Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di<em&gt; In vivo</em&gt; UVR indotta cataratta

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

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Riepilogo

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo. Radiazione ultravioletta solare (UVR) è il principale fattore di rischio per lo sviluppo della cataratta. Un modello animale di gran lunga raggi UV-B indotta da cataratta è stato sviluppato. In questo articolo si descrivono i metodi di indagine della cataratta: l'esposizione a raggi UV, RT-PCR e immunoistochimica.

Abstract

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo ^1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità definisce cataratta come una opacità del cristallino dell'occhio che impedisce il trasferimento della luce. La cataratta è una patologia multifattoriale associata al diabete, il fumo, le radiazioni ultraviolette (UVR), alcool, radiazioni ionizzanti, gli steroidi e l'ipertensione. Vi è una forte evidenza sperimentale ^2-4 e ^5,6 epidemiologica che UVR causa della cataratta. Abbiamo sviluppato un modello animale per UVR B cataratta indotta sia anestetizzati ⁷ e non animali anestetizzati ^8.

L'unica cura per la cataratta è l'intervento chirurgico, ma questo trattamento non è accessibile a tutti. È stato stimato che un ritardo di insorgenza della cataratta per 10 anni potrebbe ridurre la necessità di chirurgia della cataratta del 50% ^9. Per ritardare l'incidenza di cataratta, è necessario per comprendere i meccanismi di formazione della cataratta e trovare strategia efficace di prevenzionegie. Tra i meccanismi di sviluppo della cataratta, apoptosi svolge un ruolo cruciale nella apertura di cataratta nell'uomo e negli animali ^10. La nostra attenzione è stata recentemente apoptosi nella lente come meccanismo per la cataratta sviluppo ^8,11,12. Si prevede che una migliore comprensione dell'effetto della UVR sul percorso apoptosi fornirà possibilità per la scoperta di nuovi farmaci per prevenire la cataratta.

In questo articolo, si descrive come la cataratta può essere indotta sperimentalmente dalla esposizione in vivo a raggi UV-B. Inoltre RT-PCR e immunoistochimica sono presentati come strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di raggi UV-B indotta da cataratta.

Protocollo

1. L'esposizione alle radiazioni ultraviolette

15 minuti prima dell'esposizione, anestetizzare una femmina Sprague-Dawley di ratto con una miscela di 90 mg / kg Ketalar (ketamina) e 10 mg / kg Rompun (xilazina) mediante iniezione intraperitoneale.
Posizionare l'animale in un dispositivo di immobilizzazione ratto e tendere le cinghie fino immobilizzazione del ratto senza provocare una compressione del tronco ^13.
Instillare Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, in entrambi gli occhi di ratto per indurre midriasi.
Posizionare l'animale in modo che un occhio è posizionato contro un fascio di raggi UV a 300 nm ¹⁴ con larghezza di 10 nm a metà del massimo e schermare l'occhio controlaterale con nastro nero.
Esporre il ratto unilateralmente sub-dose soglia 1 kJ / m ² raggi UV-B a 300 nm per 15 min ^15.

2. Dissezione

Dopo intervallo predeterminato post esposizione (1, 5, 24 e 120 ore), sacrificare il topo sei settimane di età (peso <200 g) da carbon biossido di asfissia e dislocazione delle vertebre cervicali.
Enucleare gli occhi. Successivamente, inserire la cornea degli occhi verso il basso, lato posteriore in alto. Poi, un buco minima applicando una cannula 27 gauge e spingere tangenzialmente alla sclera per evitare di danneggiare la lente che è molto vicino alla sclera. Quindi utilizzare un paio di forbici per tagliare chirurgia oftalmica circonferenzialmente appena dietro il limbus finché la parte posteriore della sclera può essere sollevato. Quindi, sollevare la lente con una pinza contundenti curve.
Rimuovere residui del corpo ciliare dall'equatore lente al microscopio, mantenendo la lente in soluzione salina bilanciata di non più di 5-10 minuti.

3. RT-PCR quantitativa

Inserire un obiettivo in una miscela di 350 microlitri RA1 tampone di lisi (II NucleoSpin RNA totale isolamento dell'RNA kit) e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo in una provetta Eppendorf da 2 ml.
Mantenere l'obiettivo in questa miscela per 30 min a temperatura ambiente.
Omogeneizzare la lente conun ago fino solo nucleo duro della lente viene lasciata dalla lente (corteccia e della capsula della lente vengono lisate in tampone di lisi). Rimuovere il nucleo dal mix.
Conservare i campioni immediatamente a -70 ° C.
Scongelare i campioni e seguire la "purificazione RNA totale da cellule in coltura e tessuti" protocollo (NucleoSpin RNA II RNA totale Kit di isolamento).
Conservare i campioni di RNA a -70 ° C.
Per verificare sufficiente asportazione di DNA da ogni campione, eseguire una PCR nelle seguenti condizioni (passo 1: 95 ° C per 2 min; step 2 per 40 cicli: 95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 20 sec; passaggio 3: 72 ° C per 7 min) con primers specifici DNA di p53, forward 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'e 5'-inversa TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' e la DNA polimerasi Taq (dNTPack), secondo la fabbricazione protocollo. Il prodotto di PCR previsto è lungo 243 coppie di basi.
Eseguire un 1,5% elettroforesi su gel di agarosio per rilevare il DNA specifico prodotto di PCR di 243 paia di basi. Per preparare1,5% gel di agarosio in tampone TBE tener 3,75 g di agarosio e risolvere in 250 ml di tampone TBE. Aggiungi etidio bromuro (0,5 mg / ml) 500 microlitri in 500 ml di soluzione 1,5% gel di agarosio. Riscaldare il miscuglio in un forno a microonde e mescolare per risolvere l'agarosio.

Nessuno dei campioni deve rivelare eventuali specifiche di DNA prodotti PCR su 1,5% gel di agarosio.

Misurare la concentrazione di campioni di RNA (1 microlitri) e il rapporto di assorbanza del campione a 260 nm (RNA) e 280 nm (proteina) in una NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Se l'RNA rapporto alle proteine di densità ottica dei campioni di RNA è di 2,0 o più, quindi il campione di RNA è puro. Se il rapporto di assorbanza del campione RNA è inferiore a 2,0, ripetere RNA purificazione 3,5.
Prendere un volume di campione di RNA corrispondenti a 1 ug e sintetizzare cDNA seguito Kit 1 Strand protocollo di sintesi di cDNA ^st (1 ^st Strand cDNA Kit sintesi per RT-PCR).
Conservare campioni di cDNA a -20 ° C(Per un periodo di 1 o più anni, conservare a -70 ° C).
Eseguire quantitativa real-time PCR su iCycler Colore unico MyiQ sistema in tempo reale di rilevamento PCR. Triplica carico su piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay per caspasi 3, secondo le istruzioni fabbricazione. Carico triplica su un'altra piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, saggio TaqMan Gene Expression per minori di 18 anni, secondo le istruzioni per la produzione (Protocollo TaqMan Gene Expression Assay). Diluire in serie una frazione di cDNA da tre scelte a caso non esposti lenti. Eseguire diluizioni seriali insieme con il cDNA da campioni in una piastra a 96 pozzetti.
Utilizzare il metodo standard della curva per la quantificazione dei risultati. Il numero di cicli a fluorescenza soglia viene utilizzata come misura nel software MyiQ. Una curva standard che esprime il numero di cicli al livello di soglia in funzione della concentrazione relativa di calibratore è esnoltre stabilito per le diluizioni seriali in ogni piatto. cDNA da tre campioni non trattati lente è stato utilizzato per la calibrazione. Riguardano il numero di cicli di soglia per ciascun campione per la curva standard per ottenere la concentrazione relativa del campione di cDNA misurata. Infine, ottenere il livello di espressione dei geni bersaglio mediante la relativa concentrazione relativa del bersaglio cDNA ai 18s controllo interno cDNA.

4. Colorazione immunoistochimica

Fissazione
1. Staccare l'occhio in PBS (tampone fosfato salino, pH 7,4).
2. Messo l'occhio in un tubo riempito con 4% paraformaldeide (PFA) in freddo ghiaccio per 20 min. Preparare PFA 4% il giorno prima. Conservare a +4 ° C fino all'uso. PFA è fresco per circa una settimana.
3. Rimuovere PFA con una micropipetta. Poi, lavare con PBS freddo ghiaccio per 20 min.
4. Mettere l'occhio in saccarosio 30% a +4 ° C durante la notte.
5. Mettere l'occhio in una tazza piena di temperatura di taglio ottimale (OCT)-medio (Tissue-Tek). Messo l'occhio in una posizione adatta per il sezionamento.
6. Congelare in OCT-media a ghiaccio secco.
7. Conservare a -70 ° C fino all'uso.
Sezionamento
1. Posizionare l'occhio per la crio-sezionamento in un piano adeguato.
2. Tagliare tre 5 micron di spessore sagittale sezioni da una porzione centrale di ciascuna lente. Scartare almeno 6 sezioni tra sezioni sequenziali per evitare di macchiare i nuclei stessa in diverse sezioni.
3. Una volta che una sezione è stata tagliata, delicatamente posizionare un vetrino su di esso. La sezione deve quindi attenersi alla diapositiva.
4. Lasciare i vetrini asciugare all'aria prima dell'uso. Vetrini possono essere conservati a -20 ° C fino all'utilizzo.
Fluorescenza immunoistochimica
1. Lasciate che i campioni raggiungere temperatura ambiente (5-10 minuti).
2. Disegnare bordi attorno ai campioni con un PAP-pen (Invitrogen).
3. Lasciate che il confine a secco per un po '(10 min).
4. Etichettare i vetrini da microscopio.
5. Reidratare in 1 × PBS per 15 min.
6. Permeabilize in soluzione standard di blocco per 30 min.
7. Aggiungere l'anticorpo primario (policlonale di coniglio, spaccati caspasi-3 anticorpo Asp175 9661; segnalazione Cell Technology, Inc) diluito 1:3000 in soluzione standard di blocco.
8. Conservare in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte.
9. Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (> 15 min, 1-2 modifiche).
10. Aggiungi anticorpo secondario (anticorpo di coniglio anti secondaria con un assorbimento specifico / spettro di emissione) diluito 1:300 nella soluzione standard di blocco.
11. Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (> 15 min, 1-2 modifiche).
12. Pulire PAP-penna strisci.
13. Memorizzare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 3 ore. Evitare l'esposizione alla luce.
14. Aggiungere una goccia di Vectashield e mettere un coprioggetto sul vetrino. Evita di fare le bolle.
15. Lasciare indurire Vectashield (~ 20 min).
16. Tenere sezioni in al buio fino al momento dell'analisi.
17. Tutte le sezioni di controllo vengono elaborati in assenza di anticorpo primario.
18. Cercare i risultati in poche ore sotto un microscopio a fluorescenza.
19. Contare nuclei delle cellule epiteliali 'da un fiocco laterale nucleare a prua dall'altra parte nucleare di ogni lente. Applicare il filtro blu standard per vedere tutte nuclei epiteliale lente in blu e un filtro standard che si inserisce l'emissione dell'anticorpo secondario per vedere la caspasi-3 nuclei positivi in verde.
20. Registrare il numero di tutti i nuclei lente epiteliale e il numero di nuclei positivi. Contare le cellule tre volte per ogni sezione.