De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Resumen

En este artículo, un método de alto rendimiento se presenta para la síntesis de oligosacáridos y su fijación a la superficie de las nanopartículas polianhídrido para su uso posterior en la orientación de receptores específicos en las células presentadoras de antígenos.

Resumen

Enfoques transdisciplinarios que involucran áreas como el diseño de materiales, la nanotecnología, la química y la inmunología que se utilizarán para diseñar racionalmente los transportistas vacunas eficaces. Basados ​​en nanopartículas plataformas puede prolongar la persistencia de los antígenos de la vacuna, lo que podría mejorar la vacuna contra la inmunogenicidad ^1. Varios polímeros biodegradables se han estudiado como vehículos de entrega de vacunas ^1; en particular, las partículas de polianhídrido han demostrado la capacidad para proporcionar una liberación sostenida de antígenos proteicos estables y para activar las células presentadoras de antígenos y modular la respuesta inmune ^2-12.

El diseño molecular de estos portadores de vacunas necesita para integrar la selección racional de las propiedades del polímero, así como la incorporación de agentes adecuados de focalización. De fabricación de alto rendimiento automatizado de los ligandos y partículas funcionalizadas es una potente herramienta que aumentará la capacidad para estudiar una amplia range de las propiedades y se traducirá en el diseño de dispositivos de administración de vacunas reproducibles.

La adición de ligandos capaces de ser reconocida por receptores específicos en las células del sistema inmune se ha demostrado que modulan la respuesta inmune y adaptar ^10,11,13 C-receptores de tipo lectina (CLR) son los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que reconocen los hidratos de carbono presentes en el superficie de patógenos. La estimulación de células inmunes a través de CLR permite la internalización mejorada de antígeno y posterior presentación para la activación de células T más ^14,15. Por lo tanto, las moléculas de hidratos de carbono juegan un papel importante en el estudio de las respuestas inmunes, sin embargo, el uso de estas biomoléculas menudo sufre de la falta de disponibilidad de estructuralmente bien definidos y los hidratos de carbono puro. Una plataforma de automatización basada en un proceso iterativo fase de solución reacciones pueden permitir la síntesis rápida y controlada de estas moléculas sintéticamente desafiantes con b significativamente menoronstruyendo cantidades de bloques que los tradicionales métodos en fase sólida ^16,17.

Aquí nos presenta un protocolo para la solución automatizada de la síntesis en fase de oligosacáridos como la manosa-basados ​​en ligandos con fluorosa extracción en fase sólida para la purificación intermedia. Después del desarrollo de métodos automatizados para hacer que el agente de carbohidratos selección de base, se describen métodos para su fijación en la superficie de polianhídrido nanopartículas empleando un conjunto robótico automatizado hasta operado por LabVIEW como se ha descrito previamente ^10. Funcionalización de superficies con los hidratos de carbono ha demostrado su eficacia en la orientación CLR ^10,11 y aumentar el rendimiento del método de fabricación para descubrir las complejidades asociadas con un sistema multi-paramétrico será de gran valor (Figura 1a).

Protocolo

1. Hidratos de carbono de alto rendimiento Síntesis

1. Antes de la síntesis automatizada de dimannoside, un donante de azúcar adecuadamente protegido, tricloroacetimidato típicamente, y aceptor, principalmente un alcohol fluorosa alquenilo, se sintetizan en el banco superior.
2. Un programa está escrito para la síntesis automatizada de dimannoside. Una representación esquemática del procedimiento automatizado de base se presenta en la Figura 2. En el programa, se asegura que antes de la adición del promotor, la mezcla de donante y aceptor se agita durante al menos 30 minutos.
3. Soluciones del donante sintético aceptor, y trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate se hacen en diclorometano. El tolueno y el diclorometano se utilizan con mayor frecuencia para las reacciones de glicosilación.
4. También, preparar soluciones de reactivos para la desprotección de los grupos protectores temporales en 80% de metanol y 100% de metanol.
5. Antes del comienzo del programa, asegurar que la relaive la humedad en la habitación es de 30% o inferior en la cámara de la automatización. La alta humedad es perjudicial para las reacciones de glicosilación.
6. Una vez que se inicia el programa, el brazo robótico transfiere las soluciones de donante y aceptor en el vial de reacción secuencial. Luego la mezcla se agitó durante 30 min.
7. A continuación, el brazo robótico transfiere 0,2 a 0,3 equivalentes de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate en la mezcla, típicamente a temperatura ambiente, aunque las temperaturas más bajas como -20 ° C puede ser alcanzado. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min.
8. Después de 30 minutos, la reacción se detuvo y una pequeña alícuota eliminado para vigilar el progreso de la reacción. Si no está completa, la reacción puede ser seguido y, finalmente, el tiempo requerido puede ser modificado.
9. Una vez que se completa la reacción, la mezcla de reacción se transfiere a los fluorosa extracción en fase sólida (FSPE) cartuchos que contienen C ₈ F _{17-modificado} gel de sílice para su purificación.
10. El carrocrestas se lava primero con un 80% de metanol-agua mezcla (8 ml) para deshacerse de la fracción no fluorosa.
11. A continuación, los cartuchos se lavó con 100% de metanol para obtener el producto deseado fluorosa-etiquetados. Si purificación adicional se desea, la máquina puede ser parado y el producto de reacción (s) que se retiró para la purificación por medios adicionales.
12. Después del ciclo de purificación, el brazo robótico dispensa metóxido sódico en el vial de reacción. La reacción se agitó durante 2 h. Si no está completa, la reacción puede ser de nuevo continuó durante un período más largo y, finalmente, el tiempo programado requiere puede ser modificada.
13. Después de la terminación de la reacción, el producto se purifica por FSPE y después se somete a la disolución en tolueno anhidro, seguido por evaporación para eliminar el agua residual.
14. A continuación, el ciclo (de la etapa 6 a 13) se repite hasta que la longitud de cadena deseada se obtiene para la molécula diana.
15. El producto protegido, obtenido a partir de la automatización es ºes purificado y caracterizado completamente mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear (RMN). Desprotección completa (eliminación de todos los grupos protectores restantes) de la molécula objetivo final se completa entonces fuera de la plataforma de automatización como una regla, ya que generalmente implica el gas de hidrógeno explosivo y el paladio. La etapa de desprotección final se llevó a cabo en banco superior fuera de la plataforma de automatización. El primer paso fue ozonolisis del doble enlace en la etiqueta fluorosa seguido por oxidación del aldehído producido a un ácido carboxílico. El producto se purificó por cromatografía en columna. El paso final fue la desprotección de grupos éter de bencilo por hidrogenación catalizada con paladio. El producto se pasa a través de celita almohadilla para deshacerse de paladio para obtener producto final puro.

2. De alto rendimiento funcionalización superficial de nanopartículas

1. De alto rendimiento de síntesis de polímeros y la fabricación de nanopartículas se lleva a cabo siguiendo el mismo protocol y robótica configurar descrito por Petersen et al ^19. Los sistemas de copolímero utilizado para la fabricación de partículas se basa en el ácido sebácico (SA) y 1,6-bis (para-carboxifenoxi) hexano (LPA), y 1,8-bis-( para-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) y CPH. Una representación esquemática del aparato de deposición robótica utilizada se presenta en la Figura 1b.
2. Después de la fabricación de nanopartículas, el soporte que contiene los tubos con la biblioteca de nanopartículas se vuelve a unir a la etapa de actuador lineal.
3. Para la fijación de hidratos de carbono a la superficie de las partículas de polianhídrido, una reacción ácido amino-carboxílico acoplamiento ²⁰ que consta de dos reacciones consecutivas se lleva a cabo.
4. Para la primera reacción, la jeringa en la bomba de jeringa programable primero se llena con 10 equivalentes (Ec.) (equivalentes de media concentración molar de ácido carboxílico en la superficie de las partículas) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-bisrbodiimide clorhidrato (EDC) y la ecuación 10. de etilendiamina en una solución acuosa, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa programable segundo está cargado con 12 eq. de N-hidroxisuccinimida (NHS) en solución acuosa.
5. Con el programa LabVIEW, las suspensiones de reactivos son depositados en la biblioteca de * nanopartículas.
6. A continuación, cada muestra se sometió a sonicación (30 s en 40 Hz) y el soporte del tubo está separado de la plataforma robótica.
7. Suspensiones de nanopartículas se incuban durante 9 h ** con rotación constante a 4 ° C.
8. Después del tiempo de reacción se ha completado, los tubos se centrifugaron (12.000 xg durante 5 min) y devuelto a la estación de robótica para realizar dos etapas de lavado.
9. Para el lavado, una jeringa queda vacío y cargado en la bomba de jeringa programable primero, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa segundo se llena con agua fría. El sobrenadante de cada tubo se retira la jeringa vacía y los depósitos de la bomba segundo de agua fría.
10. Homogeneización de los nanosuspensión de partículas se realizó como se describió en el paso 2,6. Los tubos se centrifugan (12000 xg durante 5 min) y una segunda etapa de lavado se realizó como se describió en el paso 2,9.
11. Para la segunda reacción, dos etapas de deposición se utilizan. En la primera fase de depósito, 12 eq. de EDC se cargan con una bomba y eq 12. NHS de se cargan con la segunda bomba.
12. La segunda fase de depósito incluye 10 eq. de un sacárido específica sobre las bombas primera y segunda (es decir, galactosa, lactosa o di manosa-) *** y una tercera bomba con 10 eq. de ácido glicólico (utilizado como control ****).
13. Las suspensiones de nanopartículas se homogeneizó como se describe en el paso 2,6 y se incubaron durante 9 horas con rotación constante a 4 ° C.
14. Después del tiempo de reacción se ha completado, una etapa de lavado se realiza como se describe en los pasos 2.8, 2.9 y 2.10.
15. La biblioteca de nanopartículas funcionalizado se coloca entonces en una cámara de vacío para secar durante al menos 2 horas.
16. Las nanopartículas funcionalizadas son entonces de carácterzado por espectroscopía de rayos X de fotoelectrones y un alto rendimiento de fenol-sulfúrico ensayo del ácido para determinar la composición de la superficie y la concentración del sacárido respectivamente. Microscopía electrónica de barrido y dispersión dinámica de luz se utilizan para determinar el tamaño de partícula, distribución de tamaño, y la carga superficial.

Notas: * Los volúmenes de deposición varía con la masa de nanopartículas contenidas en cada tubo.
Veces ** de reacción para las reacciones primera y segunda se puede cambiar para ajustar la concentración de sacárido final.
*** Cada sacárido se deposita en tubos de ensayo en función del grupo que desee.
**** Para la reacción específica empleada en este estudio para la unión de los hidratos de carbono, ácido glicólico se utiliza como un control de enlazador desde sacáridos desprotegidos ya tienen esta molécula unida covalentemente, que permite una unión más a la superficie de las nanopartículas.

3. Los resultados representativos

El útildimannoside ly protegido se muestra en la Figura 2 se sintetizó utilizando la plataforma de automatización. El compuesto sintetizado se caracterizó por ¹ H RMN en un espectrómetro VXR 400 MHz usando CDCl $ ₃ como disolvente. El espectro de RMN se muestra en la Figura 3.

Utilizando la fabricación de nanopartículas de alto rendimiento y funcionalización de nanopartículas polianhídrido se describe aquí, la unión de lactosa dimannose, y galactosa se ​​ha llevado a cabo con éxito ^{10, 11.} Utilizando esta configuración, las condiciones óptimas de reacción (es decir, temperatura de reacción y el tiempo) se identificaron para lograr funcionalización deseada nanopartículas y morfología. Cuando la reacción se llevó a cabo a 4 ° C en lugar de la temperatura ambiente, una reducción en la agregación de nanopartículas se observó por SEM (datos no presentados). La Tabla 1 muestra los resultados representativos de la caracterización de CPTEG 50:50 funcionalizado CPH: nanopartículas, ya sea con di-manosa olactosa, sintetizado a 4 ° C. Los datos indican un pequeño aumento en el diámetro promedio de nanopartículas, debido a la funcionalización. Mientras que las nanopartículas no funcionalizados tenía un potencial zeta negativo de aprox. -20 MV, las partículas funcionalizadas mostró un valor positivo del potencial zeta, lo que demuestra el éxito de la funcionalización de la superficie de las nanopartículas. La lactosa y di-manosa son azúcares neutros, sin embargo, los grupos amina libres de la etilendiamina enlazador utilizados para unir los sacáridos pueden ser responsables de la potencial zeta positivo.

El tiempo de reacción es otra variable que podría afectar tanto a la morfología final de las nanopartículas y el grado de unión del azúcar alcanzado. Al ajustar el tiempo de reacción, la concentración final de azúcar unido a la superficie nanopartículas pueden controlarse como se muestra en la Figura 4A. Como se esperaba, la concentración de dimannose en la superficie de 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas aumentó conel tiempo total de reacción y alcanzó un máximo después de 18 h. Las nanopartículas funcionalizadas con el tiempo de reacción total de 24 horas se utilizaron para evaluar la posibilidad de dirigir CLR en el mouse de la médula ósea derivados de las células dendríticas (DC). La citometría de flujo se utilizó para evaluar la expresión de dos receptores CL (es decir, CIRE (CD209, la DC-SIGN) y el receptor de manosa (CD206)) después de la estimulación con no funcionalizado, y la lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizadas (Figura 4B). Una mayor expresión de ambos receptores, que es un indicativo de focalización eficaz, se obtuvo cuando las células se estimularon con ambos lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizados. Sin embargo, di-manosa-funcionalizados partículas mostraron un mayor nivel de expresión que indica una especificidad de este ligando para los receptores que se estudiaron.

Nanopartículas de tipo	Diámetro medio de partícula (nm)	Avenidala rabia de partículas ζ-potencial (mV)
No funcionalizado	162 ± 43	-20 ± 0,6
Lactosa	235 ± 34	26 ± 2,4
Di-manosa	243 ± 32	30 ± 4,2

Tabla 1. Caracterización de las nanopartículas. No funcionalizado y funcionalizado se caracteriza por la dispersión de luz cuasi-elástica y las mediciones de potencial zeta. Los datos del tamaño de partícula representan el valor medio ± desviación estándar (DE) de la dinámica de los datos de dispersión de luz obtenidos en tres experimentos independientes. Datos de potencial zeta representan el valor medio ± desviación estándar de tres mediciones independientes. Cambio en el signo del potencial zeta demuestra que el azúcar era eficiente conjugado con el CPTEG 50:50: superficie de las nanopartículas CPH.

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Figura 1. (A) Representación gráfica de la aproximación a cabo con la funcionalización de las nanopartículas de hidratos de carbono polianhídrido y un ejemplo de las bibliotecas de nanopartículas funcionalizadas que podrían ser diseñadas con el descrito enfoque de alto rendimiento. (B) Representación esquemática del aparato de deposición automatizado utilizado para funcionalización de partículas, que consiste en (i) tres NE 1000 bombas, (ii) una etapa robótico integrado por dos actuadores (Zaber): uno para el movimiento en la dirección x, y el otro para el movimiento en la dirección y, (iii) una segunda etapa robótico con dos bastidores adyacentes (apropiado para tubos y cubetas) que consta de tres actuadores, uno para cada dirección (x, y, z). Las bombas y un total de cinco actuadores están conectados en serie. Los actuadores y bombas son accionadas por un ordenador utilizando el software LabVIEW. Este diagrama no está a escala.arge.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.

Figura 2. Representación gráfica de la automatizado iterativo síntesis de hidratos de carbono utilizando manosa como un ejemplo.

Figura 3. ¹ H RMN de la dimannoside protegido.

Figura 4 (A). Efecto del tiempo de reacción sobre la concentración de nanopartículas superficie de sacárido. En los datos mostrados, 50:50 CPTEG: nanopartículas CPH se funcionalizado con dimannose a diferentes tiempos de reacción y la reacción se llevó a cabo a 4 ° C. El error medio y estándar de dos experimentos independientes de funcionalización se muestra. (B) a la lactosa y la di-manosa funcionalizados nanopartículasefectivamente objetivo de la DC-SIGN (CIRE, CD209) y manosa receptor (CD206) en la médula ósea procedentes de células dendríticas como lo demuestra el aumento de expresión de estos dos marcadores tras la estimulación con CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas de CPH, en comparación con la expresión obtenida no funcionalizados con partículas.

Discusión

La eficacia de los hidratos de carbono como agentes dirigidos a las interacciones de nanopartículas directos a las células inmunes se ha demostrado anteriormente ^{10, 11.} Investigaciones previas en nuestros laboratorios han mostrado que los azúcares específicos a los que las nanopartículas polianhídrido son capaces de dirigir CLR diferentes en las células presentadoras de antígeno (APC), mejorando así la activación de células inmunes, que puede ser importante para la posterior activación de las cé...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Motorizada XYZ Etapa: 3x T-LSM050A, 50 mm de recorrido por eje	Zaber Tecnologías	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 bomba de jeringa individual	Nuevos sistemas de la Era de la bomba	NE-1000
Pyrex * Vista * Al Aire Tubos de vidrio reutilizables Cultura	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Tecnologías
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE Tight Gas Jeringas, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 Sonicator	Qsonica	Q55
Mini-tubo rotador	Fisher Scientific	05-450-127