ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

Summary

אנחנו מדגימים סריג בין polydiacetylene מצומדת פולימר (PDA) וfluorophore מחובר אל פני השטח של כף יד ליפוזומים את החישה של ביומולקולות. יפוזומים PDA הכילו גם מולקולות הקולטן על משטחיהם לביומולקולות כדי לשמש כחלליות. אינטראקציות יגנד רצפטור להוביל לשינויים ביעילות סריג בין fluorophore ומחשבי כף היד, שהוא הבסיס של מנגנון החישה.

Abstract

סריג הוא תהליך שבו אנרגיה היא בלתי radiatively הועבר ממולקולת תורם נרגשת למולקולת acceptor מצב קרקע דרך אינטראקציות ארוכות טווח דיפול ^{דיפול-1.} בבדיקת החישה הנוכחית, אנו מנצלים תכונה מעניינת של PDA: משמרת כחולה בספקטרום UV-Vis האלקטרוני הספיגה של PDA (איור 1) לאחר אנליטי אינטראקציה עם קולטנים המחוברים למחשב כף היד ^2,3,4,7. שינוי זה בספקטרום ספיגת PDA מספק שינויים בחפיפת הרפאים (J) בין מחשב כף היד (acceptor) וrhodamine (תורם) שמובילים לשינויים ביעילות סריג. כך, יחסי הגומלין בין אנליטי (יגנד) והקולטנים שזוהו באמצעות סריג בין fluorophores התורם ומחשבי כף יד. בפרט, אנו מראים את החישה של streptavidin מולקולת חלבון דגם. אנחנו גם להפגין קוולנטי מחייבים של שור אלבומין (BSA) על פני שטח יפוזום עם סריג מנגנון. אינטראקציות אלה בין tהוא יפוזומים bilayer ומולקולות חלבון ניתן לחוש בזמן אמת. השיטה המוצעת היא שיטה כללית לחישה כימית קטנים ומולקולות ביוכימיות גדולות. מאז פלואורסצנטי הוא מהותי יותר רגיש מcolorimetry, גבול הגילוי של assay יכול להיות במגוון תת nanomolar או נמוך ^8. יתר על כן, מחשב כף יד יכולה לשמש acceptor אוניברסלי בסריג, מה שאומר שחיישנים מרובים ניתן לפתח עם PDA (acceptor) פונקציונליים עם תורמים ורצפטורים שונים שהוצמדו על פני השטח של ליפוזומים מחשבי כף יד.

Protocol

סינתזה ואפיון של א 'ליפוזומים PDA ^4,5,6

הערה 1: הגן על פתרון PDA מאור באמצעות עטיפת נייר אלומיניום על כל מכל לאורך כל שלבי הניסוי.

הערה 2: שתי קבוצות שונות של פתרון יפוזום (B ו-C) הוכנו הנוהל הבא (סינתזה ואפיון של ליפוזומים מחשבי כף יד).

1. סינתזה של N-hydroxysuccinimide Diacteylene (NHS-PCDA)

1. כדי להתכונן ליפוזומים, מרכיב חיוני PCDA-NHS הוא חובה. יש לנו מסונתז PCDA-NHS באמצעות ההליך הבא:
2. הוסף חומצה 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0.267 גרם, 0.713 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.0914 גרם, 0.786 mmol) ו 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (0.144 גרם, 0.713 mmol ) בCH היבש ₂ Cl ₂ (20 מ"ל).
3. מערבב את הפתרון בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
4. מוציא בזהירות את הממס באמצעות rמאייד otary להניב סרט דק יבש.
5. השתמש במשפך מפריד כדי לחלץ את השאריות עם דיאתיל אתר (25 מ"ל) ומים (25 מ"ל) שלוש פעמים.
6. ייבש את השכבה האורגנית עם MgSO ₄ (1.0 גרם) במשך חצי שעה. לסנן ולהסיר ממס על ידי אידוי סיבובי להשיג אבקה לבנה מוצקה (0.24 גרם,> 90%).
7. נתח מתחם סופי תחת תהודה מגנטית גרעינית (NMR).
8. H ¹ NMR (300 MHz, DMSO), δ (עמודים לדקה): 0.893 (t, 3H), 1.268 (מ ', 26H), 1.512 (מ', 4H), 1.754 (מ ', 2H), 2.252 (t, 4H), 2.365 (מ ', 1H), 2.610 (מ', 1H), 2.842 (הים, 2H).

2. הכנת liposome ^5,6,7

1. ממס PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) :: 8: 1: 1 מכל 20 מ"ל של dichloromethane.
2. סנן את הפתרון עם נייר סינון כדי להסיר אגרגטים.
3. להתאדות הממס לחלוטין להניב סרט דק של מונומרים.
4. ייבש את הסרט הדק הלילה תחת VACUUM.
5. מימה סרט עם מי deionized (50 מ"ל) כדי להפוך את הפתרון ליפוזום ריכוז רצוי (0.65-1 מ"מ).
6. Sonicate השעית התוצאה עם sonicator חללית ב76 מעלות צלזיוס במשך ~ 18 דקות.
7. בזהירות להעביר את הפתרון דרך פילטר נייר כדי להסיר אגרגטים השומנים
8. לקרר את הפתרון ב 4 ° C למשך הלילה כדי לקדם את ההרכבה עצמית של מונומרים. הפתרון הסופי צריך להיות ברור אופטי.
9. פלמר את מונומרים diacetylene עצמי התאספו (ליפוזום) על ידי הקרנה עם 254 ננומטר של קרינת UV ל~ 2 דקות באמצעות מקור UV ריי פן (4.5 mW / סנטימטר ²⁾ באוויר.
10. פתרון יפוזום היה יציב בטמפרטורת חדר במשך לפחות שבועות. הפתרון היה יציב יותר כאשר במקרר.

הכנה ב-BSA של (Rh) יפוזומים rhodamine מתויג-סרום שור אלבומין שונה PCDA

1. עקידת BSA-Rh על פני שטח יפוזום

1. ממס BSA-Rh ב PBS buffer (ריכוז יוני היה 0.01M, pH 7.2) כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1.2 מיקרומטר של פתרון BSA-rhodamine.
2. הוסף 2 מ"ל (1.2 מיקרומטר) של BSA-rhodamine עד 10 מ"ל של פתרון יפוזום המוכן בשלב א 2. (ראה לעיל) בטמפרטורת חדר.
3. תגובה קלסית לכריכה של קבוצות אמינות מהשאריות של חלבונים ליזין חומצת carboxylic מופעלת על ידי קבוצת שירותי בריאות כבר אחרי (ערכת תגובה באיור 2). NHS-PCDA תוכנן (איור 2, שלב 1) למולקולות חלבון מחייבת קוולנטית עם יפוזומים באמצעות תגובות NHS-אמינות (איור 2, שלב 2). NHS הוא סוכן מצוין עוזב שמניע את תגובת חומצת אמין-carboxylic בכיוון קדימה. התשואה של התגובה הזו בתנאים מתאימים צריכה להיות כמותית.
4. הסרה חופשיה BSA-Rh: משרה ספקטרה / קרום פור יוטק התאי אסתר (CE) (MW C O: 100,000) בw deionizedאטר במשך 15 דקות. קרום זה משמש לדיאליזה של unreacted BSA-rhodamine (משקל מולקולרי ~ 66000 דה) במי deionized.
5. בזהירות להעביר את הפתרון לקרום הדיאליזה.
6. להחליף את המים ב2 שעות, 8 שעות, 14 שעות, 24 שעות, 36 שעות בדיאליזה.
7. אסוף את הפתרון הסופי בבקבוקון מכוסה ברדיד אלומיניום.

ג הכנת SR-diamine וביוטין מתויגת-יפוזומים

1. במקום להשתמש DMPC בשלב 2.1, אנו נשתמש ביוטין-תויג-(1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (ביוטין-סמים).

1. בצע את כל השלבים עד 2.2-2.9.
2. במקום BSA-Rh בשלב ב ', השתמש diamine Sulphorhodamine המתויג (SR-diamine).
3. עקוב אחר כל הצעדים נוספים בB.
4. את יפוזומים בהכנה הכילו ביוטין ו-SR-diamine על השטח שלהם. השלבים הבאים היו דומים לA ו-B (ראה לעיל) עם חריג אחד: streptavidin התווסף לsolutiעל מנת לחקור אינטראקציות ביוטין-streptavidin דרך שינויים בסריג יעילות.

תוצאות מייצגות ד

איור הכותרת. קריקטורה המסבירה את התגובה וסריג תהליך המתרחש על פני שטח יפוזום (שהוכן על ידי ביצוע שלב ב).

ניטור א מצורף חלבון ליפוזומים באמצעות סריג ¹

ניטור של סריג בין rhodamine ויפוזומים כף יד שהוכנו בשלב ב '

ספקטרום עירור ופליטה של BSA-Rh וספקטרום ספיגה של PDA נלקחים (3A איור). אנו יכולים לראות בבירור כי ספקטרום הפליטה של ​​חופף BSA-RH עם ספקטרום הספיגה של מחשב כף יד. זה עונה על דרישת התהודה למנגנון סריג. BSA-rhodamine יפוזומים מתויגים לפני ואחרי פילמור נותחו עם UV-Vהוא וקרינת ספקטרוסקופיה. לתורם וacceptor המבודד, סריג היעילות תלויה מאוד במרחק-acceptor התורם (r) ו-J ¹ (j-ערך). המרווה בפליטה הוא ציין (איור 3 ב ') בגלל הסריג בין rhodamine ו-PDA בשל המראה של ספקטרום בליעה האלקטרוני של מחשב כף יד כחול לאחר photopolymerization. במקרה שלנו, סריג יעילות היא אפס ליפוזומים וrhodamine unpolymerized כי J = 0 ליפוזומים unpolymerized באזור הגלוי לעין.

בצענו ניסויים דומים ביפוזומים כף יד בלבד שלא מכילים NHS על פני השטח. במקרים אלה, BSA-Rh לא מתויג אל פני השטח של ליפוזומים. במקרה זה, המרחק הממוצע בין rhodamine ו-PDA (r _{הממוצע)} היה גדול בהרבה מרדיוס פורסטר (R ₀ = 2.8 ננומטר). לפיכך, אנו לא צופים ירידה חדה בעוצמת הקרינה. תצפית זוסימפוני מציע כי מרווית פלואורסצנציה היא דומיננטית כאשר R <2.8 ננומטר.

₀ ערכי J ו R חושבו באמצעות הנוסחות הבאות: [1]

J (λ) = ∫ F _D (λ) ε (λ) ⁴ dλ λ

R ₀ = 0.211 [יא ² n Q ^-4 _ד י (λ)] ^06/01

מקדם ההכחדה (ε) של כחול-PDA הוא בטווח של ~ 2000-10000 ^-1 סנטימטר M ^-1 לפני תוספת של streptavidin. מקדם ההכחדה של כחול-PDA הוא תלוי במצב הצילום פילמור. [2] לדוגמה, ערכי ε יהיו גדולים יותר לפתרון שמפולמר זמן ארוך יותר. יתר על כן, להרכבה העצמית של מונומרים diacetylene עשויה להשפיע גם על ערכי ε. J calculations לקחת בחשבון שינויים אלה, והם משקפים את שינויים במקדמי הכחדת כף היד עקב אינטראקציות מולקולריות ביוטין-streptavidin. ערכי J מחושבים באמצעות קליטת PDA ניסיונית וSR-101 נתוני פליטה. את השינויים בערכי J נובעים להעביר בספקטרום הבליעה האלקטרונית של מחשב כף יד לאחר התוספת של streptavidin לפתרון (האיור 4C). היחידה של ערכי J היא ^-1 סנטימטר M ^-1 ננומטר ^4.

ניטור ב 'של סריג עם תוספת של streptavidin לביוטין-תויג פתרון יפוזום

הערת 1: ניטור של סריג בין rhodamine ויפוזומים כף יד שהוכנו בשלב ג לעיל.

ספקטרום עירור ופליטה של Sulphorhodamine מתויג-diamine (SR-diamine) וספקטרום ספיגה של PDA נלקח (איור 4 א). Unpolymerized וpolymerized ביוטין יפוזומים מתויגים נותחו באמצעות UV-VISוקרינת ספקטרוסקופיה. פליטת rhodamine (SR-101) היא ירד בכ 45% לאחר פילמור (איור 4B) מרמז מרווית פליטה בשל סריג. הוסף 40 aliquots μl (1 מיקרומטר) של פתרון streptavidin עד 2 מ"ל של פתרון יפוזום. עם תוספת של streptavidin לפתרון, שינויים בשווי J הוא ציין (האיור 4C). כביוטין נקשר לstreptavidin, עוצמת השיא הכחולה של PDA יפוזום (מרוכז ב~ 645 ננומטר באיור 1) היה ירידה ואילו עלייה בשיא הקליטה ב540 ננומטר הוא ציין (F igure 1S). האיור 4D מראה שינויים בסריג יעילות. יעילות סריג ירד עם העלייה בריכוז streptavidin היא גם עולה בקנה אחד עם התחזית שלנו.

רשום את פליטת SR לאחר כל תוספת aliquot μl 40 מתוך streptavidin. אנו נצפינו עלייה מתמדת בפליטת rhodamine לאחר התוספת של streptavidin (איור 5). עלייה זו בפליטת rhodamine היא כתוצאה מירידה בשווי J לספקטרום sulphorhodamine הפליטה וספקטרום הספיגה PDA בעקבות אינטראקציות ביוטין-streptavidin. ברמה המולקולרית, אינטראקציות ביוטין-streptavidin להוביל לשינויים עדינים באורך הנטייה היעילה של מחשב כף היד שתוצאה מירידה בטופס כחול-PDA לצורה יותר יציב thermodynamically האדום PDA ^2. זה הוא בסיס לשינויים בערכי J. מעניין, את ההבדלים הדקים באינטראקציות המולקולריות לביוטין נקשר קוולנטית או לא קוולנטית ליפוזום PDA יכול להיות נחקר באמצעות assay החישה שלנו ^4.

יש לנו גם בצעו ניסויי בקרה והפיקוח שהפליטה של ​​דגימות בקרה באותם תנאים כמו אלה ניסיוניים למערכת streptavidin-ביוטין. הניסויים השליטים מורכבים: (1) פתרוני יפוזום שהכילו ביוטין עליהםמשטח נוספו פתרון חיץ של אותו נפח וריכוז; ו (2) פתרון Liposome ללא קולטנים ביוטין על פני השטח שלהם נוספו streptavidin של אותו נפח וריכוז. עוצמת פתרון יפוזום ביוטין מתויג-לאחר התוספת של streptavidin הראתה עצמה משופרת אך עוצמת פתרון יפוזום של הניסויים השליטים (לדוגמה, ראה איור 2S), לעומת זאת, הציגה ירידה בעוצמת פליטה. זו מיוחסת לדילול של הפתרון. ניסויים אלה הצביעו בבירור כי הפליטה המשופרת של הפתרון הייתה בשל אינטראקציות מולקולריות ספציפיות.

רדיוס פורסטר (R ₀₎ לזוג rhodamine ו-PDA מחושב (eq.2) להיות ~ 2.80 ננומטר. משמעות הדבר הוא כי לזוגות מבודדים PDA-rhodamine, 50% ממולקולות rhodamine מתרגשות המדינה יהיה האנרגיה שלהם מועברת למחשב כף יד, כאשר r הוא 2.80 ננומטר.

אנו בדיקות מס erved שכאשר ביוטין מחובר קוולנטית לשדרת כף היד, גידול הפליטה היה גדול פי 2-3 מזו של ביוטין המלוכד שאינו קוולנטית ליפוזומים. ⁴ תוצאות אלו ממליצות כי המערכת המוצעת שלנו רגישה כדי להבחין בהבדלים דקים באינטראקציות במתמר (מקשר בין ביוטין וbilayer יפוזום) בשל קולטנים קוולנטית ולא קוולנטית מלוכדת מצורפים ליפוזומים. בהתאם ליכולות הסריקה ורכישת נתונים של ספקטרופוטומטר הניטור בזמן אמת (באלפית שני לקנה מידה בפעם השנייה) של אינטראקציות חלבון (בספקטרוסקופיה UV-Vis) אפשריות עם מערכת חישה זו.

איור 1. ספקטרום קליטה של פתרוני מחשבי כף יד כחולים ואדומים. (הבלעה) micrographs האופטי צולם במצלמה דיגיטלית.

ז "/>
איור 2. תכנית תגובה לסינתזת PCDA-NHS (שלב 1). תגובה של PCDA-NHS לsubstituent האמין של חלבונים (שלב 2). שלב 2 הוא הבסיס מחייב של שאריות של חלבונים ליזין חומצת carboxylic של PCDA מונומר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

3A דמות. שינוי בנצפה סריג היעילות נובעת מהשינויים בספקטרום הספיגה של מחשב כף היד. לפני פילמור אין חפיפה בין הפליטה וPDA-BSA Rh קליטה אבל אחרי חפיפת פולימריזציה PDA קליטה עם פליטת BSA-Rh אשר הדרישה לסריג. Rhodamine הוא תורם (אדום) ומחשבי כף יד יפוזומים polymerized לפעול כacceptor (כחול).

דמות3B. ספקטרום קרינה של BSA-RH יפוזומים מתויגים לפני (כחול) ולאחר PCDA פילמור (אדום). ירידה חדה בפליטת rhodamine נצפתה בשל סריג בין rhodamine ומחשב כף יד.

.. 4A איור חפיפת Spectral (J) שינוי לספקטרום PDA (כחול או אדום) קליטה ופליטת ספקטרום Sulphorhodamine (כתום) איור 4A הוא ספקטרום הנציג למצב קיצוני, כלומר, כאשר עודף של streptavidin נוסף לפתרון. האיור 4A מראה שינוי PDA כחול לאדום כמעט מלא לאחר התוספת של עודף streptavidin. זה ברור שהוא ראה J (חפיפת רפאים) עולה עם משמרת כחולה של ספקטרום ספיגת PDA

האיור 4B. ספקטרום קרינה לפני (כחול) ואחרי (red) פילמור יפוזום.

האיור 4C תנאי לסריג: שינוי. J בין תורם (sulphorhodamine) וacceptor (PDA) עם תוספת streptavidin לפתרון יפוזום.

האיור 4D. סריג שינוי יעילות בין התורם (sulphorhodamine) וacceptor (PDA) עם תוספת streptavidin לפתרון יפוזום.

איור 5. ספקטרום פליטת rhodamine לאחר התוספת של aliquots streptavidin לפתרון יפוזום מחשב כף היד. הבלעה מראה תצוגה גדולה יותר של שינויים בפליטת ספקטרום SR-101.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנחנו בצענו מחייבים סלקטיבית של שיירי ליזין של חלבון על פני שטח יפוזום באמצעות תגובה NHS-אמינה. זה סריג שיטה מבוססת הוא מסוגלת לעשות ניטור בזמן אמת של ביוטין-streptavidin מחייב וחלבון (BSA) מחייב למשטח יפוזום. הליך דומה ניתן ליישם כדי ללמוד את הדינמיקה המחייבת של אינטראקציות ח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
חומצה 10,12-pentacosadiynoic (PCDA)	כימיקלי GFS	3261	אור רגיש
N-hydroxysuccinimide (NHS)	אורגני acros	157270250	לחות רגישה
hydrochloride-3-ethylcarbodiimide (EDC) 1 - - ((dimethylamino) propyl 3)	Chem-Impex הבינלאומי	00050
1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	שומני פולאר AVANTI	850345P
Rhodamine-תויג Ser שוראממ אלבומין (BSA-Rh)	סיגמה אולדריץ	A4537
(1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (ביוטין-סמים)	שומני פולאר AVANTI	870282