의 분자 메커니즘의 특성<em&gt; 생체에</em&gt; UVR 유도 백내장

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

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요약

백내장은 세계에서 실명의 주요 원인이다. 태양 자외선 방사 (UVR)는 백내장 개발을위한 주요 위험 요소입니다. 지금까지 UVR-B 유발 백내장의 동물 모델은 개발되었습니다. UVR, 정량 RT-PCR 및 immunohistochemistry에 노출 :이 글에서 우리는 백내장 형성에 대한 조사를하는 방법을 설명합니다.

초록

백내장은 세계 ¹ 실명의 주요 원인이다. 세계 보건기구 (WHO)는 빛의 전송을 막는 눈의 수정체의 뿌옇게로 백내장 정의합니다. 백내장은 당뇨병, 흡연, 자외선 방사선 (UVR), 알코올, 이온화 방사선, 스테로이드 및 고혈압과 관련된 여러 요소 질병입니다. UVR은 백내장 일으키는 강력한 ^2-4 실험 및 역학 증거 ^5,6가 있습니다. 우리는 anesthetized ⁷ 비 anesthetized 동물 ^팔 모두에 UVR B 유발 백내장에 대한 동물 모델을 개발했습니다.

백내장에 대한 유일한 치료는 수술이지만이 치료는 모든 액세스 할 수 없습니다. 그것은 10 년 동안 백내장의 발병을 지연 50 % ⁹ 백내장 수술에 대한 필요성을 줄일 수있는 것으로 추산되었습니다. 백내장의 발생을 지연하기 위해, 그것은 백내장 형성의 메커니즘을 이해하고 효과적인 예방 strat를 찾을 필요합니다egies. 백내장 개발을위한 메커니즘 중 apoptosis 인간과 동물 ¹⁰ 백내장의 개시에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 우리의 초점은 최근 백내장 개발 ^{8,11,12을위한} 메커니즘으로 렌즈의 apoptosis있다. 그것은 apoptosis 경로에 UVR의 효과를 더 잘 이해 백내장 방지 할 수있는 새로운 의약품의 발견에 대한 가능성을 제공 할 것으로 예상된다.

이 문서에서는, 우리는 실험적으로 UVR-B에 생체 노출에 의해 유도 할 수있는 방법 백내장 설명합니다. 또한 RT-PCR 및 immunohistochemistry이 도구 UVR-B 유발 백내장의 분자 메커니즘을 연구하기로 제공됩니다.

프로토콜

1. 자외선 방사선에 노출

15 분 노출되기 전에, 90 밀리그램 / kg Ketalar (케타민)와 intraperitoneal 주사로 10 밀리그램 / kg Rompun (xylazine)의 혼합물 여성 Sprague-Dawley 쥐를 마취.
쥐 restrainer에서 동물을 놓고 트렁크 짜 ¹³ 발생하지 않고 쥐의 고정까지 벨트를 조이십시오.
mydriasis를 유도 할 수있는 쥐의 두 눈에 Mydriacyl (tropicamide), 10 MG / ML을 심어.
그 한쪽 눈이 절반이 최대 10 nm의 전체 폭이 300 nm의 ¹⁴ UVR의 좁은 빔에 대해 위치 될 수 있도록 동물을 놓고 검은 색 테이프 contralateral 눈을 보호.
15 300 nm의 분 ^15에서 쥐 일방적으로 하위 임계 복용 한 kJ / m ² UVR-B을 쉽게받을 수 있습니다.

2. 해부

미리 정해진 후 노출 간격 (1, 5, 24 및 120 시간) 후, carbo하여 육주 늙은 쥐 (체중 <200g)를 희생N 개의 이산화 질식과 경추의 전위.
명백히하다 눈. 이후, 아래 뒤쪽면을 눈 각막을 넣어. 그런 다음, 펀치 27 게이지 캐뉼라를 적용하고 공막에서 매우 가깝습니다 렌즈 손상을 방지하기 위해 공막에 tangentially 밀어로 최소한의 구멍. 그런 다음 공막의 뒤쪽 부분을 들어 올려 수있을 때까지 그냥 limbus 뒤에 원주 잘라 안과 수술 가위를 사용합니다. 그런 다음, 무딘 곡선 포셉으로 렌즈를 올린다.
5-10 분보다 더 이상 균형 소금 솔루션에 렌즈를 유지, 현미경 렌즈 적도에서 모양체의 잔해를 제거합니다.

3. 정량 RT-PCR

350 μl RA1 용해 완충액 (NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)와 2 ML Eppendorf 튜브에 3.5 μl β-메르 캅토 에탄올의 혼합에 렌즈를 삽입합니다.
실온에서 30 분 동안이 혼합에 렌즈를 보관.
로 렌즈를 균질화렌즈 만 하드 핵까지 바늘이 렌즈 (피질과 렌즈의 캡슐이 용해 버퍼에 lysed 아르)에서 남아있다. 믹스에서 핵을 제거합니다.
스토어 샘플 즉시 -70시 ° C.
샘플을 해동하고 프로토콜 "교양 세포와 조직의 총 RNA 정화"(NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)를 따르십시오.
스토어 RNA 샘플 -70에서 ° C.
2 분 95 ° C, 40 사이클에 대한 2 단계 : 각 샘플에서 DNA의 충분한 제거를 확인하려면 다음과 같은 조건 (1 단계에서 PCR을 실행 95 ° C 20 초, 55 ° C 20 초에 72 ° 20 초에 C, 3 단계 : 7 분 72 ° C) p53 유전자의 DNA 특정 프리 머와 함께 앞으로 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 '와 역 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (dNTPack), 제조에 따라 프로토콜입니다. 예상 PCR 제품은 243 기본 쌍입니다.
243 기본 쌍 DNA 특정 PCR 제품을 감지 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다. 준비하기TBE 버퍼에 1.5 % 아가로 오스 겔은 아가로 오스의 3.75 g을 가지고 TBE 버퍼 250 ML에 해결. ethidium 브로마이드 (0.5 MG / ML) 1.5 % 아가로 오스 겔 솔루션 500 ML 500 μl를 추가합니다. 전자 레인지 오웬의 혼합물을 가열하고 아가로 오스를 해결하기 위해 젓는다.

샘플 중 어느 것도 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동에있는 모든 DNA 특정 PCR 제품을 나타 내기 위해이 없습니다.

RNA 샘플 (1 μl)의 농도와 NanoDrop ND-1000 분광 광도계에서 260 나노 미터 (RNA)와 280 nm의 (단백질)에서 샘플 흡광도의 비율을 측정합니다. RNA 샘플 흡광도의 단백질에 대한 비율 RNA 2.0 이상이면 다음 RNA 샘플은 순수합니다. RNA 샘플 흡광도의 비율이 2.0보다 낮 으면 정화 단계 3.5 RNA 다시 실행.
1 μg에 해당하는 RNA 샘플의 볼륨을 타고 프로토콜 ^1의 스트랜드 cDNA 합성 키트 (RT-PCR을위한 ¹ 차 스트랜드 cDNA 합성 키트)에 따라 cDNA 합성.
-20 ° C에서 cDNA 샘플을 저장(기간 1과 년 이상, -70에서 저장 ° C).
iCycler MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 검출 시스템에 정량 실시간 PCR을 실행합니다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, caspase 3 TaqMan 유전자 발현 분석과 함께 96 - 웰 플레이트에 triplicates 지침을 제조했다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, 18에 대한 TaqMan 유전자 발현 분석과 또 다른 96 - 웰 플레이트에 triplicates 안내 (TaqMan 유전자 발현 분석 프로토콜)를 제조했다. 시리즈에서 세 무작위로 선택한 비 노출 렌즈의 cDNA의 일부를 희석. 96 - 웰 플레이트에 샘플의 cDNA와 함께 시리얼 dilutions을 실행합니다.
결과의 정량화에 대한 표준 곡선 방법을 사용합니다. 임계 형광의 사이클의 수는 MyiQ 소프트웨어의 측정으로 사용됩니다. 캘리브레이터의 상대적 농도의 함수로 입구에서 사이클의 수를 표현하는 표준 곡선은 에스입니다각 플레이트에 시리얼 dilutions을 위해 tablished. 세 이외의 치료 렌즈 샘플의 cDNA는 보정을 위해 사용되었다. cDNA가 측정 샘플의 상대적인 농도를 얻기 위해 표준 곡선에 각 샘플에 대한 사이클의 임계 번호를 관련. 마지막으로, cDNA 내부 제어 18에 cDNA 대상의 상대적 농도를 관련된하여 대상 유전자의 표현 수준을.

4. Immunohistochemical 착색

정착
1. PBS의 눈을 (; 산도 7.4 인산 식염 버퍼링) 해부.
2. 20 분을위한 얼음처럼 차가워에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 가득 찬 튜브에 눈을 놔. 전날 PFA 4 % 준비합니다. 4시 매장 ° C 사용까지. PFA는 약 1 주일 동안 신선한 것입니다.
3. micropipette으로 PFA를 제거합니다. 그런 다음 20 분을위한 얼음 차가운 PBS로 씻어.
4. ° C 밤 동안 4에서 자당 30 %가 눈을 놔.
5. 최적의 절삭 온도 (OCT) 매체로 가득 찬 컵에 눈을 넣어 (조직- 테크). sectioning에 적합한 위치에 눈을 놔.
6. 드라이 아이스를 통해 월 중간에 멈춰 봐.
7. -70에서 저장 ° C 사용까지.
Sectioning
1. 해당 비행기에 cryo-sectioning에 눈을 배치합니다.
2. 각 렌즈의 중앙 부분에서 세 5 μm 두께의 중간 시상 부분을 잘라 버릴거야. 다른 섹션에 동일한 핵을 얼룩 방지하기 위해 연속 섹션 사이에 최소 6 절을 폐기하십시오.
3. 섹션 절단되면 부드럽게 상단에 슬라이드를 놓습니다. 섹션은 다음 슬라이드에 충실해야합니다.
4. 사용하기 전에 공기 건조에 슬라이드를 둡니다. 필요 할 때까지 슬라이드는 -20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
형광 immunohistochemistry
1. 샘플 실온 (5-10 분)을 달성 보자.
2. PAP-펜 (Invitrogen)를 표본 주위에 가장자리를 그립니다.
3. 잠시 (10 분)에 테두리가 건조 보자.
4. 현미경 슬라이드를 붙입니다.
5. 1 Rehydrate × P를15 분을위한 BS.
6. 30 분에 표준 블록 솔루션 Permeabilize.
7. 표준 블록 솔루션에 1:3,000를 희석 (세포 Signalling 기술, Inc의 토끼 polyclonal, 흘리고 caspase-3 항체 Asp175 9661)가 기본 항체를 추가합니다.
8. 밤 동안 4 ° C에서 humidified 챔버에 저장합니다.
9. (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (> 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오.
10. 표준 블록 솔루션에 1:300을 희석 보조 항체를 (특정 흡수 / 방출 스펙트럼과 안티 토끼 차 항체)를 추가합니다.
11. (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (> 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오.
12. PAP-펜 얼룩을 닦아.
13. 3 시간 동안 실온에서 humidified 챔버에 저장합니다. 빛에 노출을 피하십시오.
14. Vectashield 한 방울을 추가하고 슬라이드 커버 슬립을 배치합니다. 거품을 피하십시오.
15. Vectashield 굳어를 (~ 20 분) 보자.
16. 섹션 바로 내가 보관분석까지 어둠 습니.
17. 모든 제어 섹션은 기본 항체의 부재로 처리됩니다.
18. 형광 현미경으로 몇 시간 안에 결과를보세요.
19. 한쪽 핵 활에서 각 렌즈의 반대편 핵 활에 상피 세포 '핵을 계산합니다. 파란색의 모든 렌즈 상피 핵 녹색의 caspase-3 긍정적 핵을 보려면 차 항체의 방출에 맞는 표준 필터를 확인하기 위해 표준 청색 필터를 적용 할 수 있습니다.
20. 모든 렌즈 상피 핵 및 긍정적 인 핵의 수를 기록합니다. 각 섹션에 대한 세포 세 번 계산합니다.