توصيف الآليات الجزيئية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الأشعة فوق البنفسجية المستحثة الساد

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ساد هو السبب الرئيسي للعمى في العالم. الطاقة الشمسية الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) هو عامل الخطر الرئيسي للتنمية الساد. تم تطوير نموذج حيواني من الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها حتى الساد-B. في هذه المادة ونحن تصف أساليب التحقيق في تشكيل الساد: التعرض ل، الأشعة فوق البنفسجية الكمية RT-PCR والمناعية.

Abstract

ساد هو السبب الرئيسي للعمى في العالم ^1. وتعرف منظمة الصحة العالمية الساد كما تغيم عدسة العين مما يعوق نقل الضوء. ساد هو مرض متعدد مضروب المرتبطة والسكري الإشعاع، والتدخين فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، والكحول، والإشعاع المؤين، والمنشطات وارتفاع ضغط الدم. هناك أدلة قوية التجريبية ^2-4 والوبائية للأشعة فوق البنفسجية يتسبب ^5،6 التي الساد. وضعنا نموذج حيواني لالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية B في كل من الساد ⁷ تخدير الحيوانات وغير تخدير ^8.

العلاج الوحيد للساد هو عملية جراحية ولكن هذا العلاج ليس في متناول الجميع. وتشير التقديرات إلى أن التأخير لبداية ساد لمدة 10 سنوات يمكن أن تقلل من الحاجة إلى جراحة الساد بنسبة 50٪ ^9. لتأخير حدوث المياه الزرقاء في العين، وهناك حاجة لفهم آليات تشكيل الساد والوقاية تجد فعالة STRATegies. بين آليات التنمية الساد، موت الخلايا المبرمج يلعب دورا حاسما في بدء الساد في البشر والحيوانات ^10. ولقد انصب اهتمامنا في الآونة الأخيرة موت الخلايا المبرمج في عدسة كآلية للتنمية الساد ^8،11،12. من المتوقع أن التوصل إلى فهم أفضل لتأثير الأشعة فوق البنفسجية على مسار موت الخلايا المبرمج سوف توفر إمكانيات اكتشاف أدوية جديدة لمنع إعتام عدسة العين.

في هذه المقالة، ونحن تصف كيفية الساد يمكن أن يتسبب في التعرض تجريبيا من الجسم الحي للأشعة فوق البنفسجية-B. يتم عرض مزيد RT-PCR والمناعية كأدوات لدراسة الآليات الجزيئية للأشعة فوق البنفسجية من الساد الناجم-B.

Protocol

1. التعرض للأشعة فوق البنفسجية

15 دقيقة قبل التعرض، تخدير الأنثى سبراغ داولي الفئران بمزيج من 90 ملغ / كغ Ketalar (الكيتامين) و 10 ملغ / كغ Rompun (زيلازين) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
وضع الحيوانات في restrainer الفئران وتشديد الأحزمة حتى تجميد الفئران دون التسبب في أزمة الجذع ^13.
غرس Mydriacyl (تروبيكاميد)، 10 ملغ / مل، في كلتا العينين من الفئران للحث على توسيع حدقة العين.
وضع الحيوان بحيث يتم وضع ذلك عين واحدة ضد حزمة ضيقة من الأشعة فوق البنفسجية في 300 نانومتر ¹⁴ مع عرض 10 نانومتر كامل في نصف الحد الأقصى وحماية العين المقابل مع شريط أسود.
كشف الفئران من جانب واحد دون العتبة جرعة 1 كج / م ² للأشعة فوق البنفسجية-B في 300 نانومتر لمدة 15 ¹⁵ دقيقة.

2. تشريح

بعد آخر محدد مسبقا الفاصلة التعرض (1، 5، 24 و ساعة 120)، التضحية الفئران لمدة ستة أسابيع من العمر (الوزن <200 غ) من كاربون الاختناق وثاني أكسيد خلع في فقرات عنق الرحم.
استأصل العينين. بعد ذلك، وضع القرنية العين إلى أسفل، حتى الجانب الخلفي. ثم، لكمة ثقب الحد الأدنى من خلال تطبيق مقياس قنية 27 و دفع عرضية إلى الصلبة لتجنب إتلاف العدسة التي هي قريبة جدا من الصلبة. ثم استخدم مقصا لقطع جراحات العيون محيطي خلف حوف حتى يمكن رفع الجزء الخلفي من خارج الصلبة. ثم، رفع العدسة مع ملقط منحني حادة.
إزالة بقايا الجسم الهدبي من خط الاستواء تحت المجهر عدسة، والحفاظ على العدسة في محلول ملحي متوازن لم يعد من 5-10 دقيقة.

3. RT-PCR الكمي

وضع العدسة في مزيج من 350 ميكرولتر العازلة تحلل RA1 (RNA NucleoSpin II مجموع RNA العزلة طقم) و 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول في أنبوب إيبندورف 2 مل.
تبقي العدسة في هذا المزيج خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
التجانس مع العدسةويترك حتى إبرة النواة الصلبة فقط للعدسة من عدسة (والقشرة هي lysed وكبسولة للعدسة في المخزن المؤقت تحلل). إزالة النواة من هذا المزيج.
عينات متجر على الفور في -70 ° C.
ذوبان الجليد العينات واتباع البروتوكول "تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا والأنسجة مثقف" (RNA NucleoSpin II مجموع RNA العزلة عدة).
متجر عينات الحمض النووي الريبي في -70 ° C.
للتحقق من إزالة كافية من الحمض النووي من كل عينة، تشغيل PCR وفقا للشروط التالية (الخطوة 1: 95 ° C لمدة 2 دقيقة، الخطوة 2 لمدة 40 دورات: 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 ° C لمدة 20 ثانية؛ الخطوة 3: 72 ° C لمدة 7 دقائق) مع الاشعال DNA P53 محددة، إلى الأمام 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 "وعكس 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3 'طق بوليميريز وDNA (dNTPack)، وفقا لتصنيع البروتوكول. المنتج PCR المتوقعة هي أزواج قاعدة 243.
تشغيل هلام الاغاروز 1.5٪ الكهربائي للكشف عن الحمض النووي PCR المنتج محددة من أزواج قاعدة 243. لإعداد1.5٪ الاغاروز هلام العازلة في اتخاذ TBE 3،75 غرام من الاغاروز وحلها في 250 مل من TBE العازلة. إضافة بروميد إيثيديوم (0.5 ملغ / مل) 500 ميكرولتر في 500 مل من محلول 1.5٪ هلام الاغاروز. تسخين الخليط في الميكروويف أوين ويقلب لحل الاغاروز.

أي من العينات أن تكشف أي DNA محددة منتجات PCR على 1.5٪ الكهربائي للهلام الاغاروز.

قياس تركيز عينات الحمض النووي الريبي (1 ميكرولتر) ونسبة امتصاص العينة في 260 نانومتر (RNA) و 280 نانومتر (البروتين) في الطيف ND-1000 NanoDrop. إذا كان البروتين RNA نسبة لعينة من الحمض النووي الريبي الامتصاصية هو 2.0 أو أكثر ثم عينة الحمض النووي الريبي هو محض. إذا كانت نسبة الامتصاص عينة الحمض النووي الريبي هو أقل من 2.0، إعادة RNA خطوة تنقية 3.5.
اتخاذ حجم العينة RNA الموافق 1 ميكروغرام وتوليف [كدنا] ستراند بعد بروتوكول ^ST 1 التوليف [كدنا] كيت (1 ^شارع ستراند التوليف [كدنا] كيت RT-PCR ل).
تخزين العينات في -20 درجة [كدنا] C(لمدة 1 و سنوات أخرى، المحل في -70 درجة مئوية).
تشغيل الكمي في الوقت الحقيقي PCR على MyiQ iCycler واحدة لون نظام الوقت الحقيقي الكشف PCR. تحميل ثلاث مكرارت على لوحة 96-بشكل جيد مع نموذج 1 ميكرولتر [كدنا]، TaqMan التعبير الجيني ماجستير ميكس، TaqMan الفحص التعبير الجيني لكاسباس 3، وفقا لتعليمات تصنيع. تحميل ثلاث مكرارت على آخر لوحة 96-بشكل جيد مع نموذج 1 ميكرولتر [كدنا]، TaqMan التعبير الجيني ماجستير ميكس، TaqMan الفحص التعبير الجيني ل18S، وفقا لتعليمات تصنيع (TaqMan الفحص الجيني التعبير البروتوكول). تمييع في سلسلة جزء من [كدنا] من ثلاث عدسات غير مكشوفة اختيارها عشوائيا. تشغيل التخفيفات المسلسل مع [كدنا] من عينات في لوحة 96-أيضا.
استخدام الأسلوب الكمي لمعيار منحنى النتائج. يتم استخدام عدد من الدورات في مضان عتبة كما القياس في برامج MyiQ. A منحنى القياسية التعبير عن عدد من الدورات في عتبة وظيفة التركيز النسبي للتدريج هو EStablished لالتخفيفات المسلسل في كل لوحة. وقد استخدم [كدنا] من ثلاث عينات غير المعالجة لعدسة المعايرة. ربط عدد من الدورات عتبة لكل عينة لمنحنى القياسية للحصول على التركيز النسبي للعينة [كدنا] قياس. وأخيرا، والحصول على مستوى التعبير عن الجينات المستهدفة عن طريق ربط تركيز النسبية للهدف [كدنا] إلى [كدنا] 18S الرقابة الداخلية.

4. المناعى تلوين

تثبيت
1. تشريح العين في PBS (الفوسفات مخزنة المالحة؛ درجة الحموضة 7.4).
2. وضع العين في أنبوب مملوء بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الجليد الباردة لمدة 20 دقيقة. إعداد PFA 4٪ في اليوم السابق. مخزن +4 ° C في استخدام حتى. PFA هو جديد لمدة أسبوع واحد تقريبا.
3. إزالة PFA مع micropipette. ثم، يغسل مع الثلج الباردة PBS لمدة 20 دقيقة.
4. وضع العين في 30٪ سكروز +4 ° C في أكثر من ليلة.
5. وضع العين في كأس مليئة درجة الحرارة المثلى للقطع (OCT)-المتوسطة (الأنسجةتك). وضع العين في وضع مناسب لتقطيع.
6. تجميد في OCT-المتوسطة أكثر من الثلج الجاف.
7. المحل في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
باجتزاء
1. وضع العين في البرد تقطيع طائرة المناسب.
2. ثلاث قطع 5 ميكرون سميكة منتصف السهمي أقسام من الجزء المركزي من كل عدسة. تجاهل ما لا يقل عن 6 أقسام بين أبواب متسلسلة لتجنب تلطيخ نواة نفسها في أقسام مختلفة.
3. مرة واحدة وقد تم قطع الجزء، ضع شريحة بلطف على أعلى من ذلك. ينبغي لقسم عصا ثم إلى الشريحة.
4. ترك الشرائح إلى الهواء الجاف قبل الاستخدام. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
مضان المناعية
1. اسمحوا عينات تحقيق درجة حرارة الغرفة (5-10 دقيقة).
2. رسم حواف حول العينات باستخدام قلم-PAP (إينفيتروجن).
3. اسمحوا الحدود الجافة لفترة من الوقت (10 دقيقة).
4. تسمية الشرائح المجهر.
5. ترطيب في 1 × PBS لمدة 15 دقيقة.
6. Permeabilize في حل كتلة القياسية لمدة 30 دقيقة.
7. إضافة الأجسام المضادة الأولية (أرنب بولكلونل، كاسباس-3 المشقوق الأجسام المضادة Asp175 9661؛ الخليوي التكنولوجيا تشوير، المؤتمر الوطني العراقي) المخفف في حل 1:3،000 كتلة القياسية.
8. مخزن في غرفة مرطب C ° +4 في أكثر من ليلة.
9. يغسل في برنامج تلفزيوني من قبل pipetting (3 × 5 دقائق) أو عن طريق غمر في حمام كبيرة (> 15 دقيقة، 1-2 التغييرات).
10. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة لمكافحة الأرانب الثانوية مع طيف الامتصاص / الانبعاثات المحددة) المخفف في 1:300 الحل كتلة القياسية.
11. يغسل في برنامج تلفزيوني من قبل pipetting (3 × 5 دقائق) أو عن طريق غمر في حمام كبيرة (> 15 دقيقة، 1-2 التغييرات).
12. تمحو PAP من ركلة جزاء التناسلية.
13. في غرفة تخزين في درجة حرارة الغرفة مرطب لمدة 3 ساعة. تجنب التعرض للضوء.
14. إضافة قطرة من Vectashield ووضع زلة غطاء على الشريحة. تجنب الوقوع في فقاعات.
15. السماح للتصلب Vectashield (~ 20 دقيقة).
16. الحفاظ على القسمين الأولن الظلام حتى التحليل.
17. تتم معالجة كافة أقسام التحكم في غياب الأجسام المضادة الأولية.
18. البحث عن النتائج في غضون بضع ساعات تحت المجهر مضان.
19. عد نوى الخلايا الظهارية "من جانب واحد القوس القوس النووية لالجانب الآخر النووية من كل عدسة. تطبيق عامل التصفية القياسية الزرقاء لمشاهدة كافة نواة العدسة الظهارية في الزرقاء ومرشح القياسية التي تناسب الانبعاثات من الأجسام المضادة الثانوية لرؤية نوى كاسباس-3 الإيجابية باللون الأخضر.
20. تسجيل عدد من النوى كل عدسة الظهارية وعدد النوى إيجابية. عد الخلايا ثلاث مرات لكل قسم.