Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

Resumen

Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

Resumen

Las funciones de las raíces como el ancla de la planta física y es el órgano responsable de la captación de agua y nutrientes minerales tales como los elementos nitrógeno, fósforo, sulfato y de seguimiento que las plantas adquieran en el suelo. Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para la producción de alto rendimiento de los cultivos, tenemos que comprender mejor cómo se desarrolla la raíz, tiene un amplio espectro de nutrientes, e interactúa con organismos simbióticos y patógenos. Para lograr estas metas, tenemos que ser capaces de explorar sus raíces en detalle microscópico durante períodos de tiempo que van desde minutos a días.

Hemos desarrollado el RootChip, un polidimetilsiloxano (PDMS) - dispositivo de microfluidos basada en, lo que nos permite crecer y las raíces de las plántulas de Arabidopsis imagen, evitando cualquier tensión física a las raíces durante la preparación para la imagen ¹ (Figura 1). El dispositivo contiene una estructura de canal bifurcado con válvulas de micro-mecánicos para guiar el flujo de fluidoa partir de entradas de solución a cada una de las ocho cámaras de observación ^2. Este sistema de perfusión permite el microambiente raíz para ser controlado y modificado con precisión y rapidez. El volumen de las cámaras es de aproximadamente 400 nl, por lo que requieren sólo cantidades mínimas de solución de ensayo.

A continuación presentamos un protocolo detallado para el estudio de la biología de raíz en el RootChip el uso de imágenes basadas en los enfoques de la resolución en tiempo real. Las raíces pueden ser analizados a lo largo de varios días utilizando microscopía de lapso de tiempo. Las raíces pueden ser perfundidos con soluciones nutritivas o inhibidores, y hasta ocho plantas de semillero pueden ser analizados en paralelo. Este sistema tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de crecimiento de las raíces en la presencia o ausencia de productos químicos, la fluorescencia basada en el análisis de la expresión génica, y el análisis de los biosensores, por ejemplo FRET nanosensores ^3.

Protocolo

Nota: Realice todos los pasos de las medidas preparatorias en condiciones estériles.

1. Preparación de los conos de plástico para la germinación de la semilla

1. Llenar un 10 cm de placa de Petri con medio de crecimiento que contenía 1% de agar a un espesor de 5 mm. Utilizamos una fuerza media modificada Hoagland medio ^4, pero la composición del medio debe ser elegido para adaptarse a los requisitos individuales experimentales.
2. Mientras que el medio es todavía líquida, utilice una pipeta multicanal para cubrir puntas de pipeta de 10 ml con 5 ml de medio de la placa de Petri.
3. Guarde las puntas llenas en la caja de punta de la pipeta hasta que el medio es sólido, luego se corta a 4 conos de plástico mm de largo y el lugar en posición vertical en una placa de Petri que contiene medio de crecimiento sólido.

2. La germinación de semillas y crecimiento de plántulas

1. Surface esterilizar las semillas en 5% de NaOCl durante 5 min, se lava tres veces con agua estéril, a continuación, colocar una sola semilla en la parte superior de cada uno de los cono medio llenos.
2. Selle la placa con cinta Micropore (3M) y se almacena a 4 ° C para sincronizar la germinación.
3. Después de tres días, transferir las placas a una cabina de crecimiento para iniciar la germinación. Nuestras condiciones de crecimiento son de 23 ° C en un ciclo de 16 horas de alta light/8h oscuro (Intensidad de la luz: 100 μE m ^-2 s ^-1).
4. Entre 5 y 7 días después de la germinación, las plántulas deben estar listos para la transferencia a la RootChip. En este momento, puntas de las raíces deben estar cerca de los desagües de fondo de los conos de plástico. Comprobar el estado de plántula, longitud de raíz y, en su caso, la expresión de un marcador fluorescente bajo un microscopio de disección.
5. Marcar plántulas individuales para la transferencia en el chip. Seleccione una decena de plantas de semillero en caso de que uno se daña durante la transferencia.

3. La transferencia de plántulas en el RootChip

1. Para esterilizar el RootChip de experimentos a largo plazo, envuelvael dispositivo en papel de seda, el lugar en un plato Petri de vidrio, y autoclave.
2. Una vez que el RootChip se haya enfriado, cubrir con medio de cultivo líquido. El RootChip debe estar completamente sumergido, pero el nivel del líquido no debe ser mayor de 3 mm por encima de la superficie RootChip.
3. Con una pipeta 20 ul, tirar de medio a través de la entrada de la raíz y salida de la cámara para llenar la cámara de observación con el medio.
4. Conos de plástico diseñados seleccionado en el paso 2.5 en las entradas de RootChip. Los conos deben quedar bien ajustados en las entradas. Dado que el RootChip está montado sobre una fina capa de cristal óptico, no se aplican demasiada presión al chip.
5. Incubar la RootChip durante la noche en medio líquido. Para evitar flotante, colocar dos portaobjetos de vidrio en el chip. Añadir una barra de agitación magnética y cerrar el plato.
6. Traslado a la asamblea a un agitador magnético y agitar suavemente el medio.
7. La entradas RootChip se cruzan los canales en un ángulo de 30 ° en el dispositivo normal a FACIlitate crecimiento de las raíces en los canales (Figura 1A). Para apoyar aún más el crecimiento en la dirección deseada, incline ligeramente el conjunto mediante la colocación de un portaobjetos de vidrio bajo la placa de Petri en el lado opuesto de la viruta de las salidas.
8. Para mantener el ciclo luz / oscuridad, iluminar las plantas de semillero con una lámpara de anillo (Intensidad de la luz: 100 μE m ^-2 s ^-1) conectado a un temporizador.

4. Conexión de la RootChip al Transportista

1. El día siguiente, llenar un vial hermético, presurizable con medio de crecimiento líquido (Figura 1B).
2. Invertir el soporte de chip y colocarlo sobre una superficie estable. Quitar el RootChip del medio líquido e insertarla lado PDMS abajo en la abertura inferior del soporte de chip. Oriente el chip de manera que el lado que contiene las entradas de la capa de control se enfrenta al lado de los conectores de tubo de presión de línea en la pared lateral portador.
3. Secar la cubierta de vidrio en elparte inferior del chip secando suavemente con papel de seda. Asegure el RootChip a la compañía con la cinta y el derecho a toda la asamblea.
4. Conectores de tubería se realizan cortando un tubo flexible de plástico microperforado (TYGON, 0.20 "x 0.060" OD) en trozos de 5 cm de largo y conecta a los tubos de acero inoxidable microperforado (Nueva Inglaterra tubo pequeño, 0,025 "de diámetro exterior x 0.013" x 0.75 " de largo). Rellenar los conectores de tubo con agua usando una jeringa y el tapón cada conector del tubo en la entrada de control de la capa correspondiente en el chip. El agua después se llenan los canales de la capa de control y se utiliza para transmitir la presión a las válvulas micromecánicos.
5. Enchufe los extremos opuestos de las líneas en los medios de comunicación y envase de la solución (s). Aplicar presión en el vial de solución con una jeringa de aire. La presión de aire mayor en el envase de la solución forzará líquido en las líneas.

5. Montaje de la RootChip en el microscopio

1. Coloque el soporte sobre el Microscetapa de opa. Para reducir la posibilidad de que el conjunto de desplazamiento durante el curso del experimento, debido a las vibraciones en la sala, el portador debe encajar exactamente en las muescas del inserto etapa.
2. Las válvulas de chips y el flujo del medio a través del chip son controlados por la presión del aire. Dos líneas con los reguladores se separaron de una línea de presión principal - una se utiliza para controlar el flujo de medio a través de los canales, y el otro se conecta a las válvulas de solenoide de aire que accionan las válvulas hasta empuje de la capa de control. Las válvulas de solenoide se manejan desde el ordenador a través del controlador USB de la válvula (desarrollado por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley). Cierre las dos reguladores de presión antes de conectar el chip.
3. Añadir unos mililitros de agua a los embalses de la compañía para mantener la humedad alta dentro de la asamblea. Este paso se debe repetir en curso de los experimentos más largos para mantener las plantas se sequen. Mantenga el volumen bajo para reducir al mínimo tél cantidad de líquido que podría ser derramado sobre el microscopio. Para experimentos a largo plazo, la salida de los puntos de venta de chips puede ser guiado en los depósitos de la compañía mediante la conexión de los puntos de venta de chips para los depósitos con un tubo microperforado (ver paso 4.4). Alternativamente, el flujo de salida que se acumula sobre la superficie del chip pueden ser recogidos por pipeteado.
4. Preparar hojas cuadradas de plástico transparente de protectores de hojas (C-Line). Fijar el plástico transparente a la compañía por la cinta de doble cara para mantener la humedad alta en la asamblea.
5. Coloque el anillo de luz sobre el chip y mantener el ciclo luz / oscuridad. El anillo de luz debe ser desconectada antes del comienzo de cualquier experimento que utiliza marcadores fluorescentes, como la iluminación directa va a interferir con la colección de imágenes.

6. Funcionamiento de la RootChip utilizando el interfaz de LabVIEW

La interfaz de controlador de RootChip para la plataforma de software LabVIEW puedepuede descargar desde nuestro sitio web http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. Las válvulas en el chip se cierran mediante la aplicación de presión a la capa de control, en este caso mediante la apertura de las válvulas de solenoide de aire. La interfaz de control permite el accionamiento de las válvulas haciendo clic en el botón situado debajo del número de la válvula. Verde brillante indica la aplicación de presión y el cierre de una válvula de chip (Figura 2B). Activar las tres válvulas de entrada de solución en la interfaz de controlador antes de abrir los reguladores de presión. Nota: La interfaz de controlador dispone de un circuito de retroalimentación, que permite el seguimiento del estado del sistema. Esta función puede activarse haciendo clic en la "relectura" en la interfaz de controlador.
2. Abra el regulador de presión para la capa de control y establecido inicialmente en 15 psi, a continuación, abra el regulador para la capa de flujo y fijado inicialmente a 5 psi. Dependiendo del caudal deseado, las presiones pueden ser ajustados después.
3. Abrir la válvula de entrada para el medio de crecimiento de elección para vaciar las cámaras con el medio.
4. Ver las trayectorias de flujo bajo el microscopio. Normalmente, el aire queda atrapado en los canales de flujo y debe ser eliminado. Adicionalmente, los canales de la capa de control todavía contienen aire que debe ser forzado a salir y se sustituye por el agua de los tubos conectores (sin salida de llenado). Ambas tareas se logran mediante el lavado de cada una de las ocho cámaras en varias ocasiones (5 psi) hasta que el aire es forzado desde los canales en el PDMS ("desgasificación"). Nota: El controlador de interfaz puede ser programado para automatizar experimentos. Tales rutinas también puede utilizarse para desgasificar el chip.

7. Los resultados representativos

El propósito principal de la RootChip es combinar una plataforma de imágenes y un sistema de perfusión en un solo dispositivo con un alto nivel de integración. Para demostrar la manipulacióndel microambiente de las raíces que lavarse las cámaras con colorante oscuro (dilución 1:4 en medio hidropónico) y se midió el intercambio de fluidos dentro de las cámaras. A la presión recomendada de 5 psi se midió un cambio completo dentro de 10 segundos a una velocidad de flujo calculado de aproximadamente 1,5 l / min (Figura 3).

También se observó crecimiento de las raíces de las plántulas, en este caso crecido en la oscuridad y se suministra con 10 mM de glucosa como fuente de energía externa (Figura 4). Dependiendo de las condiciones de crecimiento tales como la luz y la composición del medio, las plantas se puede observar en la RootChip de hasta tres días.

El RootChip se ha utilizado para monitorizar la glucosa intracelular y los niveles de galactosa en las raíces que expresan nanosensores genéticamente codificados, basado en Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) ^5-7. Las raíces en el chip se perfundieron con pulsos cuadrados de glucosa o galactosa solución ( Figura 5). Los niveles intracelulares de azúcares fueron controlados y se muestran aquí expresado como una relación de la intensidad de la Citrino fluoróforo receptor a la intensidad de la ECFP donante. El aumento de la relación indica la acumulación de azúcar.

Figura 1. RootChip principio.

1. El RootChip cuenta con ocho cámaras de observación para el crecimiento y la imagen de las raíces. Las primeras semillas germinan en conos de plástico - fabricada a partir de puntas de pipeta de plástico - que se llena con un medio sólido. La punta de la raíz crece a través del medio y llega a la cámara donde un flujo continuo de medio líquido mantiene las condiciones de la constante de cámara. Las válvulas micromecánicos (rojo) controlar el flujo. El chip está montado sobre una cubierta de vidrio óptico.
   El dibujo no está a escala. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)
2. Scheme de un frasco de solución de presurizable con el diafragma (rojo).

Figura 2. Conectar y montar el RootChip.

1. Vista superior de la RootChip completamente conectado y el vehículo montado en un microscopio invertido.
2. Esquema que ilustra el sistema de válvulas y el interfaz de control. Un ejemplo de una válvula de ajuste para guiar el flujo de fluido a una sola cámara se muestra. Mientras que las válvulas de 4 a 8 actúan como válvulas, válvulas individuales de 0 a 3 actúan en grupos. Con este sistema una cámara individual puede ser abordado mediante la activación de una combinación de válvulas.

Figura 3. Intercambio de soluciones en el cap de observaciónámbar. de visualización del tipo de cambio de líquido en una cámara de observación utilizando solución de colorante. La imagen es una superposición de campo claro y falso color de intensidad de la señal de tinte.

Figura 4. El chip crecimiento de las raíces. La observación de una sola raíz creciente expresar un fluorescente FRET nanosensor para la glucosa / galactosa en el transcurso de 20 horas. Formato de hora: hh: mm, barra de escala: 100 m.

Figura 5. Medir los niveles de azúcar en la intracelulares utilizando nanosensores FRET.

1. La cantidad de sensor se muestra como la intensidad citrino dentro de la punta de la raíz (izquierda). La respuesta de la intracelular FRET nanosensor para la aplicación de la glucosa o galactosa solución se muestra como imágenes ratiometric. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 PlaCelular nt) barra de escala. 100 m.
2. Seguimiento de FRET los cambios de relación en respuesta a impulsos repetidos tres cuadrados de la glucosa (verde) y galactosa (en rojo).

Discusión

Las principales ventajas de la RootChip sobre los métodos convencionales de crecimiento son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar de forma reversible y repetidamente el entorno de las raíces, y la capacidad para la observación continua de tejido sano desarrollo competente y fisiológicamente durante un período de varios días. Anteriormente, las plántulas fueron cultivadas en medios gelificados verticalmente y se transfiere a un sistema de perfusión inmediatamente antes del experimento, que permite sólo medir raíces individuales en un momento ^8. Herramientas de microfluídica se han utilizado para la Arabidopsis, pero en un nivel de integración bajo ⁹ o sin control de la perfusión ^10. El RootChip combina un alto nivel de integración con la capacidad de automatizar el flujo de experimentos mediante la orientación precisa. Otra ventaja de esta plataforma, típico de todos los dispositivos de microfluidos ^11, es que sólo cantidades mínimas de líquido se requiere para suministrar la raíz con la tuerca necesariorients, incluso para los experimentos que abarcan varios días. El RootChip está diseñado como un dispositivo de un solo uso, pero dado que los costes de producción de patatas fritas son bajas, las pequeñas cantidades de reactivos consumidos hace que el chip todavía muy rentable.

Hay algunos pasos críticos que deben ser adoptadas para garantizar la salud de las plantas de semillero:

El volumen en los conos de plástico es sólo l 3-4, que comenzará a secarse cuando se expone al aire. Por lo tanto, es fundamental que los conos se transfieren en el chip rápidamente y la humedad se mantiene alta hasta que las raíces han llegado a las cámaras de observación, que los abastecen con agua suficiente. Pasos 4.2 a 4.5 se debe realizar rápidamente y sin interrupción para evitar la desecación de las plántulas.

Pasos 3,5 - 3,8 describir la incubación de la viruta en medios líquidos durante el cual las raíces crecen en las cámaras de observación. Este paso puede ser omitido por el montaje de la viruta en la carrier inmediatamente e iniciar la perfusión constante con medio de crecimiento. Sin embargo, se recomienda sumergir en el medio de cultivo durante la noche, ya que tiene algunas ventajas: 1) Se crea un ambiente húmedo por lo que las plántulas son menos propensos a ser desecado a medida que crecen dentro de la cámara de observación, 2) el chip se sumerge en un líquido, por lo que desgasificación (paso 6,4) será más rápido.

Es importante utilizar los medios con bajas concentraciones de soluto. Soluciones más concentradas pueden precipitar y obstruir los canales, sobre todo si el chip se utiliza durante varios días.

Una vez que el dispositivo está conectado a la línea de presión de aire, el flujo de medio de cambio es controlada por la presión hidráulica en las válvulas. Para garantizar el cierre adecuado de las válvulas micromecánicos, es importante elegir una presión de control que es aproximadamente tres veces mayor que la presión del flujo. La presión de aire no debe exceder de 15 psi como el fluido será empujado fuera de las entradas de la raíz. Presiones más altas may también provocar la deslaminación del chip, que hace que el chip inutilizable.

Una limitación de la RootChip es que PDMS es poroso e hidrofóbicas. Mientras que el material es prácticamente inerte a soluciones acuosas, que pueden absorber compuestos orgánicos ^12. Esto puede interferir con un intercambio rápido de soluciones como compuestos orgánicos pueden filtrarse a partir del material, incluso cuando el suministro de este compuesto se ha detenido en la entrada. Debido a la porosidad, el uso de disolventes orgánicos que pueden causar la hinchazón de la PDMS ^12.

Seguimos para optimizar la RootChip y extender su utilidad, por ejemplo con las raíces de las plantas de cultivo. Creemos que mejorando el acceso a la raíz para el tratamiento y la observación, las herramientas de microfluidos, como el RootChip abrirá nuevas dimensiones de la investigación de la raíz.

Materiales

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El portador de chip, software y otro tipo de información.	Institución Carnegie - DPB	CAD y CNC para la fabricación de los archivos de soporte, software de control y más información están disponibles para su descarga desde el sitio web http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS Los transportistas también se pueden pedir desde este sitio web.
RootChip	Fundición de Stanford	Diseños de máscaras y protocolos de fabricación están disponibles bajo petición. Listo para usar RootChips se puede pedir a http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip de la controladora	-Casa construida-	El sistema de controlador de la válvula automática fue desarrollado originalmente por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley. Una instrucción detallada sobre cómo construir su propio controlador de la válvula de accionamiento se puede encontrar en https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers