Характеристика молекулярных механизмов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; UVR индуцированной катаракты

Катаракта является ведущей причиной слепоты в мире. Солнечное ультрафиолетовое излучение (УФО) является основным фактором риска развития катаракты. Животной модели пока УФО-B индуцированной катаракты была разработана. В этой статье мы опишем методы исследования катаракты: воздействие ультрафиолетового излучения, количественный RT-PCR и иммуногистохимии.

Аннотация

Катаракта является ведущей причиной слепоты в мире ^1. Всемирная организация здравоохранения определяет катаракты, помутнение хрусталика глаза, который препятствует передаче света. Катаракта является многофакторное заболевание, связанное с сахарным диабетом, курением, ультрафиолетовым излучением (УФО), алкоголь, ионизирующая радиация, стероиды и гипертонии. Существует сильная экспериментальная ^2-4 и эпидемиологических данных ^5,6, что ультрафиолетовое излучение вызывает катаракту. Мы разработали модель животных для UVR B индуцированной катаракты в обоих наркозом ⁷ и без анестезии животных ^8.

Единственное лекарство от катаракты является операция, но это лечение не является доступным для всех. Было подсчитано, что задержка наступления катаракты в течение 10 лет может уменьшить необходимость для хирургии катаракты на 50% ^9. Чтобы задержать заболеваемости катарактой, это необходимо для понимания механизмов формирования катаракты и найти эффективную стратегию профилактикигий. Среди механизмов развития катаракты, апоптоз играет важную роль в инициировании катаракты у человека и животных ^10. В центре нашего внимания в последнее время апоптоза в объектив, как механизм для развития катаракты ^8,11,12. Предполагается, что лучшее понимание влияния ультрафиолетового излучения на пути апоптоза обеспечит возможности для открытия новых фармацевтических препаратов, чтобы предотвратить катаракту.

В этой статье мы расскажем, как катаракта может быть экспериментально индуцированной в естественных условиях воздействия УФО-B. Далее RT-PCR и иммуногистохимии представлены как инструменты для изучения молекулярных механизмов УВР-B индуцированной катаракты.

протокол

1. Воздействия ультрафиолетового излучения

15 мин до облучения, обезболить женщины Sprague-Dawley крыс смесью 90 мг / кг Ketalar (кетамин) и 10 мг / кг Rompun (ксилазина) путем внутрибрюшинного введения.
Поместите животных в крысу фиксатор и затянуть пояса до иммобилизации крыс, не вызывая сжатие ствола ^13.
Привить Mydriacyl (тропикамид), 10 мг / мл, в оба глаза крыс, чтобы вызвать расширение зрачков.
Поместите животное так, что один глаз находится напротив узкого луча ультрафиолетового излучения при 300 нм ¹⁴ с 10 нм полная ширина на половине максимальной и оградить контралатерального глаза с черной лентой.
Expose крыс в одностороннем порядке суб-пороговая доза 1 кДж / м ² УВР-B при 300 нм в течение 15 мин ^15.

2. Диссекция

После предопределенного после воздействия интервала (1, 5, 24 и 120 ч), пожертвовать шесть недельных крыс (вес <200 г) с карбоп удушения газом и вывих шейных позвонков.
Выяснять глаза. После этого положить роговицы глаза вниз, задняя сторона. Затем удар минимальным отверстием, применив 27-калибровочного канюли и нажмите касательной к склере, чтобы избежать повреждения линзы, которая очень близка к склере. Затем с помощью ножниц глазной хирургии, чтобы сократить окружности позади лимба до задней части склеры могут быть сняты. Затем поднимите объектив с тупым изогнутым пинцетом.
Удалите остатки цилиарного тела от объектива экватору под микроскопом, сохраняя линзы в сбалансированном солевом растворе не более чем на 5-10 мин.

3. Количественная RT-PCR

Поместите линзу в смесь 350 мкл буфера для лизиса RA1 (NucleoSpin РНК II общей РНК изоляции комплект) и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола в 2 мл трубки Эппендорф.
Храните линзы в эту смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
Однородный объектив сиглу, пока только жесткие ядро хрусталика, что осталось от объектива (кора и капсулы хрусталика лизируют в буфере для лизиса). Удалите ядро из смеси.
Магазин образцы сразу же при -70 ° C.
Разморозить образцы и следовать протоколу "Total очистки РНК из культивируемых клеток и тканей" (NucleoSpin РНК II общей РНК изоляции комплект).
Магазин РНК образцы при -70 ° C.
Чтобы убедиться в достаточном удалении ДНК из каждого образца, запустить ПЦР при следующих условиях (шаг 1: 95 ° C в течение 2 мин; шаг 2 для 40 циклов: 95 ° C в течение 20 сек, 55 ° C в течение 20 сек, 72 ° C в течение 20 сек; шаг 3: 72 ° C в течение 7 минут) с p53 ДНК специфических праймеров, вперед 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'и обратный 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' и Taq ДНК-полимеразы (dNTPack), по производству протокол. Ожидаемый продукт ПЦР составляет 243 пар оснований.
Выполнить 1,5% агарозном гель-электрофореза для выявления ДНК конкретного продукта ПЦР из 243 пар оснований. Для подготовки1,5% агарозном геле в буфере TBE принять 3,75 г агарозы и решить ее в 250 мл буфера TBE. Добавить бромид этидия (0,5 мг / мл) 500 мкл в 500 мл 1,5% раствора агарозном геле. Нагрейте смесь в микроволновой печь и размешать, чтобы решить агарозы.

Ни один из образцов должен раскрыть любую ДНК специфических продуктов ПЦР на 1,5% агарозном гель-электрофореза.

Измерение концентрации образцов РНК (1 мкл) и соотношение образца поглощения при 260 нм (РНК) и 280 нм (белок) в NanoDrop ND-1000 спектрофотометр. Если отношение РНК к белку поглощения образца РНК составляет 2,0 или более образцов РНК чисто. Если коэффициент поглощения образца РНК ниже, чем 2.0, повтор РНК стадии очистки 3.5.
Возьмите объем пробы РНК, соответствующей 1 мкг и синтезировать ДНК в соответствии с протоколом ^1-й Strand набора для синтеза кДНК ^(1-й Strand набора для синтеза кДНК для RT-PCR).
Храните образцы ДНК при температуре -20 ° C(На срок от 1 и более лет, хранят при температуре -70 ° C).
Выполнить количественного ПЦР в реальном времени на iCycler MyiQ одноцветные системы реального времени обнаружения ПЦР. Нагрузка трех повторах на 96-луночный планшет с 1 мкл кДНК образца, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Анализ на каспазы 3, по производству инструкции. Нагрузка трех повторах на другой 96-луночный планшет с 1 мкл кДНК образца, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Анализ на 18 лет, в соответствии с инструкциями производство (TaqMan Gene Expression Анализ протокола). Развести в ряды фракции кДНК из трех случайно выбранных, не подвергавшихся воздействию линзы. Выполнить серийные разведения вместе с ДНК из образцов в 96-луночный планшет.
С помощью стандартного метода кривой для количественного определения результатов. Число циклов на пороге флуоресценции используется в качестве измерений в программное обеспечение MyiQ. Стандартная кривая выражении число циклов на пороге как функция относительной концентрации калибратора эс-лено для серийных разведений в каждой пластины. кДНК из трех не обработанные образцы объектив был использован для калибровки. Соотнесите пороговое число циклов для каждого образца в стандартной кривой для получения относительной концентрации образца кДНК измерить. И наконец, получить уровень экспрессии генов-мишеней, связывая относительной концентрации целевой ДНК к внутреннему контролю 18s кДНК.

4. Иммуногистохимического окрашивания

Фиксация
1. Проанализируйте глаза в PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4).
2. Положить глаз в трубке, заполненной 4% параформальдегида (PFA) в ледяной течение 20 мин. Подготовка PFA 4% накануне. Хранить при температуре от +4 ° C до использования. PFA свежее течение примерно одной недели.
3. Удалить PFA с микропипетки. Затем промыть ледяной PBS в течение 20 мин.
4. Положить глаз сахарозы 30% при +4 ° С в течение ночи.
5. Положить глаз в чашу с оптимальной температурой для резки (октябрь)-среде (ткани-Tek). Положить глаз в подходящем положении для секционирования.
6. Заморозить в октябре-среды в течение сухого льда.
7. Хранить при температуре от -70 ° C до использования.
Секционирование
1. Установите глаз крио-секционирования в соответствующей плоскости.
2. Нарезать три толщиной 5 мкм середине сагиттальных срезах из центральной части каждой линзы. Откажитесь по крайней мере, 6 секций между последовательными разделов, чтобы избежать окрашивания же ядер в разных разделах.
3. После того, как раздел был сокращен, осторожно положите слайд на нем. В этом разделе следует затем прилипают к слайду.
4. Оставьте слайды в воздушно-сухой перед использованием. Слайды можно хранить при температуре от -20 ° C до необходимости.
Флуоресценция иммуногистохимии
1. Пусть образцы достичь комнатной температуры (5-10 мин).
2. Ничья края в образцах с PAP-ручка (Invitrogen).
3. Пусть граница сухих некоторое время (10 мин).
4. Этикетка микроскопом.
5. Увлажняет в 1 × PBS течение 15 мин.
6. Permeabilize в стандартном решении блока в течение 30 мин.
7. Добавить первичных антител (кроличьих поликлональных, дрова каспазы-3 антител Asp175 9661; технологии Сотовые сигнализации, Inc), разведенного 1:3000 в стандартных решений блока.
8. Хранить во влажной камере при температуре +4 ° С в течение ночи.
9. Стирать в PBS с помощью пипетки (3 × 5 мин) или путем погружения в большой ванне (> 15 мин, 1-2 изменениями).
10. Добавить вторичные антитела (анти-кролик вторичные антитела с конкретным поглощением / спектра излучения), разбавленной 1:300 в стандартном решении блока.
11. Стирать в PBS с помощью пипетки (3 × 5 мин) или путем погружения в большой ванне (> 15 мин, 1-2 изменениями).
12. Протрите PAP-мазки пера.
13. Хранить во влажной камере при комнатной температуре в течение 3 часов. Избегайте воздействия света.
14. Добавить каплю Vectashield и поместите крышку скольжения на слайде. Избегайте пузырей.
15. Пусть Vectashield затвердевают (~ 20 мин).
16. Держите разделы Iп темноте, пока анализ.
17. Все управляющие разделы обрабатываются в отсутствие первичного антитела.
18. Посмотрите на результаты в течение нескольких часов под флуоресцентным микроскопом.
19. Граф ядра эпителиальной клетки ", с одной стороны ядерной лук на другую сторону ядерной носовой части каждого объектива. Применение стандартных синим фильтром, чтобы увидеть все эпителиальных ядер в синих и стандартный фильтр, который соответствует излучению вторичные антитела, чтобы увидеть каспазы-3 положительных ядер в зеленый цвет.
20. Запись числа всех эпителиальных ядер и число положительных ядер. Подсчет клеток в три раза для каждого раздела.