Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

Özet

Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Özet

FRET uzun menzilli dipol-dipol etkileşimleri ¹ ile zemin-devlet alıcı moleküle bir heyecan verici molekül aktarılan enerji dışı ışınımsal olan bir süreçtir. Bir analit PDA ^2,3,4,7 bağlanmış reseptörler ile etkileşime girer sonra PDA UV-Vis elektronik emme spektrumu (Şekil 1) mavi-kaydırma: Bu tahlil algılama olarak, PDA ilginç bir özellik kullanmaktadır. PDA absorpsiyon spektrumu bu kayma FRET verimliliği değişikliklere yol açar PDA (akseptör) ve rodamin (donör) arasındaki spektral örtüşme değişiklikler (J) sağlar. Böylece, analit (ligand) ve alıcılar arasındaki etkileşimleri donör floroforlar ve PDA arasındaki FRET ile tespit edilir. Özellikle, bir protein molekülünün streptavidin örnek bir algılama göstermektedir. Ayrıca ile sığır serum albümin (BSA) ile lipozomun yüzey kovalent bağlama yöntemi FRET göstermektedir. T arasındaki bu etkileşimlerO bilayeri lipozomlar ve protein molekülleri gerçek zamanlı olarak algılanabilir. Önerilen yöntem, küçük kimyasal ve biyokimyasal moleküllerin büyük duyulması için bir genel yöntemdir. Floresans Kalorimetresiz daha kendinden daha duyarlı olduğu için, testin saptama sınırının alt nanomolar aralığı ya da ⁸ daha düşük olabilir. Ayrıca, PDA FRET bir evrensel alıcı olarak hareket edebilir, bu çok sayıda sensör donör ve PDA lipozomlar yüzeyi üzerinde bağlanmış birçok farklı reseptör ile fonksiyonelleştirilmiş PDA (akseptör) ile geliştirilmiş olması anlamına gelir.

Protokol

PDA Lipozomlar ^4,5,6 A. Sentezi ve Karakterizasyonu

Not 1: Tüm deney adımları boyunca her konteyner alüminyum folyo sarma kullanarak ışıktan PDA çözümü koruyun.

Not 2: lipozom çözüm İki farklı setleri (B ve C) Aşağıdaki prosedür hazırlanmıştır A (PDA lipozomlar sentezi ve karakterizasyonu).

1. N-hidroksisüksinimid Diacteylene sentezi (NHS-PCDA)

1. Lipozomlar hazırlamak için önemli bir madde PCDA-NHS gereklidir. Biz aşağıdaki prosedürü kullanarak PCDA-NHS sentezlenmiş adres:
2. (- 3 - (dimetilamino) propil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (0.144 g, 0.713 mmol 10,12-pentacosadiynoic asit (PCDA) (0.267 g, 0.713 mmol), N-hidroksisüksinimid (0,0914 g, 0.786 mmol) ve 1 ekleme ) kuru _CH2 Cl ₂ (20 ml) eklenmiştir.
3. 2 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır.
4. Dikkatle r kullanılarak çözücü çıkarmakotary evaporatör bir kuru ince bir film elde edildi.
5. Dietil eter (25 ml) ve su (25 mL) ile üç kez kalıntı elde etmek için ayırma hunisi kullanarak.
6. Yarım saat için _MgSO4 (1.0 g) ile organik katman kurutulur. Filtre ve beyaz bir katı toz (0.24 g,>% 90) elde etmek üzere döner buharlaştırma ile çözgen çıkarın.
7. Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) altında son bileşik analiz edin.
8. ^1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm): 0.893 (t, 3H), 1.268 (m, 26H), 1.512 (m, 4H), 1.754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2.365 (m, 1H), 2.610 (m, 1H), 2.842 (s, 2H).

2. Lipozom preparatı ^5,6,7

1. PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC) :: 8: 1: 1 diklorometan içinde 20 ml PCDA çözülür.
2. Agrega kaldırmak için bir filtre kağıdı ile çözümü filtreleyin.
3. Monomerlerin ince bir film elde etmek için tamamen çözücü buharlaştırılır.
4. Vac altında ince film gecede kurulayınUUM.
5. İstenen bir konsantrasyon lipozom çözeltisi (0,65-1 mM) etmek için deiyonize su (50 ml) ile film hidratı.
6. 76'da bir sonikatör probu ile ortaya çıkan süspansiyon sonikasyon ° C ~ 18 dak.
7. Dikkatle lipid agrega kaldırmak için bir kağıt filtre ile çözüm geçmek
8. 4. monomerlerin kendi montaj teşvik etmek için ° C'da gece boyunca çözelti soğutulur. Nihai çözüm optik açık olmalıdır.
9. Havada bir Pen Ray UV kaynağı (4.5 mW / cm ²⁾ kullanarak ~ 2 dakika süreyle UV radyasyon 254 nm ile ışınlama ile kendine monte Diasetilen monomerler (lipozom) Polimerize.
10. Lipozom çözelti, en azından iki hafta boyunca oda sıcaklığında yapıldı. Buzdolabında saklanan çözümü daha stabil oldu.

Rodamin etiketli Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) modifiye PCDA lipozomlar B. Hazırlık

1. Lipozom yüzeye BSA-Rh Ciltleme

1. PBS met BSA-Rh eritilirffer (iyonik konsantrasyon pH 7.2, 0.01 M idi) BSA-Rodamin çözelti 1.2 uM nihai konsantrasyon sağlamak için.
2. Oda sıcaklığında bir adım A.2. (Yukarıya bakınız) 'de hazırlanan bir lipozom çözelti, 10 ml BSA-Rodamin 2 ml (1.2 uM) ilave edilir.
3. Proteinlerin lizin kalıntısından NHS grup ile aktive edilmiş bir karboksilik asit ile amin gruplarının bağlayıcı için klasik tepkime (Şekil 2'de Reaksiyon şeması) takip edilmiştir. NHS-PCDA NHS-amin reaksiyonları (bkz. Şekil 2, Aşama 2) kullanılarak lipozomlar ile kovalent olarak bağlayan protein molekülleri için (Şekil 2, adım 1) tasarlanmıştır. NHS ileri yönde amin-karboksilik asit reaksiyon tahrik mükemmel bir ayrılma ajandır. Uygun koşullar altında bu tepkimenin verimi kantitatif olmalıdır.
4. Ücretsiz BSA-Rh Temizleme: deiyonize w: Spectra / Por Biyoteknoloji Selüloz Ester (CE) membran (100.000 MW C Ç) Soak15 dakika için onra. Bu membran diyaliz için kullanılan deiyonize su içinde BSA ile Rodamin (Molekül ağırlığı ~ 66000 Da) uzaklaştırılmaktadır.
5. Diyaliz membran için çözüm dikkatlice aktarın.
6. Diyaliz sırasında 2 saatte su, 8 saat, 14 saat, 24 saat ve 36 saat değiştirin.
7. Alüminyum folyo ile kaplı bir şişe içinde nihai çözüm toplayın.

C. hazırlanması SR-diamin ve Lipozomlar Biotin-etiketli

1. Bunun yerine adım 2.1 DMPC kullanmak yerine, biyotin-etiketli-(kullanır 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine-N-(biyotinil) (biyotin-DOPE).

1. 2,9-2,2 aracılığıyla tüm adımları izleyin.
2. Bunun yerine BSA-Rh adım B'de, (SR-diamin) tagged Sulphorhodamine Diamine kullanın.
3. B. tüm ileri adımlar takip
4. Bu hazırlık lipozomlar biotin içerdiği ve bunların yüzeylerinde SR-diamin. Müteakip adımlar bir istisna ile, A ve B (yukarıya bakınız) benzer olmuştur: Streptavidin soluti eklendideğişiklikler yoluyla biotin streptavidin etkileşimi araştırmak için verimlilik FRET.

D. Temsilcisi Sonuçlar

Başlık Şekil. Reaksiyon açıklayan bir karikatür ve lipozom yüzeyinde meydana işlemi (adım B izlenerek hazırlandı) FRET.

Kullanarak lipozomlar protein bağlanma A. İzlenmesi ¹ FRET

İzlenmesi Rodamin ve adım B. hazırlanan PDA lipozomlar arasında FRET

BSA-Rh uyarma ve emisyon spektrumları ve PDA emme spektrumu (Şekil 3A) alınır. Biz açıkça görebilirsiniz PDA absorpsiyon spektrumu ile BSA-Rh örtüşmektedir emisyon spektrumu. Bu FRET mekanizması için rezonans gereksinimi karşılar. Polimerizasyondan önce ve sonra BSA-Rodamin etiketli lipozomlar UV-V ile analiz edildive floresans spektroskopisi. Izole verici ve alıcı için, verimlilik donör-alıcı mesafesi (r) ve J ¹ (j-değeri) bağımlı olduğu FRET. Emisyon Sertleştirme çünkü fotopolimerizasyon sonra mavi PDA elektronik absorpsiyon spektrum görünümü nedeniyle rodamin ve PDA arasındaki FRET (Şekil 3B) görülmektedir. Bizim durumumuzda, verimliliği unpolymerized lipozomlar ve Rodamin için sıfır FRET çünkü J görünür bölgede unpolymerized lipozomlar için = 0.

Biz onların yüzeyinde NHS içermiyordu sadece PDA lipozomlarla benzer deneyler yaptı. Bu gibi durumlarda, BSA-Rh lipozomlar yüzeyine etiketlenmemiş edildi. Bu durumda, rodamin ve PDA (r _ortalama) arasındaki ortalama mesafe Forster yarıçapı (R ₀ = 2.8 nm) çok daha büyük oldu. Böylece, floresan yoğunluğunun büyük bir azalma gözlenmedi. Bu gözlemLSO zaman r <2,8 nm floresan su verme baskın olduğunu göstermektedir.

J ve R ₀ değerlerini aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplandı: [1]

J (λ) = ∫ F _D (λ) ε _A (λ) λ ⁴ dλ

R ₀ = 0.211 [k ² n ^-4 S _D J (λ)] ^1/6

Mavi-PDA sönme katsayısı (ε) ^-1 önceki streptavidin ilavesi için ~ 2000-10000 M ^-1 cm aralığındadır. Mavi-PDA sönüm katsayısı foto-polimerizasyon durumuna bağlıdır. [2] Örneğin, ε değerleri, daha uzun bir süre polimerize olan bir çözelti için daha büyük olacaktır. Ayrıca, Diasetilen monomerlerin kendi montaj da ε değerleri etkileyebilir. J Calculations Bu değişikliklerin dikkate almalarını, biotin streptavidin moleküler etkileşimler nedeniyle PDA söndürme katsayısı değişiklikleri yansıtacak. J değerleri deneysel PDA emilimi ve SR-101 emisyon verileri kullanılarak hesaplanmıştır. J değerlerindeki değişikliklerin çözelti (Şekil 4C) için streptavidin ve buna ek olarak aşağıdaki PDA elektronik emme spektrumu içinde kayması nedeniyle vardır. J değerleri ünitesi M ^{-1 cm-1} nm ^4'tür.

B. İzleme biyotin-etiketli lipozom çözümü için streptavidin ilavesiyle FRET

Not 1: Rodamin ve yukarıdaki adım C hazırlanan PDA lipozomlar arasında FRET izlenmesi.

Sulphorhodamine-etiketli bir eksitasyon ve emisyon spektrumlarına diamin (SR-diamin) ve PDA absorbsiyon spektrumunu (Şekil 4A) alınır. Unpolymerized ve polimerize biyotin etiketli lipozomlar UV-Vis kullanılarak analiz edildive floresans spektroskopisi. Rodamin (SR-101) emisyon FRET nedeniyle emisyon Sertleştirme düşündüren polimerizasyon (Şekil 4B) sonra yaklaşık% 45 azalmıştır. Lipozom çözelti, 2 ml solüsyon için streptavidin alikotları 40 ul (1 uM) ilave edilir. Çözümü için streptavidin ilavesi ile, J değerindeki değişiklikler (Şekil 4C) görülmektedir. Biyotin, streptavidin, PDA lipozomlar (Şekil 1 'de ~ 645 nm de) mavi doruk şiddeti bağlar olarak (F ŞEKIL 1S) görülmektedir 540 nm'de emme zirve de bir artış ise azalmıştır. Şekil 4D FRET değişiklikler gösterir verimlilik. Streptavidin konsantrasyon artışı ile azalmış FRET verimliliği de bizim tahmini ile tutarlıdır.

Streptavidin her 40 ul kısım eklendikten sonra SR emisyon kaydedin. Biz strept ilavesinden sonra rodamin emisyon sürekli bir artış gözlenmektediravidin (Şekil 5). Rodamin emisyon bu artış biotin streptavidin etkileşimi izleyerek sulphorhodamine emisyon spektrumu ve PDA absorbans spektrumu J değerinde bir azalma nedeniyle. Moleküler düzeyde, biotin streptavidin etkileşimi daha termodinamik olarak kararlı kırmızı-PDA formu ² mavi-PDA şeklinde bir azalma ile sonuçlanır PDA etkin konjugasyon uzunluğu ince değişikliklere yol açar. Bu J değerleri değişikliklerin temelini oluşturmaktadır. İlginç bir şekilde, PDA lipozom ile kovalent veya kovalent bağlı olmayan biotin için moleküler etkileşim içinde ince farklar bizim algılama tahlil kullanılarak ⁴ probed edilebilir.

Ayrıca, kontrol deneyleri yapıldı ve streptavidin-biotin sistem için olanlarla aynı deneysel koşullar altında kontrol numunelerinin emisyon takip ettik. Kontrol deneyleri oluşur: bunların üzerine (1) bulunan Liposome çözümleri biyotinyüzey aynı hacim ve konsantrasyon tampon çözelti ilave edildi, ve (2), yüzey üzerinde biyotin reseptörleri olmadan Lipozom çözelti aynı hacim ve konsantrasyon streptavidin ilave edildi. Streptavidin ilave edildikten sonra biyotin-etiketli lipozom çözeltisinin yoğunluğu geliştirilmiş yoğunluk gösterdi fakat kontrol deneyleri lipozom çözelti yoğunluğunu (örneğin, Şekil 2S bakınız), diğer yandan, bir emisyon yoğunluğu azalma sergiledi. Bu çözelti bir seyreltme bağlanmaktadır. Bu deneyler açıkça çözeltisi geliştirilmiş emisyon spesifik molekül etkileşimleri nedeniyle olduğuna işaret etmektedir.

Rodamin ve PDA çifti için Forster yarıçapına (R ₀₎ (eq.2) ~ 2.80 nm olarak hesaplanır. Bu r 2.80 nm olduğunda izole PDA-rodamin çiftleri için, uyarılmış durum rodamin moleküllerinin% 50 PDA transfer onların enerjiye sahip olacağı anlamına gelir.

Biz atıl biotin kovalent PDA omurgaya takılı olduğunda, emisyon artış lipozomlar olmayan kovalent bağlı biotin oranla 2-3 kat daha büyük olduğunu. ^4. Bu sonuçlar Önemle önerilen sistem etkileşimleri ince farkları ayırt duyarlı olduğunu düşündürmektedir Çeşit dönüştürücü de (biotin ve lipozom bilayeri arasındaki linker) lipozomlar bağlı kovalent ve non-kovalent bağlı reseptörler nedeniyle. Protein etkileşimlerinin spektrofotometre, gerçek zamanlı izleme (milisaniye içinde ikinci kez ölçeksiz) (UV-Vis spektroskopisi olarak) tarama ve veri toplama yetenekleri bağlı olarak bu algılama sistemi ile mümkündür.

Mavi ve kırmızı PDA çözümleri Şekil 1. Absorpsiyon spektrumu. (Ankastre) optik mikroskop, bir dijital kamera ile çekilen.

g "/>
Şekil 2. PCDA-NHS sentezi (adım 1) için reaksiyon şeması. Proteinlerin amin ikame edici (adım 2) PCDA-NHS reaksiyon. Adım 2 PCDA monomer karboksilik asit proteinlerin lizin kalıntısı bağlayıcı temelidir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3A. Gözlenen değişim verimliliği PDA absorpsiyon spektrumunda değişiklikler nedeniyle FRET. Polimerizasyon önce BSA-Rh emisyon ve PDA emme arasında ancak FRET için gerekliliktir BSA-Rh emisyon ile polimerleşme PDA emilim çakışıyor sonra hiçbir çakışma yoktur. Rodamin bir donör (kırmızı) ve polimerize PDA lipozomlar bir alıcı (mavi) olarak hareket ederler.

Şekil3B. Önce (mavi) ve PCDA polimerizasyon (kırmızı) sonra BSA-Rh etiketli lipozomlar floresans spektrumları. Rodamin emisyon büyük bir azalma rodamin ve PDA arasındaki FRET nedeniyle gözlenmiştir.

.. Şekil 4A spektral örtüşme (J) PDA (mavi veya kırmızı) emilme tayfı ve Sulphorhodamine emisyon spektrumunu (turuncu) değişimi Şekil 4A uç durum için temsili spektrumu; streptavidin aşırı çözelti ilave edildiği zaman olmasıdır. Şekil 4A, streptavidin fazla miktarda ilave ardından hemen hemen tam bir mavi-to-kırmızı PDA dönüşüm gösterir. Açıkça J (spektral örtüşme) PDA absorbsiyon spektrumunun mavi-shift ile arttığı görülmektedir

Şekil 4B. Floresans spektrumu önce (mavi) ve sonrası (red) lipozom polimerizasyonu.

Şekil 4C FRET için Durumu:. Donör (sulphorhodamine), lipozom çözeltiye ilave streptavidin ile alıcı (PDA) arasına J değişir.

Şekil 4D. Donör (sulphorhodamine), lipozom çözeltiye ilave streptavidin ile alıcı (PDA) arasındaki verim değişimi FRET.

Şekil 5,. PDA lipozom çözelti için streptavidin hacimde ilave edildikten sonra Rodamin emisyon spektrumunu. Inset SR-101 spektrumları emisyon değişikliklerin büyük bir görünümdür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz, NHS-amin reaksiyonu kullanılarak bir lipozom yüzeyi üzerinde protein lisin artığının seçici bağlayıcı gerçekleştirdik. Bu tabanlı yöntem lipozom yüzeyine bağlama biotin streptavidin bağlayıcı protein (BSA) Gerçek zamanlı izleme yapma yeteneğine sahiptir FRET. Benzer işlem, seçici reseptörleri ile çeşitli protein etkileşimlerinin bağlayıcı dinamiklerini incelemek için uygulanabilir. Florofor spektral özelliklere bağlı J değerleri değişiklik sağlayacak floroforlar seç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10,12-pentacosadiynoic asit (PCDA)	GFS kimyasallar	3261	Hassas Işık
N-hidroksisüksinimid (NHS)	Acros organikler	157270250	Hassas Nem
1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC)	Chem-impex Uluslararası	00050
1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P
Rodamin etiketli Sığır Serum Albumin (BSA-Rh)	Sigma Aldrich	A4537
(1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine-N-(biyotinil) (biyotin-DOPE)	Avanti Polar Lipids	870282