Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

Resumen

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Resumen

Mientras que los enormes esfuerzos han ido a la identificación de vías de señalización y las moléculas que intervienen en los comportamientos de células normales y malignas ^1-2, gran parte de este trabajo se ha hecho con clásicos bidimensionales modelos de cultivo celular, que permiten la manipulación de células fácil. Ha quedado claro que las vías de señalización intracelulares se ven afectados por las fuerzas extracelulares, incluyendo la dimensionalidad y la tensión de la superficie celular ^3-4. Múltiples enfoques se han tomado para desarrollar modelos en tres dimensiones que representan con mayor precisión la arquitectura biológica del tejido ^3. Si bien estos modelos incorporan la multidimensionalidad y las tensiones arquitectónicas, el estudio de los consiguientes efectos sobre las células es menos fácil que en el cultivo de tejidos en dos dimensiones debido a las limitaciones de los modelos y la dificultad en la extracción de las células para su posterior análisis.

El importante papel del microambiente alrededor de los tumores en la tumorigénesis y el comportamiento del tumors cada vez más reconocido ^4. Estroma del tumor se compone de múltiples tipos de células y moléculas extracelulares. Durante el desarrollo del tumor hay señales bidireccionales entre las células tumorales y las células del estroma ^5. Aunque algunos de los factores que participan en el tumor de estroma-co-evolución han sido identificados, todavía hay una necesidad de desarrollar técnicas sencillas para identificar de forma sistemática y estudiar toda la gama de estos ⁶ señales. Los fibroblastos son el tipo de célula más abundante en los tejidos normales o estroma del tumor asociado, y contribuir a la deposición y el mantenimiento de la membrana basal y factores de crecimiento paracrinos ^7.

Muchos grupos han utilizado tres sistemas de cultivo de dimensiones para estudiar el papel de los fibroblastos en varias funciones celulares, incluyendo la respuesta del tumor a los tratamientos, el reclutamiento de células inmunes, las moléculas de señalización, proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la invasión de ^8-15. Hemos optimizado un método sencillo para el culoessing los efectos de los fibroblastos mamarias en células epiteliales mamarias utilizando un modelo de matriz extracelular comercialmente disponible para crear tridimensionales cultivos de las poblaciones de células mixtas (co-cultivos) ^16-22. Con continua co-cultivo de las células formar esferoides con la agrupación fibroblastos en el interior y las células epiteliales en gran medida en el exterior de los esferoides y formando multicelulares proyecciones en la matriz. La manipulación de los fibroblastos que conduce a la invasividad de las células epiteliales alterados pueden ser fácilmente cuantificados por cambios en el número y la longitud de las proyecciones epiteliales ^23. Además, hemos ideado un método para aislar células epiteliales de tres dimensiones de co-cultivo que facilita el análisis de los efectos de la exposición de fibroblastos en el comportamiento epitelial. Hemos encontrado que los efectos de co-cultivo persistir durante semanas después del aislamiento de células epiteliales, permitiendo tiempo suficiente para realizar ensayos múltiples. Este método es adaptable a las células devariable potencial maligno y no requiere equipo especializado. Esta técnica permite la evaluación rápida de los modelos de células in vitro bajo condiciones múltiples, y los resultados correspondientes se pueden comparar con los modelos in vivo de tejidos animales, así como muestras de tejidos humanos.

Protocolo

1. El establecimiento de tres dimensiones Co-culturas

1. El día antes de establecer la co-culturas, retire el Matrigel del congelador y descongele el hielo en un refrigerador de 4 ° C durante la noche.
2. En el día del experimento, preparar el medio para el co-cultivo, que corresponde al medio para las células epiteliales que se utilizarán (medio HMEC en este ejemplo: DME/F12 medio con 10% de suero bovino ternero, 5 ug / ml de insulina , 1 mg / ml de hidrocortisona, y 1 ng / ml de EGF). Mantener el medio en hielo al menos 1 hora antes de mezclar con Matrigel.
3. Para diluir el Matrigel descongelado, determinar la cantidad total deseada de Matrigel: medio (300 ml por pocillo de placas de 24 pocillos) y agregue la mitad que el volumen de helado a medio HMEC a un tubo estéril sobre hielo. Luego se agrega el mismo medio-volumen total de Matrigel descongelado al tubo para lograr una dilución 1:1. Mantenga el tubo en hielo.
4. Colocar 50 l de Matrigel: mezcla medio mediados de bien en pozos designados de una placa de 24 pocillos yincubar durante 10 min en una incubadora a 37 ° C con aire humidificado y 5% de CO _2.
5. Añadir un adicional de 450 l de Matrigel: mezcla de medio a los pocillos y se incuba durante otros 60 minutos.
6. Durante la incubación, preparar una suspensión 1:1 de los fibroblastos (aquí h-TER-inmortalizadas fibroblastos reducción mamaria expresan GFP) y células epiteliales (aquí h-TER-inmortalizada humano línea de células epiteliales mamarias expresar SDP) a una concentración de 0,5 x 10 ⁵ células cada una en 0,5 ml de medio HMEC.
7. Después de la etapa de incubación de 60 minutos, suavemente caer la suspensión celular en la parte superior del gel solidificado, y devolver la cultura a la incubadora.
8. No moleste a los cultivos durante 2 días. Después de esto, medio puede ser cambiado cada 2-3 días por medio de aspiración muy suavemente desde el lado del pozo y suavemente reemplazar con medio fresco HMEC.
9. Supervisar la formación esferoide día bajo el microscopio. Las culturas son generalmente madura después de 10-14 días. La imagen comoapropiado usando la luz o microscopía de fluorescencia. El tamaño y la longitud del esferoide de proyección se puede medir con microscopía de luz.

2. Aislamiento de células de Esferoide Co-culturas

1. Muy suavemente, pipetear la cultura y 10x hacia abajo con una solución estéril de 2 ml pipeta de vidrio. Por otra parte, cortar la punta de una punta de pipeta de plástico de 1000 microlitros con unas tijeras esterilizadas en autoclave o por inmersión en etanol al 70% con el fin de la pipeta de la cultura. Transferir el cultivo, ya sea con la pipeta de vidrio o la punta de corte a una pipeta de plástico estéril 15 ml tubo de centrífuga y se centrifuga durante 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Los esferoides celulares se sedimento en el fondo.
2. Utilizar una punta de pipeta Pasteur estéril para eliminar suavemente el Matrigel interrumpido desde la parte superior del tubo se centrifugó.
3. Añadir 1 ml de medio HMEC a los esferoides granuladas, pipetear hacia arriba y abajo 2-3 veces con una pipeta estéril de 2 ml de vidrio, y transferir la cultura de un pozo en un 24 yplaca de cultivo de tejidos.
4. Permita que los esferoides para insertarse en el plato por lo menos 48 horas antes de cambiar el medio. Con el tiempo las células se dejan las estructuras esferoidales y crecer como monocapas.
5. Pasaje de la célula culturas cuando las células alcanzan el 50% de confluencia. En primer lugar ampliar el cultivo a una placa de 35 mm (aproximadamente 2-4 días), y luego a una cápsula de 100 mm (aproximadamente 3-5 días). Inmediatamente antes de cada paso paso, utilizar una pipeta Pasteur estéril para eliminar manualmente como muchos "esferoides fantasma" residual como sea posible.
6. Analice las células por citometría de flujo para la pureza de la población con adecuados marcadores celulares de superficie y otras poblaciones distintas de células diferentes de células de clasificación de fluorescencia, si es necesario. Las células aisladas son ahora listo para su posterior análisis como se desee.

3. Los resultados representativos

En tres dimensiones esferoide co-cultivos, los fibroblastos con ingeniería Tiam1 silenciamiento inducir la invasión aumentó en matrix por las células epiteliales mamarias (Figura 1, comparar D, E, F y A, B, C). Los fibroblastos con ingeniería sobre-expresión de Tiam1 inducir invasión disminuyó matriz por la línea celular de cáncer de mama SUM159 (Figura 1, comparar J, K, L a G, H, I).

Una vez que la co-cultivadas esferoides se han establecido, las poblaciones de células pueden ser aisladas de esferoides por re-chapado en un contexto de dos dimensiones, como se muestra en la Figura 2. Dependiendo de las tasas relativas de crecimiento de las células de la prueba, las poblaciones puras pueden surgir a través del paso de serie (como se muestra en la Figura 3) o se pueden clasificar utilizando marcadores apropiados de células. Después del aislamiento de 3D co-cultivo, las células epiteliales retener las propiedades conferidas por co-cultivo con fibroblastos durante períodos prolongados de tiempo, permitiendo una amplia oportunidad para el análisis. En este ejemplo, la exposición a Tiam1 deficientes en fibroblastos migración inducida por el aumento en la co-cultivadas HMECs que persistió durante semanas unaD espués de aislamiento de 3D ​​co-cultivo (Figura 4).

Figura 1. Imagen del esferoide estableció co-cultivos con microscopía de luz y fluorescencia. Culturas esferoides se establecen con líneas de células epiteliales mamarias y de los fibroblastos y se dejan crecer en cultivo durante 10-14 días. AF: epiteliales = HMEC-mCherry células. GL: las células epiteliales = SUM159-mCherry células. AC, GI: = fibroblastos de control RMF-GFP células. DF: fibroblastos = RMF-GFP con Tiam1 silenciamiento. JL: fibroblastos = RMF-GFP con Tiam1 sobre-expresión. Las flechas indican las proyecciones epiteliales invasoras en la matriz.

Figura 2. Serie de imágenes de las culturas con microscopía de luz y fluorescencia después del aislamiento de la cultura Matrigel. Día 0 representa imágenes inmediatamente después del aislamiento; días 1, 2 y5 indican días después del aislamiento. La corona de células que salen de los aumentos esferoidal en el tiempo. Finalmente, un "fantasma" esferoide con muy pocas células sigue siendo (flecha). Esferoides quedan muy pocos después de la eliminación de fantasmas y el primer paso.

Figura 3. Análisis de citometría de flujo de las células después del aislamiento de Matrigel co-cultivo. Después de esferoide co-cultivos han madurado, las células se aíslan de la 3D co-cultivo con pipetas y de serie de pases. Alícuotas de las muestras se analizaron por citometría de flujo (en este ejemplo, el uso de fluorescencia de fluorescencia verde y rojo para identificar las buenas prácticas agrarias que expresan los fibroblastos y mCherry que expresan las células epiteliales, respectivamente) para determinar la población relativa de las células epiteliales y fibroblastos.

Figura 4. La migración Transwell de HMECs persiste después de isolatien Matrigel de co-cultivo. Una vez que las poblaciones puras se han obtenido mediante el cultivo de células de clasificación o de fluorescencia, las células pueden ser analizados como se desee. Aquí la migración de HMECs co-cultivadas con cualquiera de los controles (C) o Tiam1 deficientes (SHT) a través de los fibroblastos transwells perforadas se evaluó en las semanas 2, 4 y 8 después del aislamiento de co-cultivo.

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Discusión

El método aquí presentado representa un método sencillo para analizar los efectos de los fibroblastos del estroma de las células epiteliales, incluyendo las células tumorales. Permite directo célula-célula interacción dentro de un contexto tridimensional apoyada por la matriz extracelular de la membrana basal, al tiempo que permite una fácil extracción de las células de la matriz para su posterior análisis. Esto se puede aplicar al estudio de la estroma asociado al tumor, como fibroblastos de líneas puede s...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	El fenol rojo libre de
Hyclone clásico medio líquido: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone bovina de suero de ternera	ThermoScientific	SH3007303
Insulina	Merck Chemicals	407709	Disolver en HCl 0.005N; 0,22 mM filtro
La hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H4001	Disolver en 50% de EtOH; 0,22 mM filtro
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Disolver en ácido acético 10 mM; filtro de 0,22 um