الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

Summary

تنص هذه المادة على بروتوكول للزراعة شتلات Arabidopsis في RootChip، منصة التصوير ميكروفلويديك الذي يجمع بين التحكم الآلي من شروط النمو مع مراقبة جذر المجهرية والحنق القائم على قياس مستويات الأيض داخل الخلايا.

Abstract

وظائف الجذر كما المرساة المادية للمصنع، وهي الهيئة المسؤولة عن امتصاص المواد الغذائية والمياه المعدنية مثل عناصر النيتروجين والفوسفور والكبريت والتتبع أن النباتات الحصول من التربة. إذا كنا نريد لوضع نهج مستدامة لإنتاج عالية المحصول، ونحن بحاجة إلى فهم أفضل لكيفية تطور الجذر، يتناول مجموعة واسعة من المواد الغذائية، ويتفاعل مع الكائنات التكافلية والمسببة للأمراض. لتحقيق هذه الأهداف، نحن بحاجة إلى أن تكون قادرة على استكشاف جذور بالتفصيل المجهرية على مدى فترات زمنية تتراوح ما بين دقائق إلى أيام.

قمنا بتطوير RootChip، وهو polydimethylsiloxane (PDMS) - جهاز ميكروفلويديك القائم، والذي يسمح لنا أن تنمو والجذور صورة من الشتلات Arabidopsis مع تجنب أي الاجهاد البدني إلى الجذور خلال التحضير لتصوير ¹ (الشكل 1). الجهاز يحتوي على هيكل قناة مشقوقة يضم صمامات الميكرو ميكانيكية لتوجيه تدفق السوائلمن مداخل حل كل دائرة من الدوائر المراقبة 8 ^2. هذا النظام نضح يسمح تسيطر على المكروية الجذرية وتعديل مع الدقة والسرعة. حجم الدوائر على نحو 400 NL، مما يتطلب سوى كميات ضئيلة من محلول الاختبار.

هنا نقدم بروتوكول مفصل لدراسة علم الأحياء الجذر على RootChip باستخدام التصوير النهج القائمة مع القرار في الوقت الحقيقي. ويمكن تحليل الجذور على مدى عدة أيام باستخدام المجهر مرور الوقت. ويمكن perfused الجذور مع حلول المغذيات أو مثبطات، ويمكن تحليل ما يصل الى ثمانية الشتلات في نفس الوقت. هذا النظام لديه القدرة لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك تحليل نمو الجذور في وجود أو عدم وجود المواد الكيميائية، ومضان التحليل القائم على التعبير الجيني، وتحليل أجهزة الاستشعار، على سبيل المثال الحنق nanosensors ^3.

Protocol

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات الخطوات التحضيرية تحت ظروف معقمة.

1. إعداد المخاريط البلاستيكية لانبات بذور

1. شغل لمدة 10 طبق بيتري سم مع متوسط ​​نمو المحتوية على أجار 1٪ ليبلغ سمكها 5 مم. نستخدم قوة 1/2 تعديل هوغلاند المتوسطة ^4، ولكن ينبغي اختيار التشكيل المتوسط ​​لتلائم الاحتياجات الفردية التجريبية.
2. في حين أن المتوسط ​​لا يزال السائل، واستخدام ماصة متعدد القنوات لملء 10 نصائح ماصة ميكرولتر مع 5 ميكرولتر من المتوسط ​​من طبق بيتري.
3. تخزين نصائح شغلها في خانة طرف ماصة حتى المتوسطة صلبة، ثم خفض إلى 4 ملم الأقماع البلاستيكية طويلة ومكان تستقيم في طبق بتري تحتوي على متوسط ​​نمو متين.

2. إنبات البذور ونمو البادرات

1. السطح تعقيم البذور في NaOCl 5٪ لمدة 5 دقائق، يغسل ثلاث مرات مع الماء المعقم، ثم ضع بذرة واحدة على رأس كل واحد من مخروط متوسطة مملوءةق.
2. ختم طبق مع الشريط Micropore (3M) ومخزن في 4 درجات مئوية لمزامنة الإنبات.
3. بعد ثلاثة أيام، ونقل لوحات لمجلس الوزراء لبدء نمو إنبات. شروط النمو لدينا هي 23 درجة مئوية في دورة light/8h ارتفاع 16H الظلام (شدة الضوء: 100 μE م ^-2 S ^-1).
4. بين 5 و 7 أيام بعد الإنبات، ينبغي أن الشتلات تكون جاهزة للنقل إلى RootChip. في هذا الوقت، يجب أن تكون نصائح الجذر بالقرب من منافذ أسفل من المخاريط البلاستيكية. التحقق من صحة الشتلة، طول الجذر، وعند الاقتضاء، والتعبير عن علامة فلوري تحت المجهر تشريح.
5. بمناسبة الشتلات الفردية للنقل على الشريحة. معطوب حدد 10 أو نحو ذلك الشتلات في حالة واحدة أثناء النقل.

3. نقل الشتلات على لRootChip

1. لتعقيم RootChip على المدى الطويل التجارب، والتفافالجهاز في المناديل الورقية، مكان في صحن بيتري والزجاج، والتعقيم.
2. مرة واحدة في RootChip قد بردت، وتغطي مع متوسط ​​نمو السائل. وينبغي على RootChip مغمورة تماما، ولكن ينبغي أن يكون مستوى السائل لا يزيد عن 3 مم فوق سطح RootChip.
3. مع ماصة 20 ميكرولتر، سحب المتوسطة من خلال مدخل ومخرج جذر غرفة لملء غرفة المراقبة مع المتوسط.
4. المخاريط البلاستيكية المكونات بتحديدها في الخطوة 2.5 في مداخل RootChip. وينبغي أن المخاريط تناسب بشكل مريح في مداخل. منذ يتم تحميل RootChip على طبقة رقيقة من الزجاج البصري، لا تطبق الكثير من الضغط على رقاقة.
5. احتضان RootChip بين عشية وضحاها في وسط السائل. لمنع العائمة، ووضع شرائح الزجاج اثنين على رقاقة. إضافة شريط مغناطيسي وإغلاق طبق.
6. نقل الجمعية إلى محرك مغناطيسي، وتستنهض الهمم بلطف المتوسط.
7. مداخل للRootChip وتتقاطع القنوات بزاوية ° 30 إلى الجهاز العادي إلى القوات الجويةlitate نمو الجذور في القنوات (الشكل 1A). لمزيد من دعم النمو في الاتجاه المطلوب، والميل للجمعية قليلا عن طريق وضع شريحة زجاجية تحت طبق بيتري على الجانب المعاكس من رقاقة من وسائل.
8. للحفاظ على دورة الضوء / الظلام، وتسليط الضوء على الشتلات مع مصباح حلقة (شدة الضوء: 100 μE م ^-2 S ^-1) متصلة بجهاز توقيت.

4. ربط RootChip إلى الناقل

1. في اليوم التالي، ملء قابل للغلق، قارورة pressurizable مع متوسط ​​نمو السائل (الشكل 1B).
2. عكس الناقل شرائح ووضعه على سطح مستقر. إزالة RootChip من الوسط السائل وأدخله PDMS الجانب السلبي في فتحة أسفل الناقل رقاقة. توجيه رقاقة حتى يستطيع الجانب الذي يحتوي على مداخل سيطرة طبقة تواجه جانب من وصلات الأنابيب خط الضغط الناقل في الجدار الجانبي.
3. تجفيف غطاء زجاجي علىالجزء السفلي من الشريحة التي النشاف بلطف مع المناديل الورقية. تأمين RootChip إلى الناقل مع الشريط، والحق في التجمع كله.
4. وصلات الأنابيب مصنوعة من قطع أنابيب مرنة microbore البلاستيك (TYGON، 0،20 "معرف X 0.060" OD) إلى قطع بطول 5 سم وربطها الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب microbore (نيو انغلند أنبوب صغير، 0،025 "OD X 0.013" معرف X 0.75 " طويل). ملء موصلات الأنابيب مع الماء باستخدام حقنة والمكونات كل موصل أنابيب في مدخل سيطرة طبقة المقابلة على رقاقة. فإن الماء ملء وقت لاحق من القنوات طبقة التحكم ويمكن استخدامها لنقل الضغط على الصمامات الميكرو ميكانيكية.
5. بتوصيل طرفي نقيض من الخطوط في وسائل الإعلام / قارورة حل (ق). ممارسة الضغط على القارورة حل مع حقنة من الهواء. وزاد ضغط الهواء داخل قارورة حل فرض السائل في خطوط.

5. تركيب RootChip في مجهر

1. وضع الناقل على أن microscمرحلة مكتب مستشار رئيس الوزراء. للحد من إمكانية للجمعية التحول على مدار التجربة بسبب الاهتزازات في الغرفة، ويجب على الناقل تناسب بالضبط في الشقوق من إدراج مرحلة.
2. يتم التحكم في الصمامات رقاقة وتدفق المتوسطة من خلال رقاقة بواسطة ضغط الهواء. وتشعبت خطين مع المنظمين الخروج من خط الضغط الرئيسي - واحد وتستخدم للسيطرة على تدفق المتوسطة من خلال القنوات، ويتم توصيل الطرف الآخر إلى أن الملف اللولبي صمامات الهواء تحريك الصمامات دفع ما يصل من طبقة السيطرة. يتم تشغيل الملف اللولبي الصمامات من جهاز الكمبيوتر عبر وحدة تحكم USB صمام (التي وضعتها رافائيل غوميز سيوبيرج، مختبر لورانس بيركلي الوطني). أغلق كل من منظمات الضغط قبل توصيل رقاقة.
3. إضافة مل قليل من الماء إلى خزانات الناقلة للحفاظ على رطوبة عالية داخل الجمعية. وينبغي تكرار هذه الخطوة أكثر من مسار أطول التجارب للحفاظ على النباتات من الجفاف. الحفاظ على حجم منخفض لتقليل تيهو كمية السائل التي يمكن أن اندفعوا الى مجهر. على المدى الطويل التجارب، يمكن أن يسترشد تدفق من وسائل رقاقة في خزانات الناقلة من خلال ربط منافذ رقاقة إلى الخزانات مع أنابيب microbore (انظر الخطوة 4.4). بدلا من ذلك، يمكن جمع تدفق الذي يتراكم على سطح رقاقة بواسطة pipetting.
4. إعداد ورقة مربعة من البلاستيك الشفاف من حماة ورقة (C-الخط). إصلاح البلاستيك الشفاف إلى الناقل من قبل على الوجهين الشريط للحفاظ على رطوبة عالية، في الجمعية العامة.
5. وضع عصابة على ضوء رقاقة والحفاظ على دورة الضوء / الظلام. وينبغي أن تحول ضوء عصابة قبالة قبل بدء أي من التجربة التي تستخدم علامات الفلورسنت، والإضاءة المباشرة سوف تتداخل مع جمع صورة.

6. تشغيل RootChip باستخدام واجهة ابفيف

يمكن واجهة تحكم RootChip لمنصة البرمجيات ابفيفيمكن تحميلها من موقعنا على الانترنت http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. يتم إغلاق الصمامات على الشريحة عن طريق الضغط على طبقة تحكم، في هذه الحالة عن طريق فتح الملف اللولبي صمامات الهواء. واجهة تحكم تتيح يشتغل من الصمامات من خلال النقر على الزر أدناه عدد صمام. خضراء زاهية يشير تطبيق الضغط وإغلاق صمام رقاقة (الشكل 2B). تفعيل كل ثلاثة الحلول مدخل الصمامات في واجهة تحكم قبل فتح منظمات الضغط. ملاحظة: واجهة تحكم يتميز حلقة التغذية المرتدة، والتي تسمح برصد حالة النظام. ويمكن تنشيط هذه الميزة من خلال النقر على زر "Readback" في واجهة وحدة تحكم.
2. فتح منظم ضغط للسيطرة طبقة وضعت في البداية إلى 15 رطل، ثم فتح منظم للطبقة تدفق وضعت في البداية إلى 5 رطل. Depenقرع على معدل تدفق المطلوب، قد يتم تعديلها من الضغوط في وقت لاحق.
3. فتح صمام مدخل لمتوسط ​​نمو من خيار لمسح مع الدوائر المتوسطة.
4. فحص مسارات تدفق تحت المجهر. عادة، الهواء محتجز في قنوات التدفق ويجب ازالته. وبالإضافة إلى ذلك، وقنوات للسيطرة طبقة لا تزال تحتوي على الهواء الذي يجب أن أجبر على الاستقالة وحل محله المياه من وصلات الأنابيب (طريق مسدود الحشوة). وحقق كل من المهام التي بيغ كل دائرة من الدوائر ثماني مرات عدة (5 رطل) حتى يتم فرض كل الهواء من القنوات في PDMS ("التفريغ"). ملاحظة: يمكن برمجتها واجهة وحدة تحكم لأتمتة التجارب. ويمكن أيضا إجراءات من هذا القبيل يمكن استخدامها لرقاقة لديغا.

7. ممثل النتائج

ان الهدف الرئيسي من RootChip هو الجمع بين منصة التصوير ونظام نضح في جهاز واحد مع مستوى عال من التكامل. للتدليل على التلاعبمن المكروية من جذورها مسح نحن في غرف مظلمة مع تلوين الطعام (1:4 تخفيف المتوسطة في الزراعة المائية)، ويقاس تبادل السوائل داخل الغرف. عند ضغط الموصى به من 5 رطل قمنا بقياس تبادل كامل في غضون 10 ثانية بمعدل تدفق المحسوبة لحوالي 1.5 ميكرو لتر / دقيقة (الشكل 3).

لاحظنا أيضا نمو جذور الشتلات، في هذه الحالة نمت في الظلام والموردة مع الجلوكوز 10 ملم كمصدر للطاقة خارجي (الشكل 4). تبعا للظروف نمو مثل الضوء وتكوين المتوسطة، يمكن ملاحظة النباتات في RootChip لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.

وقد استخدم RootChip لمراقبة الجلوكوز داخل الخلايا، ومستويات سكر اللبن في التعبير عن جذور nanosensors المشفرة وراثيا، على أساس نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) ^5-7. وperfused جذور في رقاقة مع نبضات مربع من الجلوكوز أو حل الجالاكتوز ( الشكل 5). وتم رصد مستويات الخلايا من السكريات وتظهر هنا وأعرب كنسبة من شدة متقبل سيترين fluorophore لشدة ECFP المانحة. ارتفاع في نسبة يشير تراكم السكر.

الشكل 1. RootChip المبدأ.

1. ويتميز RootChip غرف المراقبة الثمانية لنمو والتصوير من الجذور. تنبت البذور الأولى في الأقماع البلاستيكية - ملفقة من نصائح ماصة بلاستيكية - يتم ملء مع المتوسط ​​الذي صلب. قمة الجذر ينمو من خلال المتوسط ​​وتصل إلى غرفة حيث التدفق المستمر للمتوسط ​​سائل تحافظ على الأوضاع في غرفة ثابت. صمامات الميكرو ميكانيكية (الحمراء) السيطرة على تدفق. هي التي شنت على رقاقة على غطاء زجاجي بصري.
   الرسم ليس لتوسيع نطاق. (مقتبس بإذن من جروسمان وآخرون، 2011 الخلية النباتية.)
2. SCHEME من قارورة حل pressurizable مع الحجاب الحاجز (الحمراء).

الشكل 2. ربط وتركيب RootChip.

1. شنت رأي أعلى RootChip مترابط تماما والناقل على مجهر مقلوب.
2. مخطط يوضح نظام احكام بصمام واجهة وحدة تحكم. ويرد مثالا للصمام وضع لتوجيه تدفق السوائل إلى دائرة واحدة. في حين الصمامات من 4 إلى 8 بمثابة صمام واحد، والصمامات 0 إلى 3 في مجموعات عمل. ويمكن لهذا النظام أن تعالج دائرة الفردية من خلال تفعيل مجموعة من الصمامات.

الشكل 3. تبادل الحلول في الفصل المراقبةالكهرمانات. التصور تبادل السوائل في غرفة المراقبة باستخدام محلول الصبغة. كانت الصورة تراكب من حقل مشرق وكاذبة اللون شدة إشارة صبغ.

الشكل 4. على رقاقة نمو الجذور. مراقبة من جذر واحد يعبر عن تنامي فلوري الحنق nanosensor عن الجلوكوز / سكر اللبن على مدار 20h. تنسيق الوقت: HH: MM؛ شريط الحجم: 100 ميكرون.

الشكل 5. قياس مستويات السكر في الخلايا باستخدام الحنق nanosensors.

1. يظهر مبلغ من أجهزة الاستشعار وكثافة سيترين في قمة الجذر (من اليسار). استجابة الخلايا الحنق ويرد nanosensor لتطبيق حل الجلوكوز أو سكر اللبن كصور ratiometric. (مقتبس بإذن من جروسمان وآخرون، 2011 جيش التحرير الشعبى الصينىNT خلية) شريط مقياس: 100 ميكرون.
2. تتبع التغيرات الحنق نسبة كرد على البقول 3 مربع المتكررة للجلوكوز (الخضراء) والجالاكتوز (الحمراء).

Discussion

المزايا الرئيسية لأكثر من وسائل النمو RootChip التقليدية هي إعداد مينيملي للفحص المجهري، والقدرة على عكسية مرارا وتكرارا تغيير البيئة الجذرية، والقدرة على المراقبة المستمرة للأنسجة المختصة انمائيا وصحي من الناحية الفسيولوجية على مدى عدة أيام. سابقا، كانت تزرع الشتلات عموديا على وسائل الإعلام تبلور وتحويلها إلى نظام نضح فورا قبل التجربة، والتي سمح فقط قياس جذور واحدة في وقت واحد ^8. وقد استخدمت أدوات ميكروفلويديك لArabidopsis، ولكن على مستوى منخفض التكامل ⁹ أو بدون مراقبة نضح ^10. وRootChip يجمع على مستوى عال من التكامل، مع القدرة على أتمتة التجارب من خلال توجيه تدفق دقيق. ميزة أخرى من هذا المنبر، سمة من جميع أجهزة ميكروفلويديك ^11، هو أن هناك حاجة إلى كميات ضئيلة فقط من سائل لتزويد جذر مع الجوز ضروريrients، حتى بالنسبة للتجارب التي تمتد عدة أيام. تم تصميم حاليا RootChip كجهاز تستخدم مرة واحدة، ولكن نظرا لأن تكاليف إنتاج رقائق منخفضة، وكميات صغيرة من الكواشف المستهلكة يجعل من رقاقة جدا لا تزال فعالة من حيث التكلفة.

هناك بضع خطوات الحاسمة التي يجب اتخاذها لضمان صحة والشتلات:

وحدة التخزين في المخاريط البلاستيكية غير ميكروليتر فقط 3-4، والتي سوف تبدأ لتجف عند تعرضها للهواء. وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن يتم نقل المخاريط على الرقاقة بسرعة ويتم الاحتفاظ بها رطوبة عالية حتى الجذور قد وصلت إلى غرف المراقبة، والتي سوف تزويدها كميات كافية من المياه. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات 4،2-4،5 بسرعة ودون انقطاع لمنع جفاف الشتلات.

خطوات 3،5-3،8 وصف حضانة للرقاقة في وسائل الإعلام السائلة خلالها جذور تنمو في غرف المراقبة. قد يتم تخطي هذه الخطوة من قبل تركيب شريحة في جarrier فورا والبدء نضح مستمر مع متوسط ​​نمو. ومع ذلك، نوصي تمرغ في متوسط ​​نمو بين عشية وضحاها، كما أنها لديها بعض المزايا: 1) أنه يخلق بيئة رطبة وبالتالي فإن الشتلات هم أقل عرضة لتصبح المجفف لأنها تنمو في غرفة المراقبة، 2) وغارقة في رقاقة في السائل، وذلك وسوف التفريغ (الخطوة 6.4) يكون أسرع.

من المهم استخدام وسائل الإعلام مع تركيز المذاب منخفضة. قد تكون الحلول أكثر تركيزا ويعجل تسد القنوات، وخاصة إذا تم استخدام رقاقة على مدى عدة أيام.

بمجرد توصيل الجهاز إلى خط ضغط الهواء، ويتم التحكم في تدفق المتوسطة من خلال تغيير الضغط الهيدروليكي في الصمامات. لضمان إغلاق السليم للصمامات الميكرو ميكانيكية، من المهم اختيار ضغط الرقابة التي هي نحو ثلاثة أضعاف ضغط التدفق. ينبغي للضغط تدفق لا تزيد عن 15 رطل كما سيتم دفع السوائل من مداخل الجذر. ارتفاع الضغوط أماهذ أيضا أن يسبب التبطين للرقاقة، مما يجعل غير صالحة للاستعمال رقاقة.

وجود قيود على RootChip هو أن PDMS يسهل اختراقها ومسعور. في حين أن مادة خاملة عمليا إلى المحاليل المائية، قد امتصاص المركبات العضوية ^12. وهذا يمكن أن تتداخل مع التبادل السريع للحلول والمركبات العضوية قد تسرب من المادة حتى عندما تم إيقاف العرض من هذا المركب على مدخل. بسبب المسامية، قد تستخدم المذيبات العضوية يسبب تورم في PDMS ^12.

نستمر في تحسين وتوسيع RootChip فائدتها، على سبيل المثال مع جذور نباتات المحاصيل. ونحن نعتقد أن من خلال تحسين الوصول إلى جذر لعلاج والمراقبة، وأدوات ميكروفلويديك مثل RootChip سوف تفتح أبعادا جديدة للبحث جذر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
البنود	مصدر	معلومات
الناقل رقاقة، والبرمجيات وغيرها من المعلومات.	مؤسسة كارنيجي - DPB	CAD والتصنيع باستخدام الحاسب الآلي الملفات لتصنيع الناقل، والبرمجيات، وتحكم على مزيد من المعلومات غير متوفرة للتنزيل من موقع http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip يمكن أيضا لشركات الاتصالات أن يؤمر من هذا الموقع.
RootChip	ستانفورد مسبك	قناع التصاميم والبروتوكولات تلفيق متاحة عند الطلب. ويمكن طلب الجاهزة للاستخدام من RootChips http://www.stanford.edu/group/foundry/
رقاقة تحكم	المنزل مدمجة	وقد وضعت في الأصل وحدة تحكم صمام النظام الآلي من قبل رافائيل غوميز سيوبيرج، مختبر لورانس بيركلي الوطني. ويمكن الاطلاع على تعليمات مفصلة كيفية بناء الخاصة بك وحدة تحكم صمام دفعتها في https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers