroporated되는 두뇌의 측면에 대한 긍정적인 전극의 위치에 정확하게 위치하고 있는지 확인합니다.
3. 매일 변경 매체와 조각 미디어에 떠되지 않도록 : Organotypic 조각은 형태를 잃게
4. 그들이 바이올렛에 절단되는대로 조각은 아가로 오스 그만 좀bratome : 낮은 용융 점 아가로 오스에 머리를 삽입하면 좋은 인터페이스가 만들어되었는지 확인하십시오.

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토론

이중 좌초된 RNA 헤어핀 ^{8과 4는} 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공 organotypic 조각 문화 인코딩 plasmids의 전직 생체내의 electroporation을 포함한 이러한 방법. 첫째, 이러한 방법은 RNAi 파생 phenotypes의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이중 좌초된 RNA의 머리핀을 운전 U6 프로 모터를 포함하는 동일한 pSilencer 벡터의 표현 카세트 인코딩 GFP의 포함은 RNAi 벡터와 electroporated 세포의 신속한 식별 및 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
해밀턴 주사기	해밀턴	80,008	0.5 인치 길이 31 게이지, PT-4 (포인트 beveling 수준), 10μl 부피
플래티넘 tweezertrodes	BTX	45-0489	5mm 크기
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX Footswitch	BTX	45-0208	ECM830 electroporator 함께 사용하기위한
블레이드 마이크로톰 진동	LEICA	VT1000 S
6 - 삽입과 함께 사용하기 위해 잘 요​​리	매	353,502	삽입에 맞게 노치를 포함
조직 문화에 삽입	매	353,090	0.4 마이크로 미터
빠른 그린	시그마	F7252
낮은 녹는 아가로 오스	어부	BP165-25	DNA 학년
Laminin	시그마 - 올드 리치	L2020
폴리-L-라이신	시그마 - 올드 리치	P5899
기저 중간 이글	시그마 알드리치	B-1522
칼슘과 MG없이 10X HBSS	GIBCO	14180-046
HEPES없는 산	시그마 - 올드 리치	H4034