Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

Резюме

Мы демонстрируем FRET между сопряженными полидиацетилена полимера (PDA) и флуорофор прикреплены к поверхности липосом для PDA зондирования биомолекул. PDA липосомы также содержатся молекулы-рецепторы на своей поверхности для биомолекул, которые будут использоваться в качестве зондов. Лиганд-рецепторного взаимодействия приводят к изменениям в эффективности FRET между флуорофором и КПК, который является основой чувствительный механизм.

Аннотация

FRET является процесс, при котором энергия не является радиационно передается от возбужденной молекулы донора основного состояния молекулы акцептора через дальний диполь-дипольных взаимодействий ^1. В настоящее зондирования анализа, мы используем одно интересное свойство PDA: синий сдвиг в UV-Vis электронном спектре поглощения КПК (рис. 1) после аналита взаимодействует с рецепторами прикреплены к PDA ^2,3,4,7. Этот сдвиг в спектре поглощения PDA обеспечивает изменения спектрального перекрытия (J) между КПК (акцептор) и родамина (донора), что приводит к изменениям в FRET эффективности. Таким образом, взаимодействие между аналита (лигандов) и рецепторы обнаружены с помощью FRET между донором флуорофоров и КПК. В частности, мы показываем зондирования молекулы белка стрептавидина модели. Мы также демонстрируют ковалентной привязки бычьего сывороточного альбумина (БСА) в липосомы поверхность с FRET механизм. Эти взаимодействия между тОн бислой липосом и молекул белка может быть воспринято в режиме реального времени. Предлагаемый метод является общим методом для измерения небольших химических и биохимических больших молекул. С флуоресценции является принципиально более чувствительны, чем колориметрии, предел обнаружения анализ может быть в суб-наномолярных диапазоне или ниже ^8. Кроме того, КПК может выступать в качестве универсального акцептора в FRET, что означает, что несколько датчиков могут быть разработаны с КПК (акцептор) функционализированные с донорами и различные рецепторы прикреплены к поверхности липосом PDA.

протокол

А. Синтез и характеристика PDA Липосомы ^4,5,6

Примечание 1: Защита PDA решение от света, используя упаковку из алюминиевой фольги на каждом контейнере на протяжении всего экспериментального этапа.

Примечание 2: два различных набора раствор липосом (B и C), были подготовлены следующие процедуры (синтез и характеристику PDA липосомы).

1. Синтез N-гидроксисукцинимида Diacteylene (NHS-ВКПДР)

1. Для подготовки липосомы, важным элементом ВКПДР-NHS не требуется. Мы синтезировали ВКПДР-NHS, используя следующие процедуры:
2. Добавить 10,12-pentacosadiynoic кислоты (ВКПДР) (0,267 г, 0,713 ммоль), N-гидроксисукцинимид (0,0914 г, 0,786 ммоль) и 1 - (3 - (диметиламино) пропил)-3-этилкарбодиимида (0,144 г, 0,713 ммоль ) в сухом CH ₂ Cl ₂ (20 мл).
3. Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов.
4. Осторожно снимите растворителем с помощью гotary испарителе с получением сухой тонкой пленки.
5. Используйте делительную воронку, чтобы извлечь остатки диэтиловый эфир (25 мл) и воды (25 мл) три раза.
6. Органический слой сушат с MgSO ₄ (1,0 г) в течение получаса. Фильтр и удаления растворителя на роторном испарителе для получения белого твердого порошка (0,24 г,> 90%).
7. Анализ конечного соединения при ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
8. ¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО), δ (м.д.): 0,893 (т, 3Н), 1,268 (м, 26H), 1,512 (м, 4H), 1,754 (м, 2H), 2,252 (т, 4Н), 2,365 (м, 1H), 2,610 (м, 1H), 2,842 (с, 2H).

2. Липосомы подготовки ^5,6,7

1. Растворите ВКПДР: ВКПДР-NHS: 1,2-димиристоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) :: 8: 1: 1 в 20 мл дихлорметана.
2. Фильтр решение с фильтровальной бумагой, чтобы удалить агрегатов.
3. Испарения растворителя полностью до получения тонкой пленки мономеров.
4. Высушите тонкой пленкой в ​​течение ночи в вакуумвакуумного.
5. Гидратов фильм с деионизированной воды (50 мл), чтобы сделать раствор липосом из требуемой концентрации (0.65-1 мМ).
6. Разрушать ультразвуком полученной суспензии с помощью зонда ультразвуком при 76 ° С в течение ~ 18 мин.
7. Осторожно пройти раствора через бумажный фильтр для удаления липидных агрегатов
8. Охладите раствор при 4 ° С в течение ночи содействовать самосборки мономеров. Окончательное решение должно быть оптически прозрачным.
9. Полимеризоваться самоорганизующихся диацетилена мономеров (липосомы) путем облучения 254 нм УФ-излучения в течение ~ 2 мин с использованием УФ-Pen Ray источника (4,5 мВт / см ²⁾ в воздухе.
10. Раствор липосом была стабильна при комнатной температуре в течение по крайней мере двух недель. Решение было более стабильным, когда в холодильнике.

В. Подготовка родамина с метками бычий сывороточный альбумин (BSA-Rh), модифицированных липосом ВКПДР

1. Связывание BSA-Rh на поверхности липосомы

1. Растворите BSA-Rh в PBS буffer (ионная концентрация 0,01 М, рН 7,2), чтобы конечная концентрация 1,2 мкМ БСА-родамина решение.
2. Добавить 2 мл (1,2 мкМ) BSA-родамина к 10 мл раствор липосом, полученного на стадии А.2. (См. выше) при комнатной температуре.
3. Классическая реакция связывания аминогрупп от остатка лизина белка в карбоновой кислоты активируются NHS группы последовало (реакция схемы на рисунке 2). NHS-ВКПДР был разработан (рис. 2, шаг 1) для ковалентного связывания молекул белка с использованием липосом NHS-амин реакций (рис. 2, стадия 2). NHS является отличным оставив агента, который управляет амин-карбоновой кислоты реакция в прямом направлении. Выход из этой реакции при соответствующих условиях должно быть количественной.
4. Удаление свободного BSA-Rh: Замочить Spectra / Por Biotech эфиров целлюлозы (CE) мембраны (MW C O: 100.000) в деионизированной WВодный течение 15 мин. Эта мембрана используется для диализа непрореагировавшего BSA-родамина (молекулярная масса ~ 66000 Da) в деионизированной воде.
5. Осторожно передать решение в к диализной мембраны.
6. Меняйте воду на 2 часа, 8 часов, 14 часов, 24 часов и 36 часа во время диализа.
7. Сбор окончательное решение во флаконе покрыты алюминиевой фольгой.

С. Подготовка SR-диаминов и биотин-меченый Липосомы

1. Вместо DMPC в шаге 2.1, мы будем использовать биотин-меченых (1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-phosphoethanolamine-N-(биотинил) (биотин-DOPE).

1. Выполняйте все шаги через 2,2 до 2,9.
2. Вместо того, BSA-Rh в шаге B, использовать Diamine отмеченных Sulphorhodamine (SR-диамин).
3. Соблюдайте все дальнейшие шаги в B.
4. Липосомы в этом препарате, содержащейся биотин и SR-диаминов на их поверхности. Последующие шаги были похожи на А и В (см. выше), но с одним исключением: стрептавидин был добавлен в solutiк исследованию биотин-стрептавидин взаимодействия путем внесения изменений в FRET эффективности.

D. Представитель Результаты

Название рис. Мультфильм объяснения реакции и FRET процессов, происходящих на поверхности липосомы (подготовлен следующий шаг B).

А. Мониторинг белка привязанность к липосомы использованием FRET ¹

Мониторинг FRET между родамина и КПК липосом, полученных в шаге B.

Возбуждение и спектров излучения BSA-Rh и спектр поглощения PDA принимаются (рис. 3А). Мы можем ясно видеть, что спектр излучения BSA-Rh перекрывается со спектром поглощения КПК. Это удовлетворяет резонанс требования к FRET механизм. BSA-родамина отмеченных липосом до и после полимеризации были проанализированы с УФ-Vесть и флуоресцентной спектроскопии. Для изолированного донора и акцептора, FRET эффективность сильно зависит от донорно-акцепторных расстояние (г) и J ¹ (J-значение). Закалки в излучение наблюдается (рис. 3В) из-за FRET между родамина и КПК в связи с появлением электронного спектра поглощения синих PDA после фотополимеризации. В нашем случае, FRET эффективность равна нулю для неполимеризованных липосом и родамина потому, что J = 0 для Неполимеризованные липосом в видимой области.

Мы проводили подобные эксперименты только с КПК липосомы, которые не содержат NHS на их поверхности. В этих случаях, BSA-Rh не был привязан к поверхности липосом. В этом случае среднее расстояние между родамина и КПК (г _{средняя)} было гораздо больше, чем Форстер радиуса (R ₀ = 2,8 нм). Таким образом, мы не наблюдали значительное уменьшение интенсивности флуоресценции. Это наблюдениеРБП предполагает, что тушение флуоресценции является доминирующим при г <2,8 нм.

J и R ₀ значения были рассчитаны с использованием следующей формулы: [1]

J (λ) = ∫ F _D (λ) ε (λ) λ ⁴ dλ

R ₀ = 0,211 [K ² N ^-4 Q _D J (λ)] ^1/6

Коэффициент экстинкции (ε) сине-КПК в диапазоне 2000-10000 ~ М ^-1 см ^-1 до того стрептавидина. Коэффициент экстинкции сине-PDA зависит от фото-полимеризации состоянии. [2] Например, ε значение будет больше на решение, которое было полимеризоваться длительного времени. Кроме того, самосборка диацетилена мономеров может также повлиять на ε значения. J Calculобъема учитывать эти изменения, и они отражают изменения в PDA коэффициенты вымирания в связи с биотин-стрептавидин молекулярных взаимодействий. J значения рассчитываются с использованием экспериментальных поглощения КПК и SR-101 данные о выбросах. Изменениях в J значения за счет сдвига в электронном спектре поглощения КПК после того стрептавидина к решению (рис. 4в). Единица J значений М ^-1 см ^-1 нм ^4.

B. Контроль FRET с добавлением стрептавидина с биотин-меченый раствор липосом

Примечание 1: Мониторинг FRET между родамина и КПК липосом, полученных в шаге C выше.

Возбуждение и спектров излучения Sulphorhodamine с метками диамина (SR-диамин) и спектр поглощения PDA принимаются (рис. 4а). Неполимеризованные и полимеризованный биотин отмеченных липосомы были проанализированы с помощью UV-Visи флуоресцентной спектроскопии. Выбросов родамина (SR-101) уменьшается примерно на 45% после полимеризации (рис. 4В), что свидетельствует выбросов тушение из-за беспокоиться. Добавить 40 мкл аликвоты (1 мкМ) стрептавидина решение 2 мл раствор липосом. С добавлением стрептавидина к решению, изменения в стоимости J наблюдается (рис. 4в). Как биотин связывается с стрептавидин, синий пик интенсивности КПК липосомы (с центром в ~ 645 нм на рисунке 1) была снижена в то время как увеличение пика поглощения при 540 нм наблюдается (F igure 1S). Рис 4D показывает изменения в FRET эффективность. FRET эффективность уменьшается с увеличением концентрации стрептавидин также согласуется с нашим предсказанием.

Запись выбросов SR после каждых 40 мкл аликвоты того стрептавидином. Мы наблюдали устойчивый рост родамина выбросов после добавления streptавидином (рис. 5). Это увеличение родамина выбросов связано с уменьшением J значение для спектра излучения sulphorhodamine и КПК спектре поглощения после биотин-стрептавидин взаимодействия. На молекулярном уровне, биотин-стрептавидин взаимодействия приводят к тонким изменениям в эффективную длину сопряжения PDA, что приводит к снижению сине-PDA формой к более термодинамически стабильным красно-PDA форме ^2. Это является основой изменений в J значения. Интересно, что тонкие различия в молекулярных взаимодействий в ковалентно или нековалентно связанного биотина для КПК липосомы могут быть исследованы с помощью нашего зондирования анализа ^4.

Мы провели также контрольные опыты и мониторинг выбросов контрольных образцов в тех же экспериментальных условиях, как и для стрептавидин-биотин системы. Контрольные эксперименты состоят из: (1) липосомами решения, содержащиеся биотина на ихповерхности были добавлены буферный раствор того же объема и концентрации, а также (2) липосомами решение без биотином рецепторами на их поверхности были добавлены стрептавидин того же объема и концентрации. Интенсивность биотин-меченый раствор липосом после того стрептавидина показал повышенной интенсивности, но интенсивность липосомы Решение контрольных экспериментах (например, см. рис 2S), с другой стороны, выставлены снизилась в интенсивности излучения. Это связано с разбавлением раствора. Эти эксперименты ясно показали, что расширенные выбросов решение было связано с конкретными молекулярных взаимодействий.

Форстер радиуса (R ₀₎ для родамина и КПК пара рассчитывается (eq.2) составляет ~ 2,80 нм. Это означает, что для изолированных PDA-родамина пар, 50% от возбужденных молекул родамина государство будет иметь свою энергию, передаваемую на КПК, когда г 2,80 нм.

Мы набл erved, что, когда биотин ковалентно присоединен к КПК позвоночника, увеличение объема выбросов в 2-3 раза больше, чем у не-ковалентно связанных биотина в липосомы. ⁴ Эти результаты убедительно показывают, что предлагаемый нами система чувствительна к различить тонкие различия во взаимодействиях на преобразователь (линкер между биотином и липосомы бислой), в связи с ковалентно и не ковалентно связанные рецепторы прикреплены к липосомы. В зависимости от сканирования и сбора данных возможностей спектрофотометра, мониторинг в реальном времени (в миллисекундах на второй шкале времени) белковых взаимодействий (в UV-Vis спектроскопии) возможно с этой сенсорной системы.

Рисунок 1. Спектры поглощения синего и красного PDA решений. (Вставка) оптического микроскопа, сделанных цифровой камерой.

г "/>
Рисунок 2. Реакция схемы ВКПДР-NHS синтеза (шаг 1). Реакция ВКПДР-NHS до амина заместитель белков (шаг 2). Шаг 2 лежит в основе связывания остатка лизина белка в карбоновой кислоты ВКПДР мономера. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3А. Изменение в наблюдаемый FRET эффективности связано с изменениями в спектре поглощения КПК. Перед полимеризацией нет перекрытия между BSA-Rh выбросов и КПК поглощения, но после полимеризации PDA перекрывает поглощения с BSA-Rh выбросов, который является требованием для FRET. Родамина является донором (красный) и полимеризованный PDA липосом действовать как акцептор (синий).

Рисунок3В. Спектры флуоресценции BSA-Rh отмеченных липосом до (синий) и после ВКПДР полимеризации (красный). Значительное уменьшение выбросов родамина наблюдается в связи с FRET между родамина и КПК.

.. Рис. 4а спектрального перекрытия (J) изменения для КПК (синий или красный) спектра поглощения и Sulphorhodamine спектра излучения (оранжевый) Рисунок 4а является представителем спектре для экстремальных условий, то есть, когда избыток стрептавидин был добавлен в раствор. На рисунке 4а показаны почти полное сине-красные PDA преобразования после добавления избытка стрептавидином. Хорошо видно, что J (спектральный перекрытия) увеличивается с сине-сдвиг спектра поглощения PDA

Рисунок 4B. Спектры флуоресценции до (синий) и после (гред) липосомы полимеризации.

Рисунок 4C условия для FRET. J изменений между донором (sulphorhodamine) и акцептора (PDA) с стрептавидин того, чтобы раствор липосом.

Рисунок 4D. FRET эффективность изменений между донором (sulphorhodamine) и акцептора (PDA) с стрептавидин того, чтобы раствор липосом.

Рисунок 5. Родамина спектр излучения после добавления аликвоты стрептавидин на КПК раствор липосом. Врезка показывает увеличить выбросы изменений в SR-101 спектров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы провели избирательного связывания остатка лизина белка на поверхности липосомы использованием NHS-амин реакции. Это FRET метода, основанного на это способна в режиме реального времени мониторинг биотин-стрептавидина и белка (БСА) привязку к поверхности липосомы. Подобная процедура мо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
10,12-pentacosadiynoic кислоты (ВКПДР)	GFS химических веществ	3261	Светочувствительный
N-гидроксисукцинимида (NHS)	Acros Organics	157270250	Влагочувствительные
1 - (3 - (диметиламино) пропил)-3-этилкарбодиимида (EDC)	Chem-Impex International	00050
1,2-димиристоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC)	Avanti Polar липиды	850345P
Родамина с метками говядина Serит альбумина (БСА-Rh)	Sigma Aldrich	A4537
(1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-phosphoethanolamine-N-(биотинил) (биотин-DOPE)	Avanti Polar липиды	870282