Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Riepilogo

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Abstract

Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne ^1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E 'diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule ^3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l'architettura biologica ^3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi.

L'importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta ^4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali ^5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali ^6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini ^7.

Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l'apoptosi, l'angiogenesi e l'invasione ^8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) ^16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all'interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l'invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali ^23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l'analisi degli effetti dell'esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.

Protocollo

1. Establishing Three-dimensional Co-cultures

1. The day before establishing the co-cultures, remove the Matrigel from the freezer and thaw on ice in a 4 °C refrigerator overnight.
2. On the day of the experiment, prepare the medium for co-culture, which corresponds to the medium for the epithelial cells to be used (HMEC medium in this example: DME/F12 medium with 10% bovine calf serum, 5 μg/mL insulin, 1 μg/mL hydrocortisone, and 1 ng/mL EGF). Keep the medium on ice at least 1 hour prior to mixing with Matrigel.
3. To dilute the thawed Matrigel, determine the total desired quantity of Matrigel:medium (300 μL per well for 24-well plates) and add half that volume of ice-cold HMEC medium to a sterile tube on ice. Then add the same half-total volume of thawed Matrigel to the tube to achieve a 1:1 dilution. Keep the tube on ice.
4. Place 50 μL of Matrigel:medium mixture mid-well in designated wells of a 24-well plate and incubate for 10 min in a 37 °C incubator with humidified air and 5% CO₂.
5. Add an additional 450 μL of Matrigel:medium mixture to the wells and incubate for another 60 minutes.
6. During the incubation, prepare a 1:1 suspension of fibroblasts (here h-TERT-immortalized Reduction Mammary Fibroblasts expressing GFP) and epithelial cells (here h-TERT-immortalized Human Mammary Epithelial Cell line expressing RFP) at a concentration of 0.5 x 10⁵ cells each in 0.5 ml of HMEC medium.
7. After the 60-minute incubation step, gently drop the cell suspension onto the top of the solidified gel, and return culture to the incubator.
8. Do not disturb the cultures for 2 days. After this, medium can be changed every 2-3 days by very gently aspirating medium from the side of the well and gently replacing with fresh HMEC medium.
9. Monitor spheroid formation daily under microscopy. Cultures are generally mature after 10-14 days. Image as appropriate using light or fluorescent microscopy. Spheroid size and projection length can be measured under light microscopy.

2. Isolation of Cells from Spheroid Co-cultures

1. Very gently, pipette the culture up and down 10x using a sterile 2-mL glass pipette. Alternatively, cut off the tip of a 1000 microliter plastic pipette tip using scissors sterilized by autoclaving or immersion in 70% ethanol in order to pipette the culture. Transfer the culture with either the glass pipette or the cut plastic pipette tip to a sterile 15 ml centrifuge tube and centrifuge for 5 min at 2000 rpm at room temperature. The cellular spheroids will sediment at the bottom.
2. Use a sterile Pasteur pipette tip to gently remove the disrupted Matrigel from the top of the centrifuged tube.
3. Add 1 ml HMEC medium to the pelleted spheroids, pipette up and down 2-3 times with a sterile 2 mL glass pipette, and transfer the culture to a well in a 24-well tissue culture plate.
4. Allow the spheroids to attach to the dish for at least 48 hours prior to changing the medium. Over time the cells will leave the spheroidal structures and grow as monolayers.
5. Passage the cell cultures when cells reach 50% confluence. First expand the culture to a 35 mm dish (approximately 2-4 days), and then to a 100 mm dish (approximately 3-5 days). Immediately prior to each passage step, use a sterile Pasteur pipette to manually remove as many residual "ghost spheroids" as possible.
6. Analyze cells by flow cytometry for population purity using appropriate cell surface markers and further separate different cell populations by fluorescence cell sorting if necessary. The isolated cells are now ready for further analysis as desired.

3. Representative Results

In three-dimensional spheroid co-cultures, fibroblasts with engineered Tiam1 silencing induce increased invasion into matrix by mammary epithelial cells (Figure 1, compare D, E, F to A, B, C). Fibroblasts with engineered over-expression of Tiam1 induce decreased matrix invasion by the breast cancer cell line SUM159 (Figure 1, compare J, K, L to G, H, I).

Once co-cultured spheroids have been established, cell populations can be isolated from spheroids by re-plating in a two-dimensional context, as shown in Figure 2. Depending on the relative growth rates of the cells tested, pure populations may emerge through serial passage (as shown in Figure 3) or can be sorted using appropriate cell markers. After isolation from 3D co-culture, epithelial cells retain the properties conferred by co-culture with fibroblasts over extended periods of time, allowing ample opportunity for analysis. In this example, exposure to Tiam1-deficient fibroblasts induced increased migration in co-cultured HMECs that persisted for weeks after isolation from 3D co-culture (Figure 4).

Figure 1. Imaging of established spheroid co-cultures under light and fluorescence microscopy. Spheroid cultures are established with mammary epithelial and fibroblast cell lines and allowed to grow in culture for 10-14 days. A-F: epithelial = HMEC-mCherry cells. G-L: epithelial cells = SUM159-mCherry cells. A-C, G-I: fibroblast = control RMF-GFP cells. D-F: fibroblast = RMF-GFP with Tiam1 silencing. J-L: fibroblast = RMF-GFP with Tiam1 over-expression. Arrows indicate epithelial projections invading into matrix.

Figure 2. Serial imaging of cultures under light and fluorescence microscopy after isolation from Matrigel culture. Day 0 represents imaging immediately after isolation; days 1, 2 and 5 indicate days after isolation. The corona of cells leaving the spheroid increases over time. Eventually a "ghost" spheroid with very few cells remains (arrow). Very few spheroids remain after ghost removal and first passage.

Figure 3. Flow cytometry analysis of cells after isolation from Matrigel co-culture. After spheroid co-cultures have matured, cells are isolated from the 3D co-culture with pipetting and serial passaging. Sample aliquots are analyzed by flow cytometry (in this example using green fluorescence and red fluorescence to identify GFP-expressing fibroblasts and mCherry-expressing epithelial cells respectively) to determine relative populations of epithelial and fibroblast cells.

Figure 4. Transwell migration of HMECs persists after isolation from Matrigel co-culture. Once pure populations have been obtained through culture or fluorescence cell sorting, cells can be analyzed as desired. Here migration of HMECs co-cultured with either control (C) or Tiam1 deficient (shT) fibroblasts across perforated transwells was assessed at 2, 4 and 8 weeks after isolation from co-culture.

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Discussione

Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all'interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome di reagente	Azienda	Numero di catalogo	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Fenolo-rosso senza
Hyclone Media Classical liquido: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulina	EMD Chemicals	407709	Sciogliere in 0.005N HCl; 0,22 uM filtro
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Sciogliere in 50% EtOH; 0,22 uM filtro
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Sciogliere in 10mM acido acetico; 0,22 uM filtro