Выделение молочной эпителиальные клетки трехмерных смешанных клеток сфероид Co-культуры

Резюме

Простой метод описан для анализа последствий ткани фибробласты об ассоциированном эпителиальных клеток. Сочетание этого метода и трехмерной тканевой культуре могут облегчить анализ клеток после изоляции от 3D. Методика распространяется на клетки различных злокачественных потенциал, позволяющий систематическое изучение последствий опухолеассоциированным стромы на опухолевые клетки.

Аннотация

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors^1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension^3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture³. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.

The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized⁴. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells⁵. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals⁶. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors⁷.

Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion^8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)^16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections²³. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

протокол

1. Создание трехмерных сотрудничества культур

1. За день до создания совместного культур, удалить Матригель из морозильной камеры и оттепель на льду в 4 ° C ночь в холодильник.
2. В день эксперимента, подготовить среду для совместной культуры, что соответствует средним для эпителиальных клеток, которые будут использоваться (HMEC среды в данном примере: DME/F12 среде с 10% бычьей сыворотки теленка, 5 мкг / мл инсулина , 1 мкг / мл гидрокортизона, 1 нг / мл ЭФР). Держите среды на лед по крайней мере, за 1 час до смешения с Матригель.
3. Чтобы разбавить талой Матригель, определения общего требуемого количества Матригель: средний (300 мкл на лунку 24-луночных планшетов) и добавить 1/2, что объем ледяной HMEC среднего стерильную пробирку на льду. Затем добавьте же половина общего объема талых Матригель к трубе для достижения разведение 1:1. Держите трубку на льду.
4. Место 50 мкл Матригель: средние смеси в середине и в специально отведенных для скважины 24-луночного планшета иинкубировать 10 мин при 37 ° C инкубатор с увлажненного воздуха и 5% CO _2.
5. Добавить еще 450 мкл Матригель: средняя смесь в лунки и инкубировать в течение еще 60 минут.
6. Во время инкубации, готовит 1:1 подвески фибробластов (здесь А-трет-увековечены сокращение молочной Фибробласты выражения GFP) и эпителиальные клетки (здесь А-трет-увековечены молочной железы человека линии эпителиальных клеток, экспрессирующих RFP) в концентрации 0,5 · 10 ⁵ клеток каждая в 0,5 мл HMEC среды.
7. После 60-минутной инкубации, мягко отказаться от клеточной суспензии на верхнюю часть затвердевшего геля, и вернуть культуры в инкубатор.
8. Не беспокоить культур в течение 2 дней. После этого среда может менять каждые 2-3 дней, очень мягко аспирационных среду со стороны хорошо и аккуратно заменить свежими HMEC среды.
9. Мониторинг формирования сфероида ежедневно под микроскопом. Культура, как правило, зрелого через 10-14 дней. Изображение, каксоответствующие помощью света или люминесцентной микроскопии. Сфероид размер и длину проекции могут быть измерены при световой микроскопии.

2. Выделение ячейки из сфероид сотрудничества культур

1. Очень осторожно, пипетка культура вверх и вниз 10 раз, используя стерильный 2 мл стеклянную пипетку. Кроме того, отрезать кончик 1000 мкл пластиковой пипетки с помощью ножниц стерилизовать автоклавированием или погружения в 70% этанолом, чтобы пипетировать культуры. Передача культуры либо с помощью пипетки или стеклянной разрезе пластиковый наконечник пипетки в стерильную центрифужную пробирку 15 мл, а центрифуги в течение 5 мин со скоростью 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Сотовые сфероидов будет осадок на дне.
2. Используйте стерильные пипетки Пастера, чтобы мягко удалить нарушенный Матригель сверху центрифугировали трубку.
3. Добавить 1 мл HMEC среднего гранулированный сфероидов, пипетка вверх и вниз по 2-3 раза с 2 мл стерильной стеклянной пипетки, и передавать культуру и в 24-апластины тканевой культуры.
4. Позвольте сфероидов приложить к блюду, по крайней мере за 48 часов до изменения среды. Со временем клетки оставят сфероидальной структуры и расти, как монослоев.
5. Прохождение культурах клеток, когда клетки достигают 50% слияния. Первое расширение культуры 35 мм блюдо (примерно 2-4 дней), а затем до 100 мм блюдо (примерно 3-5 дней). Непосредственно перед началом каждого прохода шаг, использовать стерильные пипетки Пастера, чтобы вручную удалить столько остаточного "призрак сфероидов", как это возможно.
6. Анализ клеток методом проточной цитометрии для населения чистоты с помощью соответствующих маркеров клеточной поверхности и дальнейшему отдельных различных клеточных популяций с помощью флуоресцентной сортировки клеток, если это необходимо. Изолированных клеток готовы для дальнейшего анализа, как хотелось бы.

3. Представитель Результаты

В трехмерном сфероида со-культур, фибробластов инженерных Tiam1 глушителей вызывать увеличился вторжения в маматрице на эпителиальных клетках молочной (рис. 1, сравнить D, E, F, А, B, C). Фибробласты с инженерии по-выражение Tiam1 вызывать снизилась матрицы вторжения клетки рака молочной железы линии SUM159 (рис. 1, сравнить J, K, L на G, H, I).

После совместного культурного сфероидов были созданы, клеточных популяций могут быть выделены из сфероидов повторным покрытием в двумерном контексте, как показано на рисунке 2. В зависимости от относительной скорости роста клеток испытания, чистый населения могут появиться через последовательный переход (как показано на рисунке 3) или могут быть отсортированы с помощью соответствующих маркеров клеток. После выделения из 3D совместно культуры, эпителиальные клетки сохраняют свойства предоставляемых совместно культуры фибробластов в течение длительного периода времени, что позволяет широкие возможности для анализа. В этом примере воздействия Tiam1 дефицитом фибробластов индуцированных повышенной миграции в сотрудничестве культурный HMECs, что сохраняется в течение неделиосле изоляции от 3D-со-культуры (рис. 4).

Рисунок 1. Изображений установленных сфероида со-культур в свете и флуоресцентной микроскопии. Сфероид культуры создаются с молочной эпителия и фибробластов клеточных линиях и могут расти в культуре в течение 10-14 дней. AF: эпителиальные = HMEC-mCherry клеток. GL: эпителиальные клетки = SUM159-mCherry клеток. AC, GI: фибробластов = контроль RMF-GFP клеток. ДФ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 глушителей. ДЛ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 за выражение. Стрелки указывают эпителиальных прогнозы вторжения в матрице.

Рисунок 2. Последовательные изображения культур под светом и флуоресцентной микроскопии после выделения из культуры Матригель. День 0 представляет изображения сразу после изоляции, дни 1, 2 и5 показывают дней после изоляции. Корона клеток оставив сфероид увеличивается с течением времени. В конце концов "призрак" сфероида очень мало клеток остается (стрелка). Очень немногие сфероидов остаются после удаления призраков и первый проход.

Рисунок 3. Проточная цитометрия анализа клеток после выделения из Матригель со-культуры. После сфероида со-культуры созрели, клетки выделяют из 3D совместно с пипеткой культуры и серийные пассажи. Пример аликвоты исследуют методом проточной цитометрии (в данном примере использования зеленого свечения и красной флуоресценции для определения выражения GFP-фибробласты и mCherry экспрессией эпителиальных клеток соответственно), чтобы определить относительную населения эпителиальных клеток и фибробластов.

Рисунок 4. Transwell миграции HMECs сохраняется после isolatiо сотрудничестве с Матригель-культуры. После чистого населения были получены через культуру или флуоресценции сортировки клеток, клетки могут быть проанализированы как хотелось бы. Здесь миграции HMECs совместной культурной либо контроля (С) или Tiam1 недостаточности (шт) фибробласты через перфорированную transwells был оценен в 2, 4 и 8 недель после выделения из со-культуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод представленный здесь представляет собой простой подход к анализу последствий стромальных фибробластов на эпителиальных клетках, в том числе опухолевых клеток. Это дает возможность прямого межклеточного взаимодействия в трехмерном контексте поддержке внеклеточного матрикса ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
BD Матригель	BD Biosciences	356237	Фенол-красный бесплатно
Hyclone Классическая жидкой среде: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone говядине телячьей сывороткой	ThermoScientific	SH3007303
Инсулин	EMD химическими веществами	407709	Растворите в 0.005N HCl, 0,22 мкм фильтр
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H4001	Растворить в 50% этанола, 0,22 мкм фильтр
ЭФР	Sigma-Aldrich	E9644	Растворить в 10 мМ уксусной кислоты; 0,22 мкм фильтр