תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Summary

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

Abstract

גישות Transdisciplinary מעורבים בתחומים כגון עיצוב החומר, ננוטכנולוגיה, כימיה, אימונולוגיה צריך להיות מנוצל באופן רציונלי לעצב יעילים ספקי חיסונים. Nanoparticle מבוססי פלטפורמות יכול להאריך את ההתמדה של אנטיגנים החיסון, אשר יכול לשפר את החיסון immunogenicity ^1. פולימרים מתכלים מספר נחקרו כמו אספקת כלי רכב חיסון ^1, בפרט, חלקיקים polyanhydride הוכיחו את היכולת לספק שחרור מתמשך של אנטיגנים חלבון יציב להפעיל תאים מציגי אנטיגן לווסת את המערכת החיסונית ^2-12.

עיצוב המולקולרי של חיסון אלו נושאות צריך לשלב את הבחירה הרציונלית של תכונות פולימרים, כמו גם שילוב של סוכני מיקוד המתאימים. ייצור תפוקה גבוהה של מיקוד אוטומטי ligands וחלקיקים פונקציונליות הוא כלי רב עוצמה שישפרו את היכולת ללמוד r רחבange נכסים ויוביל בעיצוב של מכשירים משלוח לשחזור החיסון.

תוספת של מיקוד ligands מסוגל להיות מוכר על ידי קולטן ספציפי על תאים של מערכת החיסון הוכח לווסת ואת התגובה החיסונית חייט ^10,11,13 C מסוג קולטנים lectin (CLRs) הם זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) המזהים פחמימות קיים פני השטח של פתוגנים. גירוי של תאים חיסוניים באמצעות CLRs מאפשר הפנמה משופרת של אנטיגן והצגתו לאחר מכן על הפעלה נוספת תא T ^14,15. לכן, מולקולות פחמימות תפקיד חשוב במחקר של התגובה החיסונית, אולם השימוש של ביומולקולות אלה לעיתים קרובות סובל מחוסר זמינות של מבנית מוגדרת היטב ופחמימות טהורות. פלטפורמת אוטומציה מבוסס על פתרון איטרטיבי, שלב התגובות יכול לאפשר סינתזה מהירה ומבוקרת של מולקולות אלה מאתגרים סינטטי שימוש ב נמוך משמעותיתuilding כמויות לחסום יותר מוצק שלב שיטות מסורתיות ^16,17.

במסמך זה אנו מדווחים פרוטוקול לסינתזה פתרון שלב אוטומטית של אוליגוסכרידים כמו מנוז מבוססי ligands מיקוד עם מיצוי מוצק בשלב fluorous לטיהור ביניים. לאחר פיתוח של שיטות אוטומטיות כדי להפוך את הסוכן פחמימות המבוססת על מיקוד, אנו מתארים את דרכי ההתקשרות שלהם על פני השטח של חלקיקים polyanhydride העסקת מערכת רובוטית אוטומטית את ומופעל על ידי LabVIEW כפי שתואר קודם לכן ^10. Functionalization משטח עם פחמימות הראו יעילות מיקוד CLRs ^10,11 והגדלת התפוקה של שיטת ייצור לחשוף את המורכבות הקשורות במערכת רב פרמטרית יהיה בעל ערך רב (איור 1 א).

Protocol

1. תפוקה גבוהה פחמימות סינתזה

1. לפני סינתזה אוטומטית של dimannoside, התורם סוכר מוגן כראוי, בדרך כלל trichloroacetimidate, ו acceptor, בעיקר אלכוהול fluorous alkenyl, מסונתזים על העליונה הספסל.
2. בתוכנית כתוב לסינתזה אוטומטי של dimannoside. ייצוג סכמטי של הליך אוטומטי בסיסי מוצג באיור 2. בתוכנית, הוא הבטיח כי לפני תוספת של האמרגן, תערובת של התורם acceptor הוא עורר דקות לפחות 30.
3. פתרונות של acceptor סינטטי התורם, והוא trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate מתקבלות dichloromethane. טולואן dichloromethane משמשים לרוב לתגובות glycosylation.
4. כמו כן, להכין פתרונות של חומרים כימיים עבור deprotection של קבוצות הגנה זמניים מתנול 80% ו 100% מתנול.
5. לפני תחילת התוכנית, להבטיח כי relatלחות ive בחדר היא 30% או נמוך בתא אוטומציה. לחות גבוהה מזיקה לתגובות glycosylation.
6. לאחר תוכנית כלשהי, תוכנית זרוע רובוטית מעבירה את הפתרונות של התורם acceptor לתוך בקבוקון התגובה ברצף. לאחר מכן התערובת הוא עורר למשך 30 דקות.
7. הבא את הזרוע הרובוטית מעביר 0.2 עד 0.3 ושווי של trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate לתוך התערובת, בדרך כלל בטמפרטורת החדר אך בטמפרטורות נמוכות יותר כמו -20 מעלות צלזיוס ניתן להשיג. תערובת התגובה היא עוררה למשך 30 דקות.
8. אחרי 30 דקות, התגובה היא עצרה aliquot קטן הסיר כדי לפקח על ההתקדמות התגובה. אם לא מלאה, התגובה יכולה להמשיך, ובסופו של דבר את הזמן הנדרש יכול להיות שונה.
9. לאחר התגובה הושלמה, התגובה התערובת מועברת על fluorous מוצקים מיצוי שלב (FSPE) מחסניות המכילות C _{8 F-17} שונה סיליקה ג'ל לטיהור.
10. העגלהרכסים נשטפים 1 בתערובת מתנול, מים 80% (8 מ"ל) להיפטר חלק בלתי fluorous.
11. ואז המחסניות נשטפים עם מתנול 100% כדי להשיג את המוצר fluorous-מתויג הרצוי. אם טיהור נוסף הוא הרצוי, המכונה ניתן פסק המוצר התגובה (ים) להסיר לטיהור באמצעים נוספים.
12. לאחר מחזור טיהור, זרוע רובוטית מחלק methoxide נתרן לתוך בקבוקון התגובה. התגובה היא עוררה עבור שעות 2. אם לא מלאה, התגובה יכולה להיות שוב נמשך תקופה ארוכה יותר, ובסופו של דבר הזמן מתוכנת הנדרש יכול להיות שונה.
13. לאחר השלמת התגובה, המוצר מטוהרים על ידי FSPE וכפופים ואחר כך פירוק של טולואן נטול מים ואחריו אידוי מים כדי להסיר שאריות.
14. לאחר מכן במחזור (מ שלב 6 עד 13) חוזר על עצמו עד אורך השרשרת הרצוי מתקבל עבור המולקולה היעד.
15. המוצר מוגן להשיג אוטומציה היא הen מטוהרים נוסף מאופיין במלואו על ידי טכניקות כגון תהודה מגנטית גרעינית וספקטרוסקופיה (NMR). Deprotection מלאה (הסרה של כל קבוצות הגנה הנותרים) של מולקולת המטרה הסופית הושלמה אז מחוץ פלטפורמת אוטומציה ככלל כי זה בדרך כלל גז מימן פלדיום נפץ. צעד deprotection הסופי בוצע על העליונה הספסל מחוץ פלטפורמת אוטומציה. הצעד הראשון היה ozonolysis של הקשר הכפול תג fluorous ואחריו חמצון אלדהיד המיוצר לחומצה carboxylic. המוצר היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה בעמודה. השלב האחרון היה deprotection של קבוצות האתר בנזיל ידי הידרוגנציה פלדיום catalyzed. המוצר עבר דרך celite משטח להיפטר פלדיום לקבל את המוצר הסופי טהור.

2. תפוקה גבוהה משטח Nanoparticle functionalization

1. תפוקה גבוהה סינתזה פולימר ייצור nanoparticle מתבצעת בעקבות יחסי ציבור באותוotocol ו רובוטית להגדיר שתואר על ידי פטרסון ואח' ^19. מערכות קופולימר המשמשים ייצור החלקיקים מבוססים על חומצה sebacic (SA) ו - 1,6-bis (para-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), ו 1,8-bis ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) ו CPH. ייצוג סכמטי של המנגנון בתצהיר רובוטית מנוצל מוצג באיור 1 ב.
2. בעקבות ייצור nanoparticle, בעל המכיל צינורות עם הספרייה nanoparticle הוא לחבר מחדש לשלב מפעיל ליניארי.
3. על הקשר של פחמימות לפני השטח של חלקיקי polyanhydride, אמין, carboxylic צימוד חומצה תגובה ²⁰ המורכב משתי תגובות רצופות מתבצע.
4. על התגובה הראשונה, את המזרק משאבת מזרק 1 לתכנות מלא (10 ושווי eq.) (שווי של ריכוז חומצת טוחנת הממוצע carboxylic על פני החלקיקים) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-CArbodiimide hydrochloride (EDC) ו 10 EQ. של ethylenediamine בתמיסה מימית, בעוד את המזרק משאבת מזרק 2 לתכנות טעון עם EQ 12. של N-hydroxysuccinimide (NHS) בתמיסה מימית.
5. באמצעות תוכנת LabVIEW, המתלים מגיב אף הם לזכות * הספרייה nanoparticle.
6. לאחר מכן, כל דגימה היא sonicated (30 של הרץ 40) ובעל צינורית מנותקת פלטפורמה רובוטית.
7. המתלים nanoparticle מודגרת במשך 9 ** H עם סיבוב קבוע על 4 ° C.
8. אחרי זמן תגובה הושלמה, צינורות centrifuged (12,000 XG דקות 5) וחזרה לתחנת רובוטית לבצע שני צעדים כביסה.
9. לכביסה, מזרק נשאר ריק טעון משאבת מזרק 1 לתכנות תוך המזרק משאבת מזרק 2 מלא מים קרים. Supernatant בצינור כל אחד מכונס בתוך מזרק ריק הפקדונות משאבת השנייה במים קרים.
10. Homogenization של ננוההשעיה החלקיקים מתבצע כמתואר על צעד 2.6. צינורות centrifuged מכן (12,000 XG דקות 5), צעד לשטוף 2 מבוצעת כמתואר על צעד 2.9.
11. לתגובה 2, שני צעדים בתצהיר משמשים. בשלב בתצהיר הראשון, 12 EQ. EDC של נטענים עם משאבה אחת 12 EQ. שירותי הבריאות של נטענים עם המשאבה 2.
12. צעד בתצהיר 2 כולל 10 EQ. של saccharide ספציפי על המשאבות הראשון והשני (כלומר, גלקטוז, לקטוז או di-מנוז) *** ואת משאבת 3 עם EQ 10. של חומצה גליקולית (משמש השליטה ****).
13. המתלים nanoparticle הוא נאחד את כמתואר על הצעד 2.6 ו מודגרות עבור H 9 עם סיבוב קבוע על 4 ° C.
14. לאחר זמן התגובה הושלמה, צעד לשטוף מבוצעת כמתואר 2.8 צעדים, 2.9 ו 2.10.
15. הספרייה nanoparticle פונקציונליות ממוקם מכן בתא ואקום להתייבש במשך שעה לפחות 2.
16. חלקיקים פונקציונליות הם אז האופיציון תקן של ספקטרוסקופיה רנטגן Photoelectron ו assay גבוהה התפוקה פנול, חומצה גופרתית כדי לקבוע את הרכב פני השטח וריכוז saccharide בהתאמה. מיקרוסקופיית אלקטרונים פיזור אור דינאמי מנוצלים כדי לקבוע גודל החלקיקים, התפלגות גודל, ולחייב פני השטח.

הערות: * כרכים הפקדת להשתנות עם המסה של חלקיקים המצויים צינור אחד.
ראה הערה זמני התגובה עבור תגובות הראשון והשני ניתן לשנות כדי להתאים את ריכוז saccharide הסופי.
*** כל saccharide מופקד לתוך מבחנות, תלוי הקבוצה הרצויה.
**** לתגובה ספציפית מועסקים במחקר זה על החיבור של פחמימות, חומצה גליקולית משמש פקד מקשר מאז saccharides deprotected כבר יש את המולקולה קשורה קוולנטית, המאפשרת התקשרות נוספת אל פני השטח nanoparticle.

3. נציג תוצאות

פולdimannoside LY מוגן שמוצג באיור 2 היה מסונתז באמצעות פלטפורמת אוטומציה. מתחם מסונתז התאפיין ¹ H NMR ב ספקטרומטר 400 MHz VXR באמצעות CDCl ₃ ממס. ספקטרום NMR מוצגת באיור 3.

ניצול ייצור תפוקה גבוהה nanoparticle ו functionalization של polyanhydride חלקיקים המתואר כאן, מצורף של dimannose, לקטוז וגלקטוז בוצע בהצלחה ^{10, 11.} באמצעות הגדרת, התנאים התגובה אופטימליים (כלומר, טמפרטורת התגובה וזמן) זוהו להשיג functionalization nanoparticle הרצוי ומורפולוגיה. כאשר התגובה בוצעה על 4 מעלות צלזיוס במקום בטמפרטורת החדר, הפחתת הצטברות nanoparticle נצפתה על ידי SEM (מידע לא מוצג). טבלה 1 מציגה תוצאות נציג של אפיון של CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH גם עם DI-מנוז אולקטוז, מסונתז על 4 ° C. הנתונים מצביעים על עלייה קטנה בקוטר nanoparticle הממוצע בשל functionalization. בעוד הלא פונקציונליות חלקיקים היה פוטנציאל שלילי של כ zeta. -20 MV, חלקיקים פונקציונליות הראה ערך חיובי זיטה פוטנציאל, הוכחת functionalization מוצלח של nanoparticle פני השטח. לקטוז DI-מנוז הן סוכרים נייטרליות, אולם קבוצות האמין חינם של אתילן diamine מקשר מנוצל כדי לצרף את saccharides עשוי להיות אחראי פוטנציאל זטה חיובית.

זמן התגובה הוא משתנה נוסף שיכול להשפיע הן על מורפולוגיה הסופי של חלקיקים ואת מידת הקשר סוכר מושגת. על ידי התאמת זמן תגובה, ריכוז הסוכר הסופי מחובר אל פני השטח חלקיקים יכול להיות נשלט, כפי שמוצג באיור 4 א. כצפוי, ריכוז dimannose על פני השטח של 50:50 CPTEG: CPH חלקיקים מוגברת עםהזמן הכולל של התגובה והגיע לכל היותר אחרי שעה 18. חלקיקים פונקציונליות עם הזמן 24 שעות התגובה הכולל שימשו להעריך את יכולתם למקד CLRs על העכבר מח עצם תאים דנדריטים הנגזרים (DCS). Cytometry זרימת שימש כדי להעריך את הביטוי של שני קולטנים Cl (כלומר, CIRE (CD209, DC-סימן) ו הקולטן מנוז (CD206)) לאחר גירוי עם הלא פונקציונליות, ו לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות (איור 4B). ביטוי גבוה יותר של קולטנים הצדדים, אשר מעידים על מיקוד יעיל, הושג כאשר תאים היו מגורה עם שני לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות. עם זאת, די, מנוז, פונקציונליות חלקיקים הראו רמה גבוהה יותר של ביטוי המציין הספציפיות של ליגנד זה הקולטנים שהיו הנלמדים.

Nanoparticle סוג	חלקיקים בקוטר ממוצע (ננומטר)	שד 'זעם החלקיקים ζ-פוטנציאל (mV)
ללא פונקציונליות	162 ± 43	-20 ± 0.6
לקטוז	235 ± 34	26 ± 2.4
Di-מנוז	243 ± 32	30 ± 4.2

טבלה 1. אפיון Nanoparticle. ללא פונקציונליות לבין פונקציונליות התאפיינו פיזור אור אלסטי מעין ומדידות זטא פוטנציאליים. גודל החלקיקים הנתונים מייצגים את הערך הממוצע ± סטיית תקן (SD) של נתונים דינמיים פיזור האור שנאספו שלושה ניסויים בלתי תלויים. נתונים זטא פוטנציאליים מייצגים ערך ממוצע ± סטיית תקן של שלוש קריאות עצמאיים. שינוי סימן של פוטנציאל זטה מוכיח כי הסוכר היה מצומדות ביעילות CPTEG 50:50: משטח nanoparticle CPH.

= "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
איור 1 (א) ייצוג גרפי של גישה רדף עם functionalization פחמימות של חלקיקים polyanhydride ודוגמה של ספריות nanoparticle פונקציונליות שיכול להיות מתוכנן עם גישה תפוקה גבוהה תיאר. (ב) ייצוג סכמטי של המנגנון האוטומטי בתצהיר ישמש functionalization החלקיקים, אשר מורכב (אני) שלושה NE 1000 משאבות, (ב) שלב רובוטית משולב על ידי שני מפעילים (Zaber): אחד עבור תנועה בכיוון x והשני תנועה בכיוון y: (ג) שלב 2 רובוטית עם שני מדפים סמוכים (מתאים צינורות cuvettes) בהרכב של שלושה מפעילים, אחד לכל כיוון (X, Y ו-Z). המשאבות, בסך הכל חמישה מפעילים מחוברים בסדרה. מפעילים משאבות מופעלות על ידי מחשב באמצעות תוכנת LabVIEW. בתרשים זה לא קנה מידה.arge.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. ייצוג גרפי של אוטומטי חוזר ונשנה סינתזה של פחמימות באמצעות מנוז כדוגמה.

איור 3. ¹ H NMR של dimannoside מוגן.

איור 4. () השפעת זמן התגובה על ריכוז nanoparticle פני השטח של saccharide. את הנתונים המוצגים, 50:50 CPTEG: חלקיקים CPH היו פונקציונליות עם dimannose לפעמים תגובה אחרת והתגובה בוצע ב 4 ° C. השגיאה הממוצע ורמת בשני ניסויים בלתי תלויים functionalization מוצג. (ב) לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליותלמעשה היעד הקולטן DC-סימן (CIRE, CD209) ו מנוז (CD206) על מח עצם שמקורם תאים דנדריטים כפי שתואר על ידי ביטוי מוגבר של שני סמנים לאחר גירוי עם CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH בהשוואה הביטוי המתקבל עם הלא פונקציונליות חלקיקים.

Discussion

היעילות של פחמימות כמו מיקוד סוכנים אינטראקציות nanoparticle ישירות לתאי מערכת החיסון הוכח בעבר ^{10, 11.} מחקר קודם במעבדות שלנו הראו כי סוכרים ספציפיים המחוברים חלקיקים polyanhydride מסוגלים למקד CLRs שונים על תאים מציגי אנטיגן (נגמ"שים), ובכך משפרים את ההפעלה של תאים חיסוניי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	מספר קטלוגי
ממונע שלב XYZ: 3x T-LSM050A, 50 מ"מ נסיעות לכל ציר	Zaber טכנולוגיות	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 משאבת מזרק יחיד	חדשות משאבה עידן מערכות	NE-1000
פיירקס * Quick Vista * לשימוש חוזר ללא מסגרת צינורות זכוכית תרבות	קורנינג	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed טכנולוגיות
LabVIEW	לאומי מכשירים	776671-35
SGE גז מזרקים צמודים, Luer לוק	סיגמא אולדריץ'	509507
XL-2000 Sonicator	Qsonica	Q55
מיני צינור מסובבי	פישר סיינטיפיק	05-450-127