Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

Zusammenfassung

Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.

Zusammenfassung

FRET ist ein Prozess, bei dem Energie ist nicht strahlend von einem angeregten Donor-Molekül zu einem Grundzustand Akzeptor Molekül übertragen über weitreichende Dipol-Dipol-Wechselwirkungen ^ein. Im vorliegenden Abfühlen Assay, verwenden wir eine interessante Eigenschaft der PDA: Blauverschiebung im UV-Vis elektronischen Absorptionsspektrum PDA (Abbildung 1), nachdem ein Analyt wechselwirkt mit Rezeptoren an PDA ^2,3,4,7. Diese Verschiebung in der PDA-Absorptionsspektrum liefert Änderungen der spektralen Überlappung (J) zwischen PDA (Akzeptor) und Rhodamin (Donor), die auf Änderungen in der FRET-Wirkungsgrad führt. Somit werden die Wechselwirkungen zwischen Analyt (Ligand) und Rezeptoren durch FRET zwischen Donor-Fluorophore und PDA detektiert. Insbesondere zeigen wir, das Erfassen eines Modells Proteinmolekül Streptavidin. Darüber hinaus zeigt die kovalente Bindung von-Rinderserumalbumin (BSA) an der Oberfläche der Liposomen mit Mechanismus FRET. Diese Wechselwirkungen zwischen ter Doppelschicht Liposomen und Proteinmoleküle können in Echtzeit erfasst werden kann. Das vorgeschlagene Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zum Erfassen kleinen chemischen und biochemischen großen Molekülen. Da Fluoreszenz ist intrinsisch empfindlicher als Farbmessung, kann die Nachweisgrenze des Assays in sub-nanomolaren Bereich oder unteren ⁸ sein. Weitere, PDA als universelle Akzeptor in FRET zu handeln, was bedeutet, dass mehrere Sensoren mit PDA (Akzeptor) mit Gebern und verschiedene Rezeptoren auf der Oberfläche der PDA Liposomen befestigt funktionalisiert entwickelt werden können.

Protokoll

A. Synthese und Charakterisierung von PDA Liposomen ^4,5,6

Hinweis 1: Schützen Sie die PDA-Lösung von Licht mit Aluminiumfolie Verpackung auf jedem Behälter durch alle experimentellen Schritte.

Anmerkung 2: Zwei verschiedene Sätze von Liposomenlösung (B und C) wurden folgende Verfahren A hergestellt (Synthese und Charakterisierung von Liposomen PDA).

Ein. Synthese von N-Hydroxysuccinimid Diacteylene (NHS-PCDA)

1. Liposomen herzustellen, wird ein wesentlicher Bestandteil PCDA-NHS erforderlich. Wir haben PCDA-NHS synthetisiert, indem folgende Vorgehensweise:
2. Hinzufügen 10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-Hydroxysuccinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) und 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (0,144 g, 0,713 mmol ) in trockenem CH ₂ Cl ₂ (20 ml).
3. Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
4. Entfernen Sie vorsichtig das Lösungsmittel durch rotary Verdampfer ergeben eine trockene Dünnfilm.
5. Verwenden Scheidetrichter, um den Rückstand mit Diethylether (25 ml) und Wasser (25 ml) dreimal extrahiert.
6. Die organische Schicht wird mit MgSO ₄ (1,0 g) für eine halbe Stunde. Filtern und Entfernung des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um einen weißen Feststoff Pulver (0,24 g,> 90%) zu erhalten.
7. Analysieren endgültige Verbindung unter Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
8. ¹ H-NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).

2. Liposomenpräparat ^5,6,7

1. Aufzulösen PCDA: PCDA-NHS: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml Dichlormethan.
2. Filtern der Lösung mit einem Filterpapier, um Aggregate zu entfernen.
3. Man dampft das Lösungsmittel vollständig um einen dünnen Film von Monomeren zu ergeben.
4. Trocknen Sie die Dünnschicht Nacht unter vacuum.
5. Hydrat der Film mit entionisiertem Wasser (50 ml), um eine Liposomen-Lösung einer gewünschten Konzentration (0,65 bis 1 mM) zu machen.
6. Beschallen der erhaltenen Suspension mit einer Sonde Sonicator bei 76 ° C für ~ 18 min.
7. Ausweiten vorsichtig die Lösung durch ein Filterpapier, um die Lipid-Aggregate zu entfernen
8. Man kühlt die Lösung bei 4 ° C über Nacht zur Selbstorganisation der Monomere zu fördern. Die endgültige Lösung sollte optisch klar.
9. Polymerisieren die selbstorganisierte Diacetylen Monomere (Liposom) durch Bestrahlung mit 254 nm UV-Strahlung für ~ 2 min unter Verwendung eines Stiftes Ray UV-Quelle (4,5 mW / cm ²⁾ in Luft.
10. Liposom Lösung war bei Raumtemperatur stabil für mindestens zwei Wochen. Die Lösung war stabil, wenn gekühlt.

B. Herstellung von Rhodamin-markiertes Rinderserumalbumin (BSA-Rh) modifiziert PCDA Liposomen

Ein. Die Bindung von BSA-Rh auf die Oberfläche von Liposomen

1. Lösen BSA-Rh in PBS buffer (Ionenkonzentration betrug 0,01 M, pH 7,2), um die Endkonzentration von 1,2 pM von BSA-Rhodamin Lösung.
2. 2 ml (1,2 pM) von BSA-Rhodamin zu 10 ml Liposomenlösung in Schritt A.2. (Siehe oben) bei Raumtemperatur hergestellt.
3. Klassische Reaktion zur Bindung von Aminogruppen aus der Lysinrest von Proteinen an Carbonsäure durch NHS Gruppe aktiviert wurde befolgt (Reaktionsschema in Fig. 2). NHS-PCDA entwickelt wurde (Abbildung 2, Stufe 1) für kovalent bindendes Protein-Moleküle mit Liposomen mit NHS-Amin-Reaktionen (Abb. 2, Schritt 2). NHS ist ein ausgezeichnetes Mittel, das Verlassen des Amin-Carbonsäure-Reaktion in der Vorwärtsrichtung antreibt. Die Ausbeute dieser Reaktion unter geeigneten Bedingungen müssen quantitativ sein.
4. Entfernung von freiem BSA-Rh: Tränken Sie ein Spectra / Por Biotech Cellulose Ester (CE)-Membran (MW C O: 100.000) in entionisiertem wasser für 15 min. Diese Membran wird zur Dialyse verwendet umgesetztes BSA-Rhodamin (Molekulargewicht ~ 66.000 Da) in entionisiertem Wasser.
5. Transferieren es vorsichtig in die Lösung in der Dialysemembran.
6. Wechseln Sie das Wasser bei 2 h, 8 h, 14 h, 24 h und 36 h während der Dialyse.
7. Sammeln Sie die endgültige Lösung in einer Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abgedeckt.

C. Herstellung von SR-diamin und Biotin-markierte Liposomen

Ein. Anstelle der Verwendung von DMPC im Schritt 2.1, verwenden wir Biotin-markierten-(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE).

1. Befolgen Sie alle Schritte durch 2,2 bis 2,9.
2. Anstelle von BSA-Rh in Schritt B, verwenden Diamin tagged Sulforhodamin (SR-Diamin).
3. Befolgen Sie alle weiteren Schritte in B.
4. Die Liposomen in dieser Zubereitung enthaltene Biotin und auf ihren Oberflächen SR-diamin. Nachfolgende Schritte waren ähnlich zu A und B (siehe oben) mit einer Ausnahme: Streptavidin wurde der Lö hinzugefügtan Biotin-Streptavidin Wechselwirkung durch Veränderungen in der zu untersuchen FRET Effizienz.

D. Repräsentative Ergebnisse

Titel Figure. Ein Cartoon Erläuterung der Reaktion und FRET auftretenden der Liposomenoberfläche (hergestellt durch folgenden Schritt B).

A. Überwachung von Protein Bindung an Liposomen mittels FRET ¹

Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt B. hergestellten

Anregungs-und Emissionsspektren von BSA-Rh und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (Abbildung 3A). Man kann klar erkennen, dass das Emissionsspektrum des BSA-Rh überlappt mit dem Absorptionsspektrum des PDA. Dies erfüllt die Resonanz Voraussetzung für die FRET-Mechanismus. BSA-Rhodamin markierten Liposomen vor und nach der Polymerisation wurde mit UV-V analysiertist und Fluoreszenzspektroskopie. Für das isolierte Donor und Akzeptor, FRET der Wirkungsgrad stark von Donor-Akzeptor-Distanz (r) und J ¹ (j-Wert). Das Abschrecken der Emission beobachtet (Abbildung 3B) wegen FRET zwischen Rhodamin und PDA durch das Auftreten von elektronischen Absorptionsspektrum blauen PDA nach Photopolymerisation. In unserem Fall, FRET-Effizienz ist Null für unpolymerisierten Liposomen und Rhodamin weil J = 0 für unpolymerisierten Liposomen im sichtbaren Bereich.

Wir führten ähnlichen Versuchen mit nur PDA Liposomen, die nicht enthielt NHS auf ihrer Oberfläche. In diesen Fällen wurde BSA-Rh nicht an die Oberfläche der Liposomen markiert. In diesem Fall betrug der durchschnittliche Abstand zwischen Rhodamin und PDA (r _{durchschnittlich)} viel größer als Förster-Radius (R ₀ = 2,8 nm). So haben wir nicht beobachten einen starken Rückgang der Fluoreszenzintensität. Diese Beobachtung einlso schlägt vor, dass die Fluoreszenzlöschung dominant ist, wenn r <2,8 nm.

J und R _0-Werte wurden anhand folgender Formeln: [1]

J (λ) = ∫ F _D (λ) ε _A (λ) λ ⁴ dλ

R ₀ = 0,211 [k ² n ^-4 J Q _D (λ)] ^1/6

Der Extinktionskoeffizient (ε) aus blau-PDA ist in dem Bereich von ~ 2.000 bis 10.000 M ^-1 cm ^-1 vor der Zugabe von Streptavidin. Der Extinktionskoeffizient von blau-PDA ist abhängig von der Photopolymerisation Zustand. [2] Zum Beispiel wird ε-Werte größer sein für eine Lösung, die eine längere Zeit polymerisiert wurde. Ferner kann die Selbstorganisation der Diacetylen Monomere beeinflussen auch die ε-Werte. Die J calculations berücksichtigen diese Veränderungen, und sie spiegeln Veränderungen in den PDA Extinktionskoeffizienten durch Biotin-Streptavidin molekularen Wechselwirkungen. J-Werte sind berechnet anhand der experimentellen PDA Absorption und SR-101 Emissionsdaten. Die Veränderungen in den J-Werte sind auf im elektronischen Absorptionsspektrum PDA nach Zugabe von Streptavidin zu der Lösung (4C) zu verlagern. Die Einheit von J Werten M ^-1 cm ^-1 nm ^4.

B. Überwachung von FRET mit Zugabe von Streptavidin an die Biotin-markierte Liposomenlösung

Hinweis 1: Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt C oben hergestellt.

Anregungs-und Emissionsspektren des Sulforhodamin-tagged diamine (SR-diamin) und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (4A). Unpolymerisierten und polymerisierten Biotin markiert Liposomen wurden mittels UV-Visund Fluoreszenzspektroskopie. Die Emission von Rhodamin (SR-101) wird um ca. 45% nach der Polymerisation (4B) hindeutet Fluoreszenzlöschung durch FRET verringert. Fügen Sie 40 ul Aliquots (1 pM) von Streptavidin Lösung zu 2 ml des Liposom-Lösung. Mit der Zugabe von Streptavidin zu der Lösung wird Veränderungen in J-Wert beobachtet (4C). Wie Biotin an Streptavidin bindet, der blaue Peakintensität PDA Liposom (zentriert bei ~ 645 nm in 1) wurde während einer Erhöhung der Absorptionspeaks bei 540 nm vermindert wird beobachtet (A BBILDUNG 1S). 4D zeigt Änderungen in der FRET Wirkungsgrad. Die FRET-Effizienz mit der Zunahme der Streptavidin Konzentration sank steht auch im Einklang mit unserer Vorhersage.

Notieren Sie sich die SR-Emission nach jeder 40 ul Aliquot Zugabe von Streptavidin. Wir beobachteten eine stetige Zunahme der Rhodamin-Emission nach der Zugabe von StreptAvidin (Abb. 5). Diese Erhöhung der Rhodamin-Emission ist aufgrund einer Abnahme in der J-Wert für die Sulforhodamin Emissionsspektrum und PDA Absorptionsspektrums nach Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen. Auf molekularer Ebene werden die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung, um feine Änderungen in der effektiven Länge der Konjugation PDA was zu einer Abnahme in der blau-PDA Form zu einer thermodynamisch stabilen Form der roten PDA ² zur Folge hat. Dies ist die Grundlage der Veränderungen des J-Werte. Interessanterweise kann die feinen Unterschiede in den molekularen Wechselwirkungen kovalent oder nicht-kovalent gebundenen Biotin PDA Liposomen sondiert werden mit unseren Messen Assay ^4.

Wir haben auch Kontrollexperimente durchgeführt und überwacht haben die Emission der Kontrollproben unter denselben experimentellen Bedingungen wie die für Streptavidin-Biotin-System. Die Kontrollversuche bestehen aus: (1) liposomaler Lösungen, enthalten Biotin auf ihrerOberfläche wurden Pufferlösung von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt, und (2) Liposom-Lösung ohne Biotin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche Streptavidin wurden von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt. Die Intensität des Biotin-markierten Liposomen Lösung nach der Zugabe von Streptavidin zeigten erhöhte Intensität, aber die Intensität der Liposomenlösung der Kontrollversuche (zum Beispiel, siehe Abbildung 2B), auf der anderen Seite zeigte eine im Emissionsintensität vermindert. Dies wird Verdünnung der Lösung zugeschrieben. Diese Experimente zeigten deutlich, dass das verstärkte Emission der Lösung aufgrund der spezifischen molekularen Wechselwirkungen war.

Förster-Radius (R ₀₎ für Rhodamin und PDA Paar berechnet (Gleichung 2) auf ~ 2,80 nm betragen. Dies bedeutet, dass für isolierte PDA-Rhodamin Paaren, 50% der angeregten Zustand Rhodaminmoleküle ihre Energie übertragen PDA haben, wenn r 2,80 nm beträgt.

Wir obs erved dass, wenn Biotin kovalent an das Rückgrat gebunden PDA, die Emission Anstieg 2-3 mal größer als die von nicht-kovalent gebundenem Biotin an Liposomen betrug. ⁴ Diese Ergebnisse legen nahe, dass unsere vorgeschlagenen Systems empfindlich auf kleine Unterschiede in der Interaktion zu unterscheiden am Wandler (Linker zwischen Biotin und Liposom-Doppelschicht) aufgrund kovalent und nicht-kovalent gebundene Rezeptoren, die an Liposomen. Abhängig von den Scan-und Datenerfassungsfunktionen des Spektrophotometers, die Echtzeit-Überwachung (in Millisekunden bis Sekunden Zeitskala) von Protein-Interaktionen (im UV-VIS-Spektroskopie) sind mit diesem Sensorsystem möglich.

Abbildung 1. Absorptionsspektren der blauen und roten PDA-Lösungen. (Inset) optische Aufnahmen mit einer Digitalkamera aufgenommen wurden.

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Abbildung 2. Reaktionsschema für die PCDA-NHS-Synthese (Schritt 1). Reaktion von PCDA-NHS an den Aminsubstituenten von Proteinen (Schritt 2). Schritt 2 ist die Basis der Bindung Lysinrest von Proteinen an der Carbonsäure PCDA Monomer. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

3A. Beobachteten Veränderung der FRET Wirkungsgrad ist durch die Änderungen im Absorptionsspektrum des PDA. Vor der Polymerisation es keine Überlappung zwischen BSA-Rh-Emission und Absorption PDA aber nach der Polymerisation PDA Absorption überlappt mit BSA-Rh Emission, die die Anforderung für FRET ist. Rhodamin ein Donor (rot) und polymerisierten PDA Liposomen wirken als Akzeptor (blau).

Abbildung3B. Fluoreszenzspektren von BSA-Rh tagged Liposomen vor (blau) und nach PCDA Polymerisation (rot). Eine große Abnahme in der Rhodamin-Emission wurde beobachtet aufgrund zwischen Rhodamin und PDA FRET.

.. 4A Spektrale Überlappung (J) Änderung für PDA (blau oder rot) und Sulforhodamin Absorptionsspektrum Emissionsspektrum (orange) 4A ist das repräsentative Spektrum für extremen Zustand, das heißt, wenn ein Überschuss an Streptavidin zu der Lösung gegeben wurde. 4A zeigt einen nahezu vollständigen Blau-nach-Rot PDA Transformation nach der Zugabe eines Überschusses an Streptavidin. Es ist deutlich erkennbar, dass J (spektrale Überlappung) mit blau-Verschiebung des PDA Absorptionsspektrum erhöht

4B. Fluoreszenz-Spektren vor (blau) und nach (red) Liposom Polymerisation.

4C Zustand für FRET:. J Änderung zwischen Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung.

Figur 4D. FRET Effizienz Änderung zwischen der Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung.

Abbildung 5. Rhodamin Emissionsspektrum nach der Zugabe von Streptavidin-Aliquots auf den PDA Liposomenlösung. Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht der Emission Veränderungen in der SR-101 Spektren.

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Diskussion

Wir haben eine selektive Bindung der Lysinrest von Protein auf Liposomenoberfläche unter Verwendung NHS-Amin-Umsetzungsprodukte. Diese FRET basierten Methode ist dazu in der Lage Echtzeit-Überwachung von Biotin-Streptavidin-Bindung und Protein (BSA) Bindung an der Oberfläche der Liposomen. Ähnliches Verfahren angewendet werden, um die Bindungseigenschaften Dynamik der verschiedenen Protein-Wechselwirkungen mit ihrer selektiven Rezeptoren zu untersuchen. Es gibt Flexibilität bei der Auswahl Fluorophore, die Änderun...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA)	GFS Chemikalien	3261	Lichtempfindlich
N-Hydroxysuccinimid (NHS)	Acros Organics	157270250	Feuchtigkeitsempfindlich
1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC)	Chem-Impex International	00050
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P
Rhodamin-markierte Bovine Serum Albumin (BSA-Rh)	Sigma Aldrich	A4537
(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE)	Avanti Polar Lipids	870282