A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
في هذه المقالة، ويقدم وسيلة إنتاجية عالية لتركيب يغوساكاريدس وتمسكهم سطح النانوية polyanhydride لاستخدامها مرة أخرى في استهداف مستقبلات معينة على خلايا مقدمة للمستضد.
النهج المتعدد التخصصات التي تشمل مجالات مثل تصميم المواد، وتكنولوجيا النانو، والكيمياء، وعلم المناعة لديها لاستخدامها في تصميم بعقلانية فعال لقاحات الناقلين. يمكن للجسيمات متناهية الصغر القائمة على منصات إطالة استمرار مستضدات اللقاحات، التي يمكن أن تحسن لقاح استمناع 1. وقد تم دراسة العديد من البوليمرات القابلة للتحلل وسائل إيصالها لقاح 1؛ على وجه الخصوص، والجسيمات polyanhydride أثبتت قدرتها على توفير إطلاق مستمرة من مولدات المضادات البروتين مستقرة والى تنشيط خلايا مستضد تقديم وتعدل الاستجابات المناعية 2-12.
التصميم الجزيئي لهذه الناقلات لقاح يحتاج إلى دمج الاختيار الرشيد لخصائص البوليمر، فضلا عن دمج المناسبة وكلاء الاستهداف. ارتفاع تلفيق الإنتاجية الآلي من استهداف يغاندس والجسيمات functionalized هو أداة قوية من شأنها أن تعزز القدرة على دراسة واسعة صأنج من الخصائص، وسوف تؤدي إلى تصميم استنساخه تسليم الأجهزة لقاح.
وقد تبين إضافة استهداف يغاندس قادرة على أن تعترف بها مستقبلات معينة على خلايا المناعة لتعديل والاستجابات المناعية خياط 10،11،13 مستقبلات كتين C-نوع (CLRs) هي مستقبلات نمط الاعتراف (PRRs) التي تعترف الكربوهيدرات موجودة على سطح من مسببات الأمراض. تنشيط الخلايا المناعية عن طريق CLRs يسمح لاستيعاب المعزز للمستضد وعرض لاحقة لمزيد من تنشيط الخلايا T 14،15. ولذلك، جزيئات الكربوهيدرات تلعب دورا هاما في دراسة الاستجابات المناعية، ولكن استخدام هذه الجزيئات الحيوية غالبا ما يعاني من عدم توافر هيكليا واضحة المعالم والكربوهيدرات النقية. يمكن لمنصة التشغيل الآلي على أساس حل تكرارية المرحلة ردود الفعل تمكن من التجميع السريع وتسيطر هذه الجزيئات تحديا صناعيا باستخدام ب أقل من ذلك بكثيرuilding كميات كتلة صلبة من الأساليب التقليدية في المرحلة 16،17.
هنا نقدم تقريرا بروتوكول لتركيب حل المرحلة الآلي من يغوساكاريدس مثل المانوز القائم على استهداف يغاندس مع استخراج الصلبة المرحلة fluorous لتنقية وسيطة. بعد تطوير طرق الآلي لجعل وكيل الكربوهيدرات القائم على استهداف، ونحن تصف أساليب لتعلقهم على سطح polyanhydride النانوية توظيف مجموعة الآلي الروبوت حتى تشغلها ابفيف كما هو موضح سابقا 10. وقد أظهرت functionalization السطح مع الكربوهيدرات فعالية في استهداف CLRs 10،11 وزيادة الإنتاجية للأسلوب تلفيق لكشف النقاب عن التعقيدات المرتبطة نظام متعدد حدودي لن تكون ذات قيمة كبيرة (الشكل 1A).
1. الإنتاجية العالية الكربوهيدرات التجميعي
2. الإنتاجية العالية Functionalization الجسيمات النانوية السطح
ملاحظات: حجم ترسب * تختلف مع كتلة النانوية الواردة في كل أنبوب.
ويمكن ان تتغير على أوقات رد الفعل ** لردود الفعل الأولى والثانية لضبط تركيز السكريد النهائي.
*** يترسب كل السكريد في أنابيب الاختبار اعتمادا على المجموعة المطلوبة.
**** لردة فعل معينة المعتمدة في هذه الدراسة على الحجز على الكربوهيدرات، ويتم استخدام حمض الجليكوليك كعنصر تحكم رابط منذ ساتشاريديس deprotected لديها بالفعل هذا الجزيء مرتبطة تساهميا، والذي يسمح للمزيد من التعلق على سطح جسيمات متناهية الصغر.
3. ممثل النتائج
وفولتم تصنيعه dimannoside لاي المحمية هو مبين في الشكل رقم 2 باستخدام منصة التشغيل الآلي. وقد تميزت مجمع توليفها من قبل الرنين المغناطيسي H 1 في مطياف VXR 400 ميغاهرتز باستخدام CDCl 3 كمذيب. يظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي في الشكل 3.
الاستفادة من تصنيع جزيئات النانو عالية الإنتاجية وfunctionalization من polyanhydride النانوية الموصوفة هنا، وقد تم تنفيذ الحجز على اللاكتوز، dimannose والجالاكتوز بنجاح 10 و 11. تستخدم هذه المجموعة حتى تم تحديد الظروف المثلى رد فعل (على سبيل المثال، درجة حرارة التفاعل والوقت) لتحقيق المطلوب functionalization جسيمات متناهية الصغر والصرف. عندما تم تنفيذ رد فعل بها في 4 درجات مئوية بدلا من درجة حرارة الغرفة، لوحظ وجود انخفاض في تجميع جسيمات متناهية الصغر من قبل ووزارة شؤون المرأة (لا تظهر البيانات). ويبين الجدول 1 النتائج ممثل توصيف CPTEG 50:50 functionalized: النانوية CPH إما مع المانوز-دي أواللاكتوز، وتوليفها في 4 درجات مئوية. وتشير البيانات إلى زيادة طفيفة في قطر جسيمات متناهية الصغر في المتوسط نظرا لfunctionalization. في حين كان لجزيئات غير functionalized احتمال زيتا سلبية تقريبا. -20 بالسيارات، وأظهرت الجزيئات functionalized قيمة زيتا الإيجابية المحتملة، مما يدل على functionalization الناجح لسطح جسيمات متناهية الصغر. اللاكتوز ودي المانوز وكلاهما من السكريات محايد، ولكن جماعات أمين خال من الاثيلين ديامين رابط تستخدم لنعلق ساتشاريديس قد تكون مسؤولة من إمكانات زيتا إيجابي.
وقت رد فعل آخر هو متغير التي يمكن أن تؤثر على كل من التشكل النهائي للجزيئات ودرجة التعلق السكر التي تحققت. عن طريق ضبط وقت رد الفعل، ويمكن التحكم في تركيز السكر النهائية التي تعلق على سطح النانوية كما هو مبين في الشكل 4A. كما كان متوقعا، وتركيز dimannose على سطح CPTEG 50:50: CPH النانوية مع زيادةبلغ إجمالي الوقت من رد فعل وبحد أقصى بعد 18 ساعة. واستخدمت النانوية functionalized مع الوقت رد فعل مجموع 24 ساعة لتقييم قدرتها على استهداف CLRs على الماوس نقي العظم الخلايا الجذعية المشتقة (DCS). وقد استخدم التدفق الخلوي لتقييم التعبير عن مستقبلات CL 2 (أي سيري (CD209، DC-SIGN) ومستقبلات المانوز (CD206)) بعد التحفيز مع functionalized غير، واللاكتوز وثنائي المانوز النانوية functionalized (الشكل 4B). تم الحصول على أعلى تعبير عن كل من المستقبلات، وهو يدل على الاستهداف الفعال، عندما تم تحفيز الخلايا مع كل من اللاكتوز و DI-المانوز النانوية functionalized. ومع ذلك، أظهرت DI-المانوز-functionalized الجزيئات إلى مستوى أعلى من التعبير يشير إلى خصوصية هذه يجند لمستقبلات التي تمت دراستها.
جسيمات متناهية الصغر نوع | متوسط القطر الجسيمات (نانومتر) | افيالجسيمات الغضب ζ الإمكانات (السيارات) |
غير functionalized | 162 ± 43 | -20 ± 0.6 |
اللاكتوز | 235 ± 34 | 26 ± 2.4 |
DI-المانوز | 243 ± 32 | 30 ± 4.2 |
الجدول رقم 1. توصيف جسيمات متناهية الصغر. واتسمت غير functionalized وfunctionalized من تشتت الضوء شبه مطاطة والقياسات زيتا المحتملة. بيانات حجم الجسيمات تمثل قيمة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من البيانات الديناميكي تشتت الضوء التي تم جمعها في ثلاث تجارب مستقلة. بيانات زيتا المحتملة تمثل قيمة متوسط ± التنمية المستدامة من ثلاث قراءات مستقلة. تغيير في مؤشر على احتمال زيتا يدل على أن السكر كان مترافق كفاءة لCPTEG 50:50: CPH سطح جسيمات متناهية الصغر.
= "/ files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
الشكل 1: (أ) تمثيل رسومي للنهج السعي مع functionalization الكربوهيدرات النانوية polyanhydride ومثالا للمكتبات functionalized جسيمات متناهية الصغر التي يمكن أن تكون مصممة مع النهج الإنتاجية العالية وصفها. (ب) تمثيل تخطيطي للجهاز ترسيب الآلي المستخدمة لfunctionalization جسيم، والذي يتألف من (ط) ثلاث مضخات NE 1000، (الثاني) مرحلة الروبوتية متكاملة من قبل اثنين من المحركات (Zaber): واحد للحركة في اتجاه x والآخر للحركة في اتجاه y، (الثالث) في مرحلة ثانية الروبوتية مع اثنين من الرفوف المجاورة (المناسبة للأنابيب وcuvettes)، ويتألف من ثلاثة المحركات، واحد لكل اتجاه (X، Y، و Z). يتم توصيل المضخات وما مجموعه خمسة المحركات في سلسلة. ويتم تشغيل المحركات والمضخات عن طريق الكمبيوتر باستخدام ابفيف البرمجيات. هذا المخطط ليس على نطاق واسع.arge.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. تمثيل رسومي للآلية التكرارية توليف الكربوهيدرات باستخدام المانوز كمثال على ذلك.
الشكل 3. 1 H NMR من dimannoside المحمية.
الشكل 4. (A) تأثير وقت رد الفعل على تركيز سطح جسيمات متناهية الصغر من السكريد. في البيانات التي تظهر، 50:50 CPTEG: تم functionalized النانوية CPH مع dimannose في بعض الأحيان رد فعل مختلفة، ونفذ فيها التفاعل عند 4 درجات مئوية. ويظهر الخطأ متوسط ومستوى تجربتين functionalization مستقل. (ب) واللاكتوز دي المانوز-النانوية functionalizedمستقبلات بفعالية الهدف DC-SIGN (سيري، CD209) والمانوز (CD206) في نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية، كما ظهر من التعبير تعزيز هذه العلامات اثنين بعد التحفيز مع CPTEG 50:50 functionalized: النانوية CPH بالمقارنة مع التعبير التي تم الحصول عليها مع المنظمات غير functionalized الجزيئات.
وقد فعالية من الكربوهيدرات كما تستهدف وكلاء لتفاعلات جسيمات متناهية الصغر مباشرة إلى الخلايا المناعية أثبتت سابقا 10 و 11. وقد أظهرت البحوث السابقة في مختبراتنا أن السكريات محددة ملحقة النانوية polyanhydride قادرة على استهداف CLRs مختلفة على الخلايا مستضد تقديم (ناقلات...
NLBP هو أحد مؤسسي، ويحمل في رأس مال شركة الكربوهيدرات LuCella العلوم البيولوجية، وشركة
فإن الكتاب أود أن أشكر للبحوث الطبية للقوات المسلحة الامريكية والعتاد القيادة (جرانت # W81XWH-10-1-0806)، والمعاهد الوطنية للصحة (جرانت # U19 AI091031-01 وغرانت # 1R01GM090280) للحصول على الدعم المالي. BN يعترف Balloun الأستاذية في الهندسة الكيميائية والبيولوجية وNLBP يعترف الأستاذية ويلكنسون من التخصصات الهندسية. نشكر جوليا فيلا على مساعدتها في إجراء تجارب functionalization جسيمات متناهية الصغر.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم | شركة | فهرس العدد | |
بمحركات XYZ المرحلة: 3X T-LSM050A و 50 ملم في محور السفر | Zaber تقنيات | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
NE-1000 مضخة الحقنة واحدة | جديد أنظمة عصر مضخة | NE-1000 | |
بيركس * فيستا * بدون إطار الثقافة الزجاج القابل لإعادة الاستخدام أنابيب | كورنينج | 07-250-125 | |
ASW 1000 | Chemspeed تقنيات | ||
ابفيف | الصكوك الوطنية | 776671-35 | |
شركة سوسيتيه جنرال حقن الغاز ضيق، Luer لوك | سيجما ألدريتش | 509507 | |
XL-2000 Sonicator | Qsonica | Q55 | |
مصغرة أنبوب محور دوار | فيشر العلمية | 05-450-127 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved