Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein hoher Durchsatz Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und ihre Befestigung an der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid zur weiteren Verwendung bei der Ausrichtung der spezifische Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wird.

Zusammenfassung

Transdisziplinäre Ansätze unter Einbeziehung Bereichen wie Material-Design, Nanotechnologie, Chemie, Immunologie und müssen genutzt werden, um rational zu entwerfen wirksame Impfstoffe Carriern werden. Nanopartikel-basierte Plattformen können verlängert die Persistenz der Impfstoff-Antigene, die Verbesserung der Immunogenität Impfstoff könnte ^1. Mehrere biologisch abbaubare Polymere sind als Impfstoffen Fahrzeugen ¹ untersucht, insbesondere Polyanhydrid Teilchen die Fähigkeit zur Freisetzung von stabilen Protein-Antigene bereitzustellen und Antigen-präsentierenden Zellen zu aktivieren und zu modulieren Immunantworten ^2-12 gezeigt.

Die molekularen Aufbau von diesen Vakzin-Trägern muss die rationale Auswahl der Eigenschaften von Polymeren sowie den Einbau von geeigneten Zielmittel integrieren. Hoher Durchsatz automatisierter Herstellung von Targeting-Liganden und funktionalisierte Partikel ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Fähigkeit, ein breites r studieren verbessern wirdAnge von Eigenschaften und trägt zur Gestaltung von reproduzierbaren Impfstoff Abgabevorrichtungen führen.

Die Zugabe von Zielliganden, die durch spezifische Rezeptoren auf Zellen erkannt wurde gezeigt, zu modulieren und Schneider Immunantworten ^10,11,13 C-Typ Lektin-Rezeptoren (CLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR), die auf der Kohlenhydratgehalt erkennen Oberfläche von Krankheitserregern. Die Stimulation von Immunzellen über CLRs erlaubt eine gute Internalisierung des Antigens und anschließende Präsentation für weitere T-Zell-Aktivierung ^14,15. Daher spielen Kohlenhydrat-Moleküle eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Immunantwort, jedoch die Verwendung dieser Biomoleküle leidet oft die mangelnde Verfügbarkeit von strukturell gut definiert und reine Kohlenhydrate. Ein Automatisierungs-Plattform auf iterative Lösung-Phasen-Reaktionen basieren, können eine schnelle und kontrollierte Synthese dieser Moleküle synthetisch herausfordernden mit deutlich niedrigeren bEBÄUDE Block Mengen als herkömmliche Festphasenmethoden ^16,17.

Hier berichten wir über ein Protokoll für die automatisierte Lösung-Phasen-Synthese von Oligosacchariden wie Mannose-based Targeting-Liganden mit fluorierten Festphasenextraktion für die Zwischen-Reinigung. Nach der Entwicklung von automatisierten Verfahren, um die Kohlenhydrat-Zielmittel machen, beschreiben wir für ihre Befestigung auf der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid Verwendung einer automatisierten Roboter-Einrichtung betrieben werden, wie zuvor LabVIEW ¹⁰ beschrieben. Funktionalisierung von Oberflächen mit Kohlenhydraten hat seine Wirksamkeit bei der Ausrichtung der CLRs ^10,11 und die Erhöhung der Durchsatzleistung des Herstellungsverfahrens auszugraben die Komplexität mit einer multi-parametrischen Systems verbunden sind, werden von großem Wert (Abbildung 1a) gezeigt werden.

Protokoll

1. Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten

1. Vor der automatisierten Synthese dimannoside, eine entsprechend geschützte Zuckerdonor, typischerweise Trichloracetimidat, und Akzeptor, vor allem eine Alkenylgruppe fluorierten Alkohol, auf dem Arbeitstisch synthetisiert.
2. Ein Programm wurde für die automatisierte Synthese von dimannoside geschrieben. Eine schematische Darstellung der grundlegenden automatisierten Verfahrens ist in 2 dargestellt. In dem Programm, wird sichergestellt, dass vor der Zugabe des Promotors, die Mischung von Donor und Akzeptor für mindestens 30 min gerührt.
3. Lösungen des synthetischen Donor, Akzeptor und Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat werden in Dichlormethan hergestellt. Toluol und Dichlormethan werden am häufigsten für Glycosylierungen verwendet.
4. Außerdem werden die Lösungen der Reagentien für die Schutzgruppenabspaltung der temporären Schutzgruppen in 80% Methanol und 100% Methanol.
5. Vor dem Beginn des Programms, sicherzustellen, dass der jeweiIVE Luftfeuchtigkeit im Raum ist 30% oder weniger in der Automatisierung Kammer. Hohe Luftfeuchtigkeit ist schädlich für Glycosylierungsreaktionen.
6. Sobald das Programm gestartet wird, überträgt der Roboterarm die Lösungen von Donor und Akzeptor in das Reaktionsgefäß nacheinander. Dann wird die Mischung 30 Minuten lang gerührt.
7. Weiter der Roboterarm überträgt 0,2 bis 0,3 Äquivalente Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat in die Mischung, typischerweise bei Raumtemperatur obwohl niedrigere Temperaturen wie -20 ° C erreicht werden kann. Das Reaktionsgemisch wird 30 min gerührt.
8. Nach 30 min wird die Reaktion gestoppt und ein kleines Aliquot entfernt, um die Reaktion Fortschritt zu überwachen. Wenn nicht abgeschlossen ist, kann die Reaktion fortgesetzt und schließlich die erforderliche Zeit geändert werden kann.
9. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch auf der fluorhaltigen Festphasenextraktion (FSPE) Kartuschen mit C ₈ F _{17-modifizierten} Kieselgel zur Reinigung übertragen.
10. Der WagenRippen zunächst mit einer 80% Methanol-Wasser-Gemisch (8 ml), um die Beseitigung der Nicht-Fluorphase Fraktion gewaschen.
11. Dann werden die Patronen werden mit 100% Methanol gewaschen, um die gewünschte fluormarkierten Produkt zu erhalten. Wenn zusätzliche Reinigung gewünscht wird, kann die Maschine zu stoppen und das Reaktionsprodukt (en) für die Reinigung durch zusätzliche Maßnahmen entfernt werden.
12. Nach der Reinigung Zyklus, verzichtet der Roboterarm Natriummethylat in das Reaktionsgefäß. Die Reaktion wird für 2 Stunden gerührt. Wenn nicht abgeschlossen ist, kann die Reaktion erneut für einen längeren Zeitraum fortgesetzt werden und schließlich die programmierte Zeit erforderlich ist, geändert werden.
13. Nach Beendigung der Reaktion wird das Produkt durch FSPE gereinigt und dann Auflösen in wasserfreiem Toluol unterzogen, gefolgt von Verdampfung um Restwasser zu entfernen.
14. Anschließend beginnt der Zyklus (von Schritt 6 bis 13) wird wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge für das Zielmolekül erhalten wird.
15. Das geschützte Produkt von der Automatisierung erhalten wird, ist then weiter gereinigt und vollständig durch Techniken wie Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie charakterisiert. Totalentschützung (Entfernung aller verbleibenden Schutzgruppen) der endgültigen Zielmolekül wird dann außerhalb der Automatisierungsplattform der Regel abgeschlossen werden, da sich in der Regel explosives und Palladium. Die endgültige Entschützungsschritt wurde am Tischgerät außerhalb der Automatisierungs-Plattform durchgeführt. Der erste Schritt war Ozonolyse der Doppelbindung in fluorigen Tag durch Oxidation des gebildeten Aldehyd zu einer Carbonsäure, gefolgt. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Der letzte Schritt war Entschützung Benzylethergruppen durch Palladium-katalysierten Hydrierung. Das Produkt wurde durch Celite-Pad weitergegeben loswerden Palladium auf reine Endprodukt zu bekommen.

2. High-Throughput-Nanopartikel-Oberfläche Funktionalisierung

1. High-Throughput-Polymer-Nanopartikel-Synthese und Herstellung erfolgt nach dem gleichen PR durchgeführtotocol und Roboter einrichten beschrieben von Petersen et al ^19. Die Copolymer-Systeme für die Herstellung verwendeten Partikel auf Sebacinsäure (SA) und 1,6-Bis (para-carboxyphenoxy) Hexan (CPH), und 1,8-Bis basieren ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) und CPH. Eine schematische Darstellung der Roboter Abscheidungsvorrichtung verwendet wird in 1b dargestellt.
2. Nach Nanopartikel Herstellung wird der Halter, die Rohre mit der Nanopartikel-Bibliothek an den linearen Stellantrieb Stufe wieder befestigt werden.
3. Zur Befestigung von Kohlenhydraten an der Oberfläche der Teilchen Polyanhydrid, wird ein Amin-carbonsäure-Kupplung ^20, bestehend aus zwei aufeinander folgenden Reaktionen durchgeführt.
4. Für die erste Reaktion, die Spritze in der ersten programmierbaren Spritzenpumpe mit 10 Äquivalenten (Gl.) (Äquivalente Molekulargewicht Carbonsäure Konzentration auf Partikeloberfläche) aus gefülltem 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-ca.rbodiimide Hydrochlorid (EDC) und 10 eq. Ethylendiamin in einer wässrigen Lösung, während die Spritze in der zweiten programmierbaren Spritzenpumpe mit 12 äq geladen. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in wässriger Lösung.
5. Mithilfe des LabVIEW-Programm, werden Reagenz Suspensionen von Nanopartikeln in die Bibliothek * hinterlegt.
6. Als nächstes wird jede Probe mit Ultraschall behandelt (30 s bei 40 Hz) und der Schlauchhalter ausgewählt ist aus der Roboter-Plattform abgelöst.
7. Nanopartikel-Suspensionen sind für 9 h ** mit ständiger Rotation bei 4 ° C inkubiert
8. Nach Reaktionszeit abgeschlossen ist, werden Röhrchen zentrifugiert (12000 xg für 5 min) und kehrte in die Roboter-Station, um zwei Waschschritte durchzuführen.
9. Zum Waschen bleibt eine Spritze leer und mit dem in den ersten programmierbaren Spritzenpumpe, während die Spritze in der zweiten Spritzenpumpe mit kaltem Wasser gefüllt ist. Der Überstand in jedem Röhrchen wird in die leere Spritze und die zweite Pumpe Ablagerungen kaltem Wasser entzogen.
10. Homogenisierung von NanoPartikel-Suspension erfolgt wie in Schritt 2.6 beschrieben. Die Rohre werden dann zentrifugiert (12000 × g für 5 min) und einem zweiten Waschschritt wird durchgeführt, wie in Schritt 2.9 beschrieben.
11. Für die zweite Reaktion, werden zwei Schritte Abscheidung verwendet. In der ersten Abscheidungsschritt, 12 eq. EDC mit einer Pumpe und 12 eq geladen. NHS mit der zweiten Pumpe geladen.
12. Der zweite Schritt umfasst Abscheidung 10 eq. einer spezifischen Substanz auf den ersten und zweiten Pumpen (dh Galactose, Lactose oder Di-Mannose) *** und eine dritte Pumpe mit 10 eq. Glykolsäure (als Kontrolle verwendet ****).
13. Nanopartikel-Suspensionen wird homogenisiert, wie auf Schritt 2.6 beschrieben und inkubiert für 9 h mit ständiger Rotation bei 4 ° C
14. Nachdem die Zeit der Reaktion abgeschlossen ist, wird ein Waschschritt durchgeführt, wie in den Schritten 2.8, 2.9 und 2.10 beschrieben.
15. Das funktionalisierte Nanopartikel-Bibliothek wird dann in einer Vakuumkammer angeordnet, um für mindestens 2 Stunden trocknen.
16. Die funktionalisierten Nanopartikel werden dann CharakterIzed durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie und einen hohen Durchsatz Phenol-Schwefelsäure-Test, um die Oberfläche Zusammensetzung und Konzentration des Saccharids jeweils zu bestimmen. Rasterelektronenmikroskopie und dynamische Lichtstreuung werden genutzt, um Partikelgröße, Größenverteilung und Oberflächenladung zu bestimmen.

Anmerkungen: * Deposition Volumen variieren mit der Masse von Nanopartikeln in jedem Röhrchen enthalten.
** Reaktionszeiten bei ersten und zweiten Reaktionen können geändert werden, um die endgültige Saccharidkonzentration einzustellen.
Jedes Saccharid *** werden in Reagenzgläser Abhängigkeit von der gewünschten Gruppe abgeschieden.
**** Für die spezifische Reaktion in dieser Studie für die Befestigung von Kohlenhydraten verwendet wird, wird Glycolsäure als Linker Kontrolle verwendet, da sich dieses Saccharide entschützten Moleküls kovalent verknüpft, die für die weitere Befestigung an Nanopartikeloberfläche zulässt.

3. Repräsentative Ergebnisse

Die FULly geschützt dimannoside in Abbildung 2 dargestellt wurde unter Verwendung der Automation-Plattform. Die synthetisierte Verbindung wurde durch ¹ H-NMR in einem VXR 400 MHz Spektrometer unter Verwendung von CDCl ₃ als Lösungsmittel enthält. Das NMR-Spektrum ist in 3 gezeigt.

Unter Verwendung des High-Throughput-Nanopartikel Herstellung und Funktionalisierung von Polyanhydrid-Nanopartikel beschrieben, hat Befestigung dimannose, Lactose und Galactose wurden erfolgreich ^{10, 11} durchgeführt. Mit diesem Aufbau wurden optimalen Reaktionsbedingungen (dh, der Reaktionstemperatur und Zeit) identifiziert gewünschte Funktionalisierung Nanopartikel und Morphologie zu erreichen. Wenn die Reaktion wurde bei 4 ° C statt bei Raumtemperatur, eine Verringerung Nanopartikelaggregation wurde durch SEM beobachtet (Daten nicht gezeigt). Tabelle 1 zeigt repräsentative Ergebnisse der Charakterisierung von funktionalisierten 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel entweder mit Di-Mannose oderLactose, bei 4 ° C synthetisiert Die Daten zeigen einen kleinen Anstieg der durchschnittlichen Durchmesser Nanopartikel aufgrund der Funktionalisierung. Während die nicht-funktionalisierte Nanopartikel einen negativen Zeta-Potential von ca.. -20 MV zeigten die funktionalisierten Partikel ein positives Zetapotential Wert und zeigt erfolgreiche Funktionalisierung der Oberfläche der Nanopartikel. Laktose und Di-Mannose beide neutralen Zuckern, doch, Diamin freien Amingruppen aus dem Ethylen-Linker verwendet werden, um die Saccharide und kann auch verantwortlich der positiven Zeta-Potential.

Die Reaktionszeit ist eine weitere Variable, die sowohl die endgültige Morphologie der Nanopartikel und der Grad der Zucker Anlage erreicht beeinflussen könnten. Durch Einstellen der Reaktionszeit kann die endgültige Zuckerkonzentration an die Nanopartikel angeheftet Oberfläche gesteuert, wie in 4A gezeigt. Wie erwartet, die Konzentration des dimannose auf der Oberfläche von 50:50 CPTEG: CPH-Nanopartikel mit erhöhterdie Gesamtzeit der Reaktion und erreichte ein Maximum nach 18 Stunden. Nanopartikel mit dem 24 Stunden Gesamt-Reaktionszeit funktionalisiert wurden verwendet, um ihre Fähigkeit, auf CLRs Maus aus dem Knochenmark dendritische Zellen (DCs) gezielt zu evaluieren. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Expression von zwei CL-Rezeptoren (dh, CIRE (CD209, DC-SIGN) und Mannose-Rezeptor (CD206)) nach Stimulation mit nicht funktionalisierten und Lactose und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikel (4B) zu bewerten. Eine höhere Expression der beiden Rezeptoren, die ein Hinweis auf effektive Targeting ist, wurde erhalten, wenn Zellen, die sowohl Lactose und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikel stimuliert wurden. Jedoch zeigten Di-Mannose-funktionalisierten Teilchen eine höhere Expression anzeigt, eine Spezifität dieses Liganden für die Rezeptoren, die untersucht wurden.

Nanopartikel-Typ	Durchschnittlicher Partikeldurchmesser (nm)	AveWut Particle ζ-Potential (mV)
Nicht-funktionalisierte	162 ± 43	-20 ± 0,6
Laktose	235 ± 34	26 ± 2,4
Di-Mannose	243 ± 32	30 ± 4,2

Tabelle 1. Nanopartikelcharakterisierung. Nicht-funktionalisierte und funktionalisierte wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung und Zetapotential Messungen charakterisiert. Partikelgrößen-Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der dynamischen Lichtstreuung Daten in drei unabhängigen Experimenten gesammelt. Zetapotential Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen. Änderung des Vorzeichens des Zetapotentials zeigt, dass Zucker war effizient, konjugiert mit dem 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel-Oberfläche.

= "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
Abbildung 1. (A) Grafische Darstellung der Ansatz mit Kohlenhydrat-Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid und ein Beispiel der funktionalisierten Nanopartikel-Bibliotheken, die mit der beschriebenen High-Throughput-Ansatz konzipiert werden konnte verfolgt. (B) Schematische Darstellung des automatisierten Abscheidungsvorrichtung zur Partikelfunktionalisierung, der aus (i) drei NE 1000 Pumpen besteht verwendet, (ii) ein Roboter-Stufe durch zwei Aktuatoren (Zaber) integriert ist: ein zur Bewegung in x-Richtung und der andere für eine Bewegung in y-Richtung, (iii) eine zweite Roboter mit jeweils zwei benachbarten Gestellen (geeignet für Rohre und Küvetten), bestehend aus drei Aktuatoren, eine für jede Richtung (x, y und z). Die Pumpen und insgesamt fünf Aktuatoren in Reihe geschaltet sind. Stellantriebe, Pumpen werden von einem Computer mit LabVIEW-Software betrieben. Diese Darstellung ist nicht maßstabsgetreu.arge.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Graphische Darstellung des automatisierten iterativen Synthese von Kohlenhydraten am Beispiel Mannose.

3. ¹ H-NMR des geschützten dimannoside.

Abbildung 4. (A) Wirkung der Reaktionszeit auf Nanopartikeloberfläche Konzentration von Saccharid. In den gezeigten Daten, 50:50 CPTEG: CPH wurden Nanopartikel mit dimannose zu unterschiedlichen Reaktionszeiten funktionalisiert und die Reaktion wurde bei 4 ° C Der Durchschnitt und Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten Funktionalisierung gezeigt. (B) Laktose-und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikeleffektiv Ziel-DC-SIGN (CIRE, CD209) und Mannose-Rezeptor (CD206) auf das Knochenmark-abstammenden dendritischen Zellen, wie durch die verstärkte Expression dieser beiden Marker nach Stimulation mit funktionalisierten 50:50 CPTEG gezeigt: CPH Nanopartikel, wenn sie mit der Expression verglichen mit nicht-funktionalisierte Partikel.

Diskussion

Die Wirksamkeit von Kohlenhydraten als Targeting-Agenten, um direkte Interaktionen von Nanopartikeln an Immunzellen wurde bereits ^{10, 11} gezeigt. Frühere Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass spezifische Zucker an Polyanhydrid Nanopartikel können verschiedene CLR auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) ausgerichtet sind, wodurch die Aktivierung von Immunzellen, die wichtig sein kann für weitere T-Zell-Aktivierung ^{10, 11.} Um jedoch eine optimale Ausrichtung mehrerer Parameter-wie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalog-Nummer
Xyz: 3x T-LSM050A, 50 mm Stellweg je Achse	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Einzel-Spritzenpumpe	New Era Pump Systems	NE-1000
Pyrex * Vista * Randlose Wiederverwendbare Glas Kultur Tubes	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Technologies
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE Gasdichte Spritzen, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 Sonicator	Qsonica	Q55
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	05-450-127