Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Özet

Muazzam çabaları kolay hücre manipülasyonu için izin klasik iki boyutlu hücre kültür modelleri kullanılarak çok bu işin yapılmıştır normal ve malign hücre davranışları ^1-2, yer sinyal yolları ve moleküller girmiş iken. Bu hücre içi sinyal yollarının boyutluluğu ve ^3-4 hücre yüzey gerilimi gibi ekstraselüler güçleri tarafından etkilendiğini açıkça ortaya çıktı. Çoklu yaklaşımlar daha doğru biyolojik mimari doku ³ temsil ettiği üç boyutlu modeller geliştirmek için alınmıştır. Bu modeller çok boyutluluğu ve mimari gerilmeler dahil ederken, hücrelere sonuç etkileri çalışma modellerinin sınırlamaları ve sonraki analiz için hücre ayıklanması zorluk nedeniyle iki boyutlu doku kültürü daha az becerikli olduğunu.

Tümörogenez ve tümör davranış tümörlerin yaklaşık mikroçevresinin önemli rol ilar giderek ⁴ tanınmış oldu. Tümör stromanın birden fazla hücre türleri ve hücre dışı moleküller oluşur. Tümör gelişimi sırasında tümör hücreleri ve stromal hücreleri ⁵ arasında çift yönlü sinyaller vardır. Tümör stromanın co-evrimi katılan bazı faktörler tespit edilmiş olmasına rağmen, sistematik olarak belirlemek ve bu sinyalleri ⁶ tam diziyi incelemek için basit bir teknik geliştirmek için hala gereksinim vardır. Fibroblastlar normal veya tümörle ilgili stromal dokularda en bol hücre tipi olup, birikimi ve bazal membran ve parakrin büyüme faktörleri ⁷ bakım katkıda bulunmaktadır.

Birçok grup tümör tedavilere yanıt, bağışıklık hücrelerinin işe alma, sinyal molekülleri, proliferasyon, apoptoz, anjiyogenez ve işgali ^8-15 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları üzerinde fibroblast rolünü incelemek için üç boyutlu kültür sistemleri kullanılmıştır. Biz eşek için basit bir yöntem optimizekarışık hücre popülasyonlarının (co-kültür) ^16-22 üç boyutlu kültür oluşturmak için piyasada bulunan hücre dışı matriks modeli kullanılarak meme epitel hücreleri üzerinde meme fibroblastların etkileri Essing. Devam ko-kültür ile hücrelerin iç fibroblastlar kümeleme ve büyük ölçüde parçacıklarının dış ve matriks içine çok hücreli çıkıntılar oluşturan epitel hücreleri ile sferoidler oluştururlar. Değişmiş epitel hücre invaziv yol açar fibroblastların Manipülasyon kolayca numaraları ve epitel projeksiyonları ²³ uzunluğu değişiklikler ile belirlenebilir. Dahası, epitel davranışı üzerindeki fibroblast maruz etkileri analizi kolaylaştırır, üç boyutlu bir ko-kültür epitelyal hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirmişlerdir. Biz ortak kültürün etkileri birden fazla testleri gerçekleştirmek için yeterli zaman tanıyarak, epitel hücre izolasyonu haftalar sonra devam bulduk. Bu metod ile hücrelerin uyarlanabilirmalign potansiyeli değişen ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Bu teknik birden koşullar altında in vitro hücre modellerinde hızlı değerlendirme için izin verir, ve karşılık gelen sonuçları in vivo hayvan doku modelleri yanı sıra, insan doku örneklerine göre olabilir.

Protokol

1. Üç boyutlu Co-kültür oluşturulması

1. Co-kültürler kuran bir gün önce, bir gecede 4 ° C'de buzdolabında buz üzerinde dondurucu ve çözülme gelen Matrigel çıkarın.
2. % 10 bovin serumu, 5 ug / mL insülin ile DME/F12 orta: deney gününde, kullanılmak üzere epitelyal hücreleri için orta (bu örnekte HMEC orta karşılık gelen ortak kültürü için orta hazırlanması , 1 ug / mL hidrokortizon ve 1 ng / mL EGF). Önceden Matrigel ile karıştırılarak buz en az 1 saat orta tutun.
3. Çözülmüş Matrigel sulandırmak için, Matrigel toplam istenilen miktar belirlemek: orta (300 uL başına da 24-iyi plakalar için) ve buz üzerinde steril bir tüpe buz HMEC orta yarısı bu birimde ekleyin. Daha sonra bir 1:1 seyreltme elde etmek için tüpüne çözülmüş Matrigel aynı yarı-toplam hacim ekleyin. Buz tüpü tutun.
4. Yeri 50 Matrigel arasında uL: 24-kuyulu plakanın belirlenmiş kuyuların orta-iyi orta karışımı venemli hava _ve% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatöründe 10 dakika süreyle inkübe edilir.
5. Kuyuları, orta ve başka bir karışımı 60 dakika süreyle inkübe edilir: Matrigel ilave bir 450 uL ekleyin.
6. Kuluçka sırasında, 0.5 x 10 arasında derişimde fibroblast (burada GFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş İndirgeme Meme fibroblastlar) ve epitel hücreleri (burada RFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş insan meme epitel hücre çizgisi) 1:1 lik bir süspansiyon hazırlamak ⁵ hücreleri HMEC orta 0.5 ml her.
7. 60 dakikalık inkübasyon adım sonra, yavaşça katılaşmış jel üstüne hücre süspansiyonu bırakın ve inkübatör kültür dönün.
8. 2 gün boyunca kültürlerin rahatsız etmeyin. Bundan sonra, orta nazikçe iyi ve yavaşça taze HMEC orta yerine bir taraftan orta aspire edilerek 2-3 gün her değiştirilebilir.
9. Mikroskobu altında günlük sfero oluşumu izleyin. Kültürler 10-14 gün sonra genellikle olgun. Görüntü olarakışık veya floresan mikroskobu kullanarak uygun. Sfero boyutunu ve projeksiyon uzunluk ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

2. Co-kültürler Sfero gelen Hücre İzolasyonu

1. Steril 2 ml'lik cam pipet ile çok nazikçe, kültürünü Pipeti ve aşağı 10x. Alternatif olarak, kültür Pipeti için% 70 etanol içinde otoklav veya daldırma ile steril makas kullanırken, 1000 mikrolitre plastik pipet ucunu kesti. Cam pipet veya steril bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne kesme plastik pipet ucu ve oda sıcaklığında 2000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ile ya kültürü transfer edin. Hücresel sferoidler tortu altında olacak.
2. Yavaşça, santrifüj tüpünün üst kesintiye Matrigel kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın.
3. Pelet sferoidler 1 ml HMEC orta ekle, yukarı ve aşağı pipetleme 2-3 kez steril 2 ml'lik cam pipet ile, ve 24-iyi bir kuyuya kültürü aktarmakdoku kültürü plakası.
4. Sferoidler orta değişen önce en az 48 saat çanak eklemek için izin ver. Zamanla hücreler küresel yapılar terk edecek ve mono tabakaları gibi büyür.
5. Hücrelerinin% 50 izdiham ulaşmak Pasajı hücre kültürleri. İlk 100 mm çanak (yaklaşık 3-5 gün) sonra bir 35 mm çanak (yaklaşık 2-4 gün) kültür genişletin ve. Her geçiş adımı hemen önce, elle mümkün olduğunca çok sayıda kalıntı "hayalet sferoidler" olarak kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın.
6. Floresans hücre sıralama gerekirse, uygun hücre yüzey belirteçleri ve daha fazla ayrı ayrı hücre popülasyonu kullanarak nüfus saflık için akım sitometri ile hücrelerin analiz edin. Istediğiniz gibi izole hücreler daha fazla analiz için şimdi hazır.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Co-kültürler üç boyutlu sfero olarak, mühendislik Tiam1 susturulması ile fibroblastlar ma içine arttı işgali nedenmeme epitel hücreleri tarafından trix (Şekil 1, D karşılaştırmak, E, A, F, B, C). Ile fibroblast Tiam1 aşırı ekspresyonu meme kanseri hücre hattı SUM159 (Şekil 1, G, H, I J, K, L karşılaştırın) azalarak matris işgaline neden mühendislik.

Şekil 2 de gösterildiği gibi bir kez co-kültüre sferoidler kurulmuş, hücresi grupları, iki boyutlu bir bağlamda yeniden kaplanması ile sferoidler izole edilebilir. Test edilen hücrelerin nispi büyüme oranları bağlı olarak, saf popülasyonlarının seri kanalı yoluyla ortaya çıkabilir (Şekil 3 içinde gösterildiği gibi) veya uygun bir hücre belirteçler kullanılarak sıralanabilir. Ko-kültür 3D izolasyon sonra, epitel hücreleri analiz için yeterli fırsat sağlayan, uzun süre üzerinde fibroblastlar ile ko-kültür öngördüğü özelliklerini korurlar. Bu örnekte, Tiam1 eksikliği fibroblastlar maruz hafta süreyle devam co-kültürlü HMECs artan göç indüklenen bir3D ko-kültür arası fter izolasyonu (Şekil 4).

Şekil 1. Işık ve floresan mikroskobu altında ortak kültürlerin kurulan sfero Görüntüleme. Sfero kültürleri meme epitel ve fibroblast hücre hatları ile kurulan ve 10-14 gün boyunca kültür büyümeye izin verilir. AF: epitel = HMEC-mCherry hücreler. GL: epitel hücreleri = SUM159-mCherry hücreler. AC, GI: fibroblast = kontrolü RMF-GFP hücreler. DF: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 susturulması ile. JL: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 fazla ifade ile. Oklar matris içine işgalci epitel projeksiyonları göstermektedir.

Şekil 2. Matrigel kültürden izolasyonu sonra ışık ve floresan mikroskobu altında kültürlerin Seri görüntüleme. Gün 0 hemen sonra izole görüntüleme temsil eder; günde 1, 2 ve5 izolasyon gün sonra göstermektedir. Zamanla sfero artar bırakarak hücrelerin korona. Sonunda çok az sayıda hücre ile bir "hayalet" sfero (ok) kalır. Çok az sferoidler hayalet kaldırılması ve ilk geçişini sonra kalır.

Matrigel co-kültürden sonra izole hücrelerin Şekil 3. Akış sitometrisi analizi. Co-kültürler steoid olgunlaşmış sonra, hücreler pipetleme ile eş-kültürü 3D ve pasajlanmasını seri izole edilir. Örnek alikotları akım sitometri ile analiz edilir (tanımlamak için yeşil floresan ve kırmızı floresan kullanarak bu örnekte GFP-ifade sırasıyla fibroblast ve mCherry-salgılayan epitel hücreleri) epitel ve fibroblast hücrelerin göreceli nüfusu belirlemek için.

Şekil 4. HMECs arasında Transwell göç isolati sonra devamMatrigel ko-kültür itibaren. Saf popülasyonlarının kültür veya floresans hücre ayırma ile elde edilmiş bir kez istenildiği gibi, hücreler analiz edilebilir. İşte HMECs ya kontrol (C) veya delikli transwells arasında Tiam1 eksikliği (SHT) fibroblastlar ile ortak kültür göçü ko-kültür izolasyonu sonrası 2, 4 ve 8. haftalarda değerlendirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem tümör hücreleri dahil olmak üzere, epitel hücreler, üzerine stromal fibroblastlann etkileri analiz için basit bir yaklaşım temsil eder. Daha fazla analiz için matristen hücrelerin kolaylıkla ekstraksiyon sağlarken Bu, hücre dışı bazal membran matris tarafından desteklenen bir üç-boyutlu bağlamında doğrudan hücre-hücre etkileşim için olanak sağlar. Bu fibroblast hatları tercih ve epiteliyal hatları Şekil 1 'de gösterildiği gibi, invaziv potan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Ücretsiz Fenol-kırmızı
Hyclone Klasik Sıvı Orta: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Sığır Buzağı Serumu	ThermoScientific	SH3007303
Ensülin	Merck Kimyasallar	407709	0.005N HCI içinde çözülür; 0.22 uM filtresi
Hidrokortizon	Sigma-Aldrich	H4001	% 50 EtOH içinde çözünmesi; 0.22 um bir filtreden
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	10 mM asetik asit içinde çözülür; filtre 0.22 uM