عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

Summary

وصفت طريقة بسيطة لتحليل الآثار المترتبة على الأنسجة الليفية في الخلايا الظهارية المرتبطة بها. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة وثلاثي الأبعاد زراعة الأنسجة تسهيل تحليل الخلايا بعد العزلة من 3D. هذه التقنية قابلة للتطبيق على خلايا مختلفة المحتملة الخبيثة، مما يسمح للدراسة منهجية للآثار ورم المرتبطة سدى على الخلايا السرطانية.

Abstract

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors^1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension^3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture³. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.

The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized⁴. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells⁵. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals⁶. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors⁷.

Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion^8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)^16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections²³. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

Protocol

1. تأسيس ثلاثي الأبعاد المشارك الثقافات

1. قبل يوم من إقامة المؤسسات المشتركة في الثقافات، وإزالة Matrigel من الفريزر وذوبان الجليد على الجليد في الثلاجة 4 درجات مئوية خلال الليل.
2. في يوم من التجربة، وإعداد وسيلة للثقافة المشتركة، والتي تتطابق مع متوسط ​​للخلايا الظهارية لاستخدامها (وسط HMEC في هذا المثال: DME/F12 المتوسط ​​مع 10٪ مصل العجل البقري، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين ، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، و1 نانوغرام / مل EGF). الحفاظ على المتوسط ​​في ساعة على الأقل 1 الجليد قبل الاختلاط مع Matrigel.
3. لتخفيف Matrigel إذابة، وتحديد الكمية الإجمالية المطلوبة من Matrigel: متوسطة (300 ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 جيدا لوحات)، ويضاف نصف هذا الحجم من الثلج الباردة المتوسطة HMEC إلى أنبوب معقم على الجليد. ثم يضيف نفس نصف مجموع حجم Matrigel إذابة للأنبوب لتحقيق تخفيف 1:1. الحفاظ على أنبوب على الجليد.
4. مكان 50 ميكرولتر من Matrigel: خليط المتوسطة منتصف جيدا في الآبار المخصصة لوحة 24-جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع مرطب الهواء، و 5٪ CO _2.
5. إضافة مبلغ إضافي 450 ميكرولتر من Matrigel: خليط المتوسطة إلى الآبار واحتضان لمدة 60 دقيقة.
6. أثناء الحضانة، وإعداد وتعليق 01:01 من الخلايا الليفية (هنا لحد من الخلايا الليفية H-ثالثي خلد الثديية معربا عن GFP) والخلايا الظهارية (هنا الإنسان الثديية H-ثالثي خلد خط الخلايا الظهارية معربا عن RFP) بتركيز 0.5 × 10 ⁵ خلايا في كل 0.5 مل من المتوسط ​​HMEC.
7. بعد الخطوة حضانة لمدة 60 دقيقة، وانخفاض بلطف تعليق الخلية على الجزء العلوي من هلام طدت، والعودة إلى ثقافة الحاضنة.
8. لا تعكر صفو الثقافات لمدة 2 ايام. بعد هذا، يمكن تغيير كل 2-3 أيام المتوسط ​​بواسطة الشفط جدا بلطف المتوسطة من جانب جيدا وبلطف مع استبدال المتوسطة HMEC الطازجة.
9. رصد تشكيل كروي يوميا تحت المجهر. الثقافات عادة ما تكون ناضجة بعد 10-14 يوما. الصورة كماالمناسبة باستخدام ضوء الفلورسنت أو المجهري. ويمكن قياس حجم كروي وطول إسقاط تحت المجهر الضوئي.

2. عزل خلايا من الجسم الشبه الكروي المشارك الثقافات

1. بلطف شديد، ماصة للثقافة صعودا ونزولا 10X باستخدام معقم ماصة الزجاج 2 مل. بدلا من ذلك، قطع غيض من طرف ميكروليتر 1000 ماصة بلاستيكية معقمة باستخدام مقص أو عن طريق جهاز الأوتوكليف الانغماس في الايثانول 70٪ من أجل ماصة للثقافة. نقل ثقافة إما مع ماصة الزجاج أو خفض رأس ماصة بلاستيكية معقمة إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. ستقوم الأجسام الشبه الكروية الخلوية الرواسب في القاع.
2. استخدام معقم طرف ماصة باستير لإزالة بلطف Matrigel تعطلت من الجزء العلوي من أنبوب يتم طرده مركزيا.
3. إضافة 1 مل المتوسطة HMEC إلى مكعبات الأجسام الشبه الكروية، ماصة صعودا وهبوطا 2-3 مرات مع معقم 2 ماصة زجاج مل، ونقل الثقافة إلى بئر في بئر-24نسيج لوحة الثقافة.
4. السماح للالأجسام الشبه الكروية لتعلقها على طبق ما لا يقل عن 48 ساعة قبل تغيير المتوسطة. مع مرور الوقت سوف الخلايا ترك الهياكل كروي وتنمو كما monolayers.
5. مرور الخلية الثقافات عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا بنسبة 50٪. أولا إظهار الثقافة إلى صحن 35 ملم (حوالي 2-4 أيام)، ثم إلى صحن 100 ملم (حوالي 3-5 أيام). مباشرة قبل مرور كل خطوة، واستخدام معقم باستور ماصة لإزالة يدويا كما كثير المتبقية "الأجسام الشبه الكروية الأشباح" قدر الإمكان.
6. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لنقاء السكان الذين يستخدمون المناسبة علامات سطح الخلية، وكذلك فصل السكان خلية مختلفة عن طريق الفرز الخلية مضان إذا لزم الأمر. خلايا معزولة الآن على استعداد لمزيد من التحليل على النحو المرغوب فيه.

3. ممثل النتائج

في ثلاثي الأبعاد كروي شارك في الثقافات، والخلايا الليفية مع إسكات Tiam1 هندسيا لحث على غزو زيادة في درجة الماجستيرتريكس بواسطة الخلايا الظهارية الثديية (الشكل 1، مقارنة D، E، F إلى A، B، C). الليفية مع المهندسة الإفراط في التعبير عن Tiam1 حث انخفض غزو مصفوفة من قبل خلية خط سرطان الثدي SUM159 (الشكل 1، مقارنة J، K، L إلى G، H، I).

مرة واحدة وضعت التعاون مثقف الأجسام الشبه الكروية، يمكن عزل السكان خلية من الأجسام الشبه الكروية من قبل إعادة الطلاء في سياق ثنائي الأبعاد، كما هو مبين في الشكل 2. اعتمادا على معدلات النمو النسبي للخلايا اختبار، قد تظهر من خلال السكان محض مرور مسلسل (كما هو موضح في الشكل 3) أو يمكن فرز باستخدام علامات الخلية المناسبة. بعد عزلة من 3D المشترك والثقافة، والخلايا الظهارية الإبقاء على الخصائص التي تمنحها الثقافة بالتعاون مع الخلايا الليفية على مدى فترات طويلة من الوقت، مما يتيح فرصة واسعة للتحليل. في هذا المثال، التي يسببها التعرض للTiam1 التي تعاني من نقص الخلايا الليفية تزايد الهجرة في التعاون مثقف HMECs التي استمرت لأسابيعfter بمعزل عن ثقافة مشتركة 3D (الشكل 4).

الشكل 1. التصوير من وضع كروي شارك في ثقافات تحت المجهر الضوئي ومضان. وتنشأ الثقافات كروي مع الثدي خطوط الخلايا الظهارية والخلايا الليفية، وسمحت للنمو في الثقافة لمدة 10-14 يوما. AF: الظهارية = HMEC-mCherry الخلايا. GL: الخلايا الظهارية = SUM159-mCherry الخلايا. AC، GI: الليفية = سيطرة RMF-GFP الخلايا. DF: الليفية = RMF-GFP مع Tiam1 إسكات. JL: الليفية = RMF-GFP مع Tiam1 الإفراط في التعبير. الأسهم تشير التوقعات الظهارية الغازية في المصفوفة.

الشكل 2. تصوير المسلسل بين الثقافات تحت المجهر الضوئي ومضان بعد بمعزل عن ثقافة Matrigel. يوم 0 يمثل التصوير مباشرة بعد العزلة؛ أيام 1 و 2 و5 تبين بعد أيام من العزلة. الهالة من الخلايا ترك زيادات كروي على مر الزمن. في نهاية المطاف "الأشباح" كروي مع عدد قليل جدا من الخلايا لا يزال (السهم). الأجسام الشبه الكروية عدد قليل جدا من تبقى بعد إزالة شبح والمقطع الاول.

الرقم التدفق الخلوي 3. تحليل الخلايا بعد العزلة من Matrigel شارك في الثقافة. بعد كروي شارك في الثقافات قد نضجت، يتم عزل الخلايا من 3D التعاون مع ثقافة pipetting المسلسل والركض. ويتم تحليل عينة من aliquots التدفق الخلوي (في هذا المثال باستخدام مضان أخضر مضان والحمراء لتحديد GFP، معربا عن الخلايا الليفية وmCherry في التعبير عن الخلايا الظهارية على التوالي) لتحديد السكان النسبي الخلايا الطلائية والخلايا الليفية.

الشكل 4. Transwell هجرة HMECs استمرت بعد isolatiعلى من Matrigel شارك في الثقافة. مرة واحدة قد تم الحصول عليها من السكان من خلال ثقافة نقية أو مضان الفرز الخلية، يمكن تحليل الخلايا على النحو المرغوب فيه. هنا تم تقييم هجرة HMECs التعاون مع أي مثقف التحكم (C) أو Tiam1 ناقص (SHT) الليفية عبر transwells مثقب في الأسابيع 2 و 4 و 8 بعد بمعزل عن ثقافة مشتركة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا يمثل نهجا بسيطة لتحليل آثار الليفية اللحمية في الخلايا الظهارية، بما في ذلك الخلايا السرطانية. لأنها تتيح للتفاعل الخلية خلية مباشرة في سياق ثلاثي الأبعاد بدعم من خارج الخلية المصفوفة غشاء السرداب، في حين تمكن سهل الاستخراج من الخلايا من مصفوف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
دينار بحريني Matrigel	العلوم البيولوجية دينار بحريني	356237	الفينول الحمراء مجانا
Hyclone متوسطة السائل الكلاسيكية: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone البقري العجل المصل	ThermoScientific	SH3007303
الانسولين	EMD كيماويات	407709	يذوب في حمض الهيدروكلوريك 0.005N؛ 0.22 فلتر ميكرومتر
هيدروكورتيزون	سيغما الدريخ	H4001	تذوب في EtOH 50٪؛ 0.22 فلتر ميكرومتر
EGF	سيغما الدريخ	E9644	تذوب في حامض الخليك 10MM؛ 0.22 ميكرومتر فلتر