في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

Summary

علينا أن نبرهن الحنق بين polydiacetylene البوليمر مترافق (PDA) وتعلق fluorophore إلى سطح الليبوزومات PDA للاستشعار من الجزيئات الحيوية. الليبوزومات PDA الواردة أيضا جزيئات مستقبلات على سطحها لالجزيئات الحيوية لاستخدامها تحقيقات. يجند مستقبلات التفاعلات تؤدي إلى تغييرات في كفاءة الحنق بين fluorophore وPDA التي هي أساس لآلية الاستشعار عن بعد.

Abstract

الحنق هو العملية التي يتم بواسطتها الطاقة الإشعاعية غير المنقولة من جزيء المانحة متحمس لجزيء متقبل الأرض التابعة للدولة من خلال التفاعلات ثنائي القطب ثنائي القطب، طويلة المدى ^1. في مقايسة الحاضر الاستشعار عن بعد، ونحن الاستفادة من العقار المميز من PDA: الأزرق تحول في الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس امتصاص الإلكترونية PDA (الشكل 1) بعد تحليلها يتفاعل مع المستقبلات المرتبطة PDA ^2،3،4،7. هذا التحول في امتصاص الطيف PDA ويوفر التغييرات في التداخل الطيفي (J) بين PDA (متقبل) ورودامين (المانحين) الذي يؤدي إلى تغييرات في كفاءة الحنق. وهكذا، تم الكشف عن التفاعلات بين الحليلة (يجند) والمستقبلات من خلال الحنق بين fluorophores المانحة وPDA. على وجه الخصوص، وتبين لنا أن الاستشعار من جزيء البروتين streptavidin نموذج. علينا أن نبرهن أيضا التساهمية ملزم للمصل الألبومين البقري (BSA) لسطح الحويصلية مع الحنق آلية. هذه التفاعلات بين رويمكن لمس انه الليبوزومات طبقة ثنائية وجزيئات البروتين في الوقت الحقيقي. الطريقة المقترحة هي طريقة عامة لاستشعار كيميائية صغيرة والجزيئات الكيميائية الحيوية الكبيرة. منذ مضان هذا بحد ذاته أكثر حساسية من قياس الألوان، ويمكن الحد من الكشف الفحص يكون في شبه nanomolar مجموعة أو أقل ^8. علاوة على ذلك، PDA يمكن أن تكون بمثابة متقبل العالمية في الحنق، مما يعني أن يمكن تطوير أجهزة استشعار متعددة مع PDA (متقبل) functionalized مع الجهات المانحة ومستقبلات مختلفة تعلق على سطح الليبوزومات PDA.

Protocol

A. اصطناع وتوصيف بعض الليبوزومات PDA ^4،5،6

ملاحظة 1: حماية الحل بعيدا عن الضوء PDA باستخدام الألومنيوم احباط التفاف على كل الحاويات في جميع أنحاء جميع الخطوات التجريبية.

ملاحظة 2: تم إعداد مجموعتين مختلفتين من حل الحويصلية (B و C) الإجراء التالي A (توليف وتوصيف الجسيمات الشحمية PDA).

1. توليف N-hydroxysuccinimide Diacteylene (NHS-المؤقتة)

1. لإعداد الليبوزومات، مطلوب عنصر أساسي المؤقتة-NHS. ونحن توليفها المؤقتة-NHS باستخدام الإجراء التالي:
2. إضافة حمض 10،12-pentacosadiynoic (المؤقتة) (0.267 غرام، 0،713 ملمول)، N-hydroxysuccinimide (0.0914 غرام، 0،786 ملمول) و 1 - (3 - (dimethylamino) ن)-3-ethylcarbodiimide هيدروكلوريد (0.144 غرام، 0،713 ملمول ) في CH الجاف ₂ الكلورين ₂ (20 مل).
3. تحريك الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
4. إزالة بعناية باستخدام المذيبات صالمبخر otary لانتاج فيلم الجافة رقيقة.
5. استخدام قمع الفصل لاستخراج بقايا مع ايثر (25 مل) والمياه (25 مل) ثلاث مرات.
6. تجفيف طبقة العضوية مع MgSO ₄ (1.0 جرام) لمدة نصف ساعة. تصفية وإزالة المذيب عن طريق التبخر الدوارة للحصول على مسحوق أبيض خالص (0.24 غرام،> 90٪).
7. تحليل مركب النهائي تحت الرنين النووي المغناطيسي (NMR).
8. ¹ H NMR (300 ميغاهيرتز، DMSO)، δ (جزء في المليون): 0.893 (ر، 3H)، 1،268 (م، 26H)، 1،512 (م، 4H)، 1،754 (م، 2H)، 2.252 (ر، 4H)، 2،365 (م، 1H)، 2،610 (م، 1H)، 2.842 (س، 2H).

2. الحويصلية إعداد ^5،6،7

1. حل اللجنة المؤقتة: اللجنة المؤقتة-NHS: 1،2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) :: 8: 1: 1 في 20 مل من ثنائي كلورو ميثان.
2. تصفية حل مع ورقة مرشح لإزالة الركام.
3. تتبخر المذيب تماما لانتاج طبقة رقيقة من مونومرات.
4. تجفيف طبقة رقيقة بين عشية وضحاها تحت بطالةuum.
5. هيدرات الفيلم مع الماء منزوع الأيونات (50 مل) لجعل حل الحويصلية التركيز المطلوب (0،65-1 ملم).
6. يصوتن تعليق الناتجة مع sonicator التحقيق في 76 درجة مئوية لمدة 18 دقيقة ~.
7. تمرير بعناية الحل من خلال مرشح ورقة لإزالة الركام الدهون
8. تبريد الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل لتعزيز التجميع الذاتي للمونومرات. ينبغي أن يكون واضحا الحل النهائي بصريا.
9. تتبلمر لمونومرات diacetylene الذاتي تجميعها (الحويصلية) من قبل التشعيع مع 254 نيوتن متر من الأشعة فوق البنفسجية لدقائق 2 ~ باستخدام الأشعة فوق البنفسجية راي مصدر القلم (4.5 ميغاواط / سم ²⁾ في الهواء.
10. كان الحل الحويصلية مستقرة في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين على الأقل. كان الحل أكثر استقرارا عندما المبردة.

B. إعداد رودامين الموسومة ألبومين المصل البقري (BSA-ره) الليبوزومات تعديل المؤقتة

1. الملزمة للBSA-ره إلى السطح الحويصلية

1. حل BSA ال Rh في بو PBSffer (تركيز الأيونية كان 0.01M، ودرجة الحموضة 7.2) لجعل تركيز النهائي من 1.2 ميكرومتر من BSA-رودامين الحل.
2. إضافة 2 مل (1.2 ميكرومتر) من BSA-رودامين إلى 10 مل من محلول الحويصلية أعدت في الخطوة A.2 (انظر أعلاه) في درجة حرارة الغرفة.
3. وقد اتبعت رد فعل الكلاسيكية لربط الجماعات أمين من بقايا يسين من البروتينات لحمض الكربوكسيلية تفعيلها من خلال مجموعة NHS (نظام التفاعل في الشكل 2). تم تصميم NHS-المؤقتة (الشكل 2، الخطوة 1) لجزيئات البروتين ملزمة تساهميا مع الليبوزومات باستخدام NHS-أمين ردود الفعل (الشكل 2، الخطوة 2). NHS هو وكيل ممتازة ترك رد الفعل الذي يدفع حمض الكربوكسيلية-أمين في الاتجاه إلى الأمام. يجب أن العائد من هذا التفاعل تحت ظروف مناسبة تكون الكمية.
4. إزالة مجانا BSA-ره: نقع الأطياف / بور الحيوية السليلوز استر (CE) غشاء (MW C O: 100،000) في ث منزوع الأيوناتالعاطر لمدة 15 دقيقة. يتم استخدام هذا الغشاء لغسيل الكلى من غير المتفاعل BSA-رودامين (الوزن الجزيئي ~ 66000 دا) في الماء منزوع الأيونات.
5. نقل بعناية الحل في لغسيل الكلى الغشاء.
6. تغيير المياه في ساعة 2 و 8 ساعة، 14 ساعة، 24 ساعة، 36 ساعة وخلال غسيل الكلى.
7. جمع الحل النهائي في قارورة مغطاة رقائق الألومنيوم.

C. إعداد SR-ديامين والبيوتين الموسومة الليبوزومات

1. بدلا من استخدام DMPC في الخطوة 2.1، سوف نستخدم البيوتين الموسومة-(1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (البيوتين-مخدر).

1. اتبع كافة الخطوات من خلال 2،2 حتي 2،9.
2. بدلا من BSA-B الخطوة في الصحة الإنجابية، واستخدام ديامين Sulphorhodamine الموسومة (SR-ديامين).
3. متابعة جميع خطوات أخرى في B.
4. تحتوي على الليبوزومات في هذا الإعداد والبيوتين على سطحها SR-ديامين. وكانت الخطوات اللاحقة مماثلة لألف وباء (انظر أعلاه) مع استثناء واحد: تمت إضافة streptavidin إلى solutiعلى البيوتين للتحقيق، streptavidin التفاعلات من خلال التغييرات في الحنق الكفاءة.

D. الممثل النتائج

الشكل اللقب. A الكرتون شرح عملية التفاعل والحنق التي تحدث على سطح الحويصلية (أعدت باتباع الخطوة B).

A. رصد المرفقات باستخدام البروتين لالليبوزومات الحنق ¹

رصد الحنق بين رودامين والليبوزومات PDA أعد الخطوة B.

تؤخذ الإثارة وانبعاث الطيف لBSA ال Rh وطيف الامتصاص للPDA (3A الشكل). يمكننا أن نرى بوضوح أن طيف الانبعاث من BSA-ره تتداخل مع الامتصاص من PDA. هذا يرضي متطلبات صدى لآلية الحنق. وقد تم تحليل BSA-رودامين الليبوزومات الموسومة قبل وبعد البلمرة مع V-UVهو ومضان الطيفي. لالمانحين ومتقبل معزولة، والحنق الكفاءة تعتمد بشكل كبير على المانحين متقبل عن بعد (ص) وJ ¹ (J-القيمة). ويلاحظ أن التبريد في الانبعاثات (الشكل 3B) بسبب الحنق بين رودامين وPDA بسبب ظهور طيف الامتصاص الإلكتروني للPDA زرقاء بعد بلمرة ضوئية المنشأ. في حالتنا، هو صفر الحنق الكفاءة لالليبوزومات unpolymerized ورودامين لأن J = 0 للالليبوزومات unpolymerized في المنطقة المرئية.

أجرينا تجارب مماثلة مع الليبوزومات فقط PDA التي لم تحتو على NHS على سطحها. في هذه الحالات، لم الموسومة BSA ال Rh إلى السطح من الجسيمات الشحمية. في هذه الحالة، كان متوسط ​​المسافة بين رودامين وPDA (ص _{المتوسط)} أكبر بكثير من نصف قطر فورستر (R ₀ = 2.8 نانومتر). وهكذا، فإننا لم نلاحظ انخفاض كبير في كثافة مضان. وهذه الملاحظةيسوتو تشير إلى أن التبريد مضان هو المهيمن عند R <2،8 نانومتر.

وحسبت J R ₀ القيم باستخدام الصيغ التالية: [1]

J (λ) = ∫ F _D (λ) ε _A (λ) λ ⁴ dλ

R ₀ = 0.211 [ك ² ن س ^-4 _D J (λ)] ^1/6

معامل الانقراض (ε) من PDA الأزرق هو في حدود 2000-10000 ~ سم ^{-1 -1} إلى M قبل إضافة streptavidin. معامل انقراض PDA أزرق يعتمد على حالة الصور البلمرة. [2] على سبيل المثال، سوف تكون أكبر القيم ε عن حل أن بلمرة وقتا أطول. علاوة على ذلك، قد التجميع الذاتي للمونومرات diacetylene تؤثر أيضا على القيم ε. وJ calculations تأخذ في الاعتبار هذه التغييرات، وأنها تعكس التغيرات في معاملات الانقراض بسبب PDA البيوتين streptavidin-التفاعلات الجزيئية. تحسب القيم التجريبية باستخدام J امتصاص PDA وSR-101 بيانات الانبعاثات. التغيرات في القيم J ومن المقرر أن يتحول في طيف الامتصاص الإلكتروني للPDA بعد إضافة streptavidin إلى الحل (الشكل 4C). وحدة القيم J هو M ^-1 سم ^-1 نانومتر ^4.

B. رصد الحنق مع اضافة streptavidin إلى حل البيوتين الموسومة الحويصلية

ملاحظة 1: رصد الحنق بين رودامين والليبوزومات PDA أعد الخطوة أعلاه C.

الإثارة وانبعاث الطيف لSulphorhodamine الموسومة ديامين (SR-ديامين) وتؤخذ من طيف الامتصاص PDA (الشكل 4A). وقد تم تحليل Unpolymerized والبيوتين بلمرة الليبوزومات المفتاحية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيسومضان الطيفي. وانخفضت الانبعاثات من رودامين (SR-101) بنحو 45٪ بعد البلمرة (الشكل 4B) مما يوحي تبريد الانبعاثات بسبب الحنق. اضافة 40 ميكرولتر مأخوذة (1 ميكرومتر) من حل streptavidin إلى 2 مل من محلول الحويصلية. مع إضافة streptavidin إلى الحل، ويلاحظ التغيرات في القيمة J (الشكل 4C). كما البيوتين streptavidin بربط، وكثافة الذروة الزرقاء الحويصلية PDA (645 نانومتر تركزت في ~ في الشكل 1) في حين انخفض زيادة في ذروة الاستيعاب في 540 نيوتن متر ويلاحظ (F igure 1S). الشكل 4D يبين التغييرات في الحنق الكفاءة. كفاءة الحنق انخفضت مع زيادة في تركيز streptavidin يتسق أيضا مع توقعاتنا.

تسجيل الانبعاثات SR بعد كل إضافة 40 ميكرولتر من قسامة streptavidin. لاحظنا زيادة مطردة في الانبعاثات رودامين بعد إضافة streptأفيدين (الشكل 5). هذه الزيادة في الانبعاثات رودامين ويرجع ذلك إلى انخفاض في قيمة J لsulphorhodamine طيف الانبعاث والامتصاص الطيف PDA بعد البيوتين streptavidin-التفاعلات. على المستوى الجزيئي، والتفاعلات البيوتين streptavidin-يؤدي إلى بعض التغييرات الطفيفة في طول اقتران الفعال للPDA مما يؤدي إلى انخفاض في شكل الأزرق PDA إلى نموذج الحمراء PDA أكثر استقرارا منظار الديناميكا الحرارية ^2. هذا هو أساس التغيرات في القيم J. ومن المثير للاهتمام، يمكن الفروق الدقيقة في التفاعلات الجزيئية لتساهميا أو غير تساهميا-البيوتين المستعبدين من الحويصلية PDA باستخدام مقايسة بحثها لدينا الاستشعار عن بعد ^4.

لقد أجرينا أيضا التجارب والمراقبة ورصد الانبعاثات من العينات السيطرة في ظل الظروف التجريبية نفسها التي لstreptavidin-البيوتين النظام. تجارب مراقبة تتكون من: (1) أن الحلول الواردة الحويصلية على البيوتين بهمأضيفت سطح حل العازلة من نفس الحجم والتركيز، و(2) تم إضافة حل الحويصلية دون مستقبلات على سطحها البيوتين streptavidin من نفس الحجم والتركيز. وأظهرت كثافة من الحل البيوتين الموسومة الحويصلية بعد إضافة streptavidin كثافة تعزيز كثافة ولكن من الحل الحويصلية من التجارب تحكم (على سبيل المثال، انظر الشكل 2S)، من ناحية أخرى، عرضت على انخفاض في كثافة الانبعاثات. ويعزى هذا إلى التخفيف من الحل. هذه التجارب تشير بوضوح إلى أن انبعاث تعزيز الحل كان من المقرر أن التفاعلات الجزيئية محددة.

يتم حساب نصف قطرها فورستر (R ₀₎ لزوج رودامين وPDA (eq.2) ليكون ~ 2،80 نانومتر. هذا يعني أن لأزواج PDA-رودامين معزولة، 50٪ من الجزيئات الدولة رودامين متحمس سيكون لها الطاقة لديها لنقل PDA عندما ص هو 2.80 نانومتر.

نحن OBS erved أن الزيادة الانبعاثات عند إرفاق تساهميا البيوتين إلى العمود الفقري PDA، كان 2-3 مرات أكبر من غير تساهميا البيوتين المستعبدين من الليبوزومات .. ⁴ هذه النتائج تشير بقوة إلى أن نظامنا المقترح حساسة للتمييز الفروق الدقيقة في التفاعلات في محول (رابط بين البيوتين وطبقة ثنائية الحويصلية) بسبب تساهميا وغير المقيد تساهميا المستقبلات المرتبطة الليبوزومات. وهذا يتوقف على قدرات المسح الضوئي واكتساب البيانات من رصد الطيف في الوقت الحقيقي، (في ميلي ثانية واحدة لمقياس مرة الثانية) من التفاعلات البروتين (في التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس) ممكنة مع هذا النظام الاستشعار عن بعد.

أطياف الامتصاص الرقم 1. من الحلول PDA الأزرق والأحمر. (الشكل) micrographs البصرية التي اتخذت مع كاميرا رقمية.

ز "/>
الشكل 2. نظام الرد لتركيب المؤقتة-NHS (الخطوة 1). رد فعل اللجنة المؤقتة-NHS إلى أمين المستبدلة من البروتينات (الخطوة 2). الخطوة 2 هو أساس ملزم من بقايا يسين من البروتينات للحمض الكربوكسيلية من مونومر المؤقتة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

3A الرقم. تغيير في كفاءة الملحوظة الحنق ويرجع ذلك إلى التغيرات في امتصاص الطيف للPDA. قبل البلمرة هناك أي تداخل بين BSA-ره الانبعاثات ولكن بعد امتصاص PDA التداخل البلمرة امتصاص PDA مع BSA-ره الانبعاثات والذي هو شرط لتأكل. رودامين هو المانحة (أحمر) والليبوزومات بلمرة PDA بمثابة متقبل (الأزرق).

الرقم3B. أطياف الإسفار من BSA-ره الليبوزومات قبل الموسومة (الأزرق) وبعد البلمرة المؤقتة (الحمراء). ولوحظ وجود انخفاض كبير في الانبعاثات رودامين بسبب الحنق بين رودامين وPDA.

.. 4A الرقم التداخل الطيفي (J) تغير لطيف امتصاص PDA (أزرق أو أحمر) وSulphorhodamine طيف الانبعاث (البرتقال) الشكل 4A هو ممثل لطيف حالة متطرفة، وهذا هو، عندما أضيف وجود فائض من streptavidin إلى الحل. الرقم 4A يظهر شبه الكامل الأزرق إلى الأحمر التحول PDA بعد إضافة وجود فائض من streptavidin. وينظر بشكل واضح أن J (التداخل الطيفي) يزيد مع تحول الأزرق من الطيف امتصاص PDA

4B الرقم. أطياف الإسفار قبل (الأزرق) وبعد (صED) البلمرة الحويصلية.

4C الرقم لحالة الحنق: J التغيير بين الجهات المانحة (sulphorhodamine) ومتقبل (PDA) مع إضافة streptavidin إلى حل الحويصلية.

الرقم 4D. الحنق تغير الكفاءة بين الجهة المانحة (sulphorhodamine) ومتقبل (PDA) مع إضافة streptavidin إلى حل الحويصلية.

الشكل 5. رودامين طيف الانبعاث بعد إضافة مأخوذة streptavidin إلى الحل الحويصلية PDA. أقحم يظهر عرض أكبر التغيرات في الانبعاثات أطياف SR-101.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لقد أجرينا ملزمة انتقائية من بقايا يسين من البروتين على سطح الحويصلية باستخدام NHS-أمين التفاعل. هذا الأسلوب يستند إلى الحنق قادرة على القيام في الوقت الحقيقي رصد البيوتين streptavidin-ملزمة والبروتين (BSA) ملزمة لسطح الحويصلية. ويمكن تطبيق إجراء مشابه لدراسة ديناميات ملزمة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
10،12-pentacosadiynoic حمض (المؤقتة)	GFS المواد الكيميائية	3261	الحساسية للضوء
N-hydroxysuccinimide (NHS)	العضوية أكروس	157270250	الرطوبة الحساسة
1 - (3 - (dimethylamino) ن)-3-ethylcarbodiimide هيدروكلوريد (EDC)	كيمياء المركبات الرائدة الدولية،	00050
1،2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	افانتي الدهون القطبية	850345P
رودامين الموسومة السير البقريأم الزلال (BSA-ره)	سيغما الدريتش	A4537
(1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (البيوتين-مخدر)	افانتي الدهون القطبية	870282