זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

Abstract

פונקציות שורש כעוגן הפיזי של המפעל הוא האיבר האחראי על ספיגת המזון בגוף מים מינרלים כגון אלמנטים, חנקן וזרחן, סולפט זכר שצמחים לרכוש מהקרקע. אם אנחנו רוצים לפתח גישות קיימא לייצור היבול גבוה, עלינו להבין טוב יותר כיצד השורש מפתחת, תופס קשת רחבה של חומרים מזינים, וכן אינטראקציה עם אורגניזמים פתוגניים ו סימביוטיים. כדי להשיג מטרות אלו, אנו צריכים להיות מסוגלים לחקור את השורשים בפירוט מיקרוסקופי על פני פרקי זמן הנעים בין דקות יום.

פיתחנו RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS) - מכשיר microfluidic מבוסס, אשר מאפשר לנו לגדול השורשים תמונה שתילים ארבידופסיס תוך הימנעות מכל מתח פיזי לשורשים במהלך הכנת הדמיה ¹ (איור 1). המכשיר מכיל מבנה הערוץ מפוצלת הכוללת שסתומים micromechanical להנחות את זרימת הנוזלמתוך פתחי הכניסה פתרון לכל אחד משמונת החדרים תצפית ^2. מערכת זו מאפשרת זלוף microenvironment שורש כדי להיות מבוקר שונה עם דיוק ומהירות. נפח החדרים הוא כ 400 NL, וכן הוא מחייב רק כמויות מזעריות של פתרון המבחן.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקר הביולוגיה שורש על RootChip באמצעות הדמיה מבוססי גישות עם רזולוציה בזמן אמת. השורשים ניתן לנתח על פני כמה ימים באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות. השורשים ניתן perfused עם פתרונות או מעכבי תזונתיים, ועד 8 שתילים ניתן לנתח במקביל. במערכת זו יש פוטנציאל עבור מגוון רחב של יישומים, כולל ניתוח של צמיחה שורש בנוכחות או העדר של כימיקלים, הקרינה מבוסס ניתוח של ביטוי גנים, ועל ניתוח של biosensors, למשל סריג nanosensors ^3.

Protocol

הערה: בצע את כל השלבים הכנות בתנאים סטריליים.

1. הכנת קונוסים מפלסטיק נביטת הזרעים

1. מלאו צלחת פטרי 10 ס"מ עם מדיום גידול המכיל אגר 1% עד עובי של 5 מ"מ. אנו משתמשים כוח 1/2 שונה הוגלנד בינוני ^4, אבל הרכב בינוני יש לבחור כדי להתאים לדרישות ניסויים בודדים.
2. אמנם המדיום הוא עדיין נוזלי, השתמש פיפטה רב ערוצי למלא 10 עצות פיפטה μl עם μl 5 של המדיום מצלחת פטרי.
3. אחסן את הטיפים למלא תיבת עצה פיפטה עד בינוני הוא מוצק, חתוך אז עד 4 מ"מ ארוכים גביעי פלסטיק במקום ישר לתוך צלחת פטרי שמכילה בינוני צמיחה איתנה.

2. נביטת הזרעים וגידול שתיל

1. פני השטח לעקר הזרעים NaOCl 5% עבור 5 דקות, שלוש פעמים לשטוף עם מים סטריליים, ואז לשים זרע אחד על גבי חרוט בינוני מלאs.
2. סוגרים את המנה עם קלטת micropore (3M) ולאחסן ב 4 ° C כדי לסנכרן את הנביטה.
3. אחרי שלושה ימים, להעביר את הצלחות לארון גידול להתחיל נביטה. תנאי הגידול שלנו הם 23 מעלות צלזיוס בכל מחזור 16h light/8h גבוהה כהה (עוצמת האור: 100 μE מ ^-2 s ^-1).
4. בין 5 ל -7 ימים לאחר הנביטה, את השתילים צריך להיות מוכן להעברה RootChip. בשלב זה, טיפים שורש צריך להיות ליד כלי התחתונה של גביעי פלסטיק. בדוק בריאות שתיל, אורך שורש, ואם יש צורך, ביטוי של פלורסנט סמן תחת מיקרוסקופ לנתח.
5. סמן שתילים בודדים עבור העברת על גבי שבב. בחר עשרה בערך שתילים במקרה 1 ניזוק במהלך ההעברה.

3. העברת שתילים על RootChip

1. לעקר RootChip ארוך טווח ניסויים, לעטוףמכשיר בנייר משי, במקום בכלי זכוכית פטרי, ו החיטוי.
2. לאחר RootChip מתקרר, מכסים את זה עם מדיום גידול נוזלי. RootChip צריך להיות שקוע לחלוטין, אבל את רמת הנוזל צריך להיות לא יותר מ 3 מ"מ מעל פני השטח RootChip.
3. עם פיפטה 20 μl, למשוך בינוני עד כניסת השורש מוצא תא כדי למלא את החדר עם תצפית בינוני.
4. גביעי פלסטיק הכנס נבחרו בשלב 2.5 לתוך פתחי הכניסה RootChip. קונוסים צריכים להתאים בנוחות על פתחי הכניסה את. מאז RootChip הוא רכוב על שכבה דקה של זכוכית אופטית, לא להפעיל לחץ רב מדי על השבב.
5. דגירה RootChip לילה במדיום נוזלי. כדי למנוע הצפה, הצב שתי שקופיות זכוכית על גבי שבב. להוסיף פס מגנטי רעש ולסגור את המנה.
6. מעבירים את הרכבה stirrer מגנטי בעדינות להתסיס בינוני.
7. פתחי הכניסה של RootChip מצטלבים ערוצי בזווית של ° 30 למכשיר נורמלי facilitate גידול השורש לתוך תעלות (איור 1 א). כדי להמשיך לתמוך בצמיחה בכיוון הרצוי, להטות את הרכבה מעט על ידי הנחת שקופיות זכוכית מתחת לצלחת פטרי בצד השני של השבב של שקעים.
8. כדי לשמור על מחזור אור / חושך, להאיר את השתילים עם מנורה הטבעת (עוצמת האור: 100 μE מ ^-2 s ^-1) מחובר טיימר.

4. חיבור RootChip למוביל

1. למחרת, למלא בקבוקון רב סגר, pressurizable עם מדיום גידול נוזלי (1B איור).
2. הפוך נושאת שבב ולמקם אותו על משטח יציב. הסר את RootChip ממדיום נוזלי להכניס אותו בצד PDMS לתוך הפתח התחתון של המוביל שבב. אוריינט שבב כך את הצד המכיל את שכבת פתחי הכניסה בקרה עומדת בפני צד של קו הלחץ מחברי צינורות בקיר הצד המוביל.
3. יבש את הזכוכית המכסה עלהתחתון של השבב על ידי בעדינות עם נייר סופג רקמות. להבטיח את RootChip למוביל עם הקלטת הזכות ההרכבה כולה.
4. מחברים צינורות מבוצעים על ידי חיתוך צינור פלסטיק גמיש microbore (TYGON, 0.20 "x 0.060 מזהה" OD) לחתיכות 5 ס"מ ולחבר אותם נירוסטה microbore צינורות (Tube ניו אינגלנד קטן, .025 "OD x 0.013" מזהה x 0.75 " זמן). ממלאים את צינורות מחברים עם מים באמצעות מזרק וחבר כל מחבר צינורות לתוך כניסת שכבת המתאים שליטה על השבב. המים יהיה מאוחר יותר למלא את השכבה ערוצי שליטה ומשומשות להעביר את הלחץ על שסתומי micromechanical.
5. לחבר את הקצוות של הקווים לתוך התקשורת / בקבוקון פתרון (ים). תפעילו לחץ על הבקבוקון פתרון בעזרת מזרק של אוויר. לחץ האוויר עלה בתוך בקבוקון פתרון יאלץ נוזל לתוך השורות.

5. הרכבה RootChip על מיקרוסקופ

1. הנח את הספק על microscבשלב אופ. כדי לצמצם את האפשרות של הרכבה משתנה במהלך הניסוי בשל תנודות בחדר, הספק צריך להתאים בדיוק לתוך החריצים של הכנס הבמה.
2. השסתומים שבב ואת זרימת בינוני באמצעות שבב נשלטים על ידי לחץ אוויר. שתי שורות עם הרגולטורים הם הסתעפו קו הלחץ העיקרי - 1 משמש לשליטה על זרימת אמצעי בין הערוצים, והשני מחובר האוויר שסתומים סולנואיד כי להניע את שכיבות סמיכה הגיעו שסתומים של השכבה שליטה. השסתומים סולנואיד מופעלים מהמחשב דרך שסתום בקר USB (שפותחה על ידי רפאל גומז-Sjöberg, הלאומית לורנס ברקלי מעבדה). לסגור את שני הרגולטורים לחץ לפני חיבור שבב.
3. הוסף כמה מ"ל מים מאגרים של הספק לשמור על לחות גבוהה בתוך ההרכבה. שלב זה יש לחזור על מהלך הניסויים יותר כדי לשמור על הצמחים מהתייבשות. לשמור על נפח נמוך כדי למזער tהוא כמות הנוזלים שניתן נשפך על המיקרוסקופ. לטווח הארוך ניסויים, יצוא של כלי שבב יכול להיות מונחה לתוך מאגרים של הספק על ידי חיבור כלי שבב על מאגרי עם צינורות microbore (ראה שלב 4.4). לחלופין, יצוא שמצטבר על פני השבב ניתן לאסוף על ידי pipetting.
4. להכין יריעות פלסטיק שקוף בריבוע של מ מגינים גיליונות (C-Line). תקן פלסטיק שקוף המוביל של קלטת דו צדדית כדי לשמור על לחות גבוהה באסיפה.
5. מקם את טבעת אור על שבב ולקיים את מחזור אור / חושך. אור הטבעת צריך להיות כבוי לפני תחילת הניסוי כל העושה שימוש סמנים ניאון, כמו תאורה ישירה יפריע אוסף תמונה.

6. הפעלה RootChip באמצעות ממשק LabVIEW

ממשק בקר RootChip עבור פלטפורמת התוכנה LabVIEW יכולניתן להוריד מאתר האינטרנט שלנו http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. השסתומים על שבב סגורים על ידי הפעלת לחץ על שכבת הבקרה, במקרה זה על ידי פתיחת שסתומי אוויר סולנואיד. ממשק בקר מאפשר actuation של השסתומים על ידי לחיצה על הכפתור למטה מספר שסתום. ירוק בהיר מציין הפעלת לחץ וסגירת השסתום השבב (איור 2 ב). להפעיל את כל שלושת פתרון כניסת שסתומים בממשק הבקר לפני פתיחת הרגולטורים לחץ. הערה: ממשק בקר כולל לולאת משוב, המאפשר ניטור של מצב המערכת. תכונה זו עשויה להיות מופעל על ידי לחיצה על כפתור "Readback" בממשק הבקר.
2. פתח את ווסת הלחץ על שכבת מלאה להגדיר תחילה ל -15 PSI, ולאחר מכן פתח את הרגולטור של השכבה זרימת ולהגדיר תחילה 5 psi. Depenדינג על קצב זרימת הרצוי, הלחצים יכול להיות מותאם מאוחר יותר.
3. פתח את שסתום היניקה של המדיום צמיחה של בחירה כדי לשטוף את חדרי עם המדיום.
4. יש לבדוק את נתיבי הזרימה מתחת למיקרוסקופ. בדרך כלל, אוויר לכוד את ערוצי הזרימה ויש להסירו. בנוסף, הערוצים של שכבת הבקרה עדיין מכילים אוויר שיש נאלץ לצאת והוחלף מים מן המחברים צינורות (ללא מוצא מילוי). המשימות הן מושגות על ידי שטיפה כל אחת משמונה תאים מספר פעמים (5 psi) עד שכל האוויר נאלץ מן הערוצים לתוך PDMS ("degassing"). הערה: ממשק הבקר ניתן לתכנת כדי להפוך ניסויים. שגרות אלה עשויים לשמש גם שבב דגה.

7. נציג תוצאות

מטרת ממשלת RootChip היא לשלב פלטפורמת הדמיה המערכת זלוף במכשיר אחד עם רמה גבוהה של אינטגרציה. כדי להדגים את המניפולציהשל microenvironment של שורשים לנו סמוקות לתאי עם צבע מאכל כהה (דילול 01:04 במדיום הידרופוני) ומדד החליפין של נוזל בתוך החדרים. בלחץ המומלצת של 5 psi מדדנו בתמורה מלאה תוך 10 שניות בקצב זרימת מחושב של כ μl 1.5 / דקה (איור 3).

כמו כן, אנו נצפה גידול השורש של שתילים, במקרה זה גדל בחושך מסופק עם גלוקוז 10 mM כמקור אנרגיה חיצוני (איור 4). בהתאם לתנאי גידול, כגון אור הרכב החומר, צמחים ניתן לצפות RootChip לתקופה של עד שלושה ימים.

RootChip נעשה שימוש כדי לפקח על רמת הסוכר תאיים ורמות גלקטוז בשורשים המבטאים nanosensors מקודדים גנטית, המבוססת על העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) ^5-7. שורשים שבב היו perfused עם פולסים רבועים של גלוקוז או גלקטוז פתרון ( איור 5). רמות תאיים של סוכרים נוטרו ומוצגים כאן כפי שבאה לידי ביטוי ביחס של עוצמת סיטרין fluorophore acceptor לעוצמת ECFP התורם. העלייה מצביעה על יחס הצטברות של סוכר.

באיור 1. RootChip העיקרון.

1. RootChip כולל שמונה חדרי תצפית לצמיחה הדמיה של השורשים. הזרעים לנבוט 1 ב גביעי פלסטיק - מפוברק מ טיפים פיפטה פלסטיק - אשר מלאים בינוני מוצק. קצה השורש גדל דרך בינוני ומגיע לחדר שבו זרימה רציפה של המדיום נוזל שומר על תנאי מתמיד קאמרית. שסתומים micromechanical (אדום) לשלוט בזרימת. השבב הוא רכוב על הזכוכית המכסה אופטי.
   ציור לא להרחיב. (עיבוד באישור גרוסמן et al., 2011 תא הצמח.)
2. SCHEME של הבקבוקון פתרון pressurizable עם הסרעפת (אדום).

איור 2. חיבור גובר RootChip.

1. צפה לראש RootChip מחובר באופן מלא הספק מותקן על מיקרוסקופ הפוכה.
2. תוכנית המדגימה את מערכת valving וממשק בקר. למשל עבור שסתום הגדרת להנחות את זרימת הנוזל אל חדר אחד מוצג. בעוד שסתומים 4 עד 8 מעשה כמו ברזים, שסתומים חד 0 עד 3 מעשה בקבוצות. עם מערכת זו תא בודד ניתן לטפל על ידי שילוב של הפעלת השסתומים.

איור 3. החלפת פתרונות CH תצפיתambers. ויזואליזציה של החלפת נוזל בתא השגחה באמצעות פתרון צבע. התמונה היא כיסוי של שדה בהיר שווא בצבע עוצמת אות הצבע.

באיור 4. על שבב גידול השורש. תצפית של שורש גדלה אחת להביע ניאון סריג nanosensor של גלוקוז / גלקטוז במשך 20h. פורמט זמן: hh: mm: בר בקנה מידה: 100 מיקרומטר.

איור 5. מדידת רמות סוכר תאיים באמצעות סריג nanosensors.

1. סכום של חיישן מוצג עוצמת סיטרין בתוך קצה השורש (משמאל). תגובת תאיים סריג nanosensor היישום של גלוקוז או גלקטוז הפתרון מוצג כתמונות ratiometric. (עיבוד באישור גרוסמן et al., 2011 Plaתא NT) בר סולם:. 100 מיקרומטר.
2. מעקב אחר שינויים סריג יחס כתגובה שלושה פולסים מרובעים חוזרות ונשנות של גלוקוז (ירוק) וגלקטוז (אדום).

Discussion

היתרונות העיקריים של RootChip על פני שיטות גידול המקובלות הן הכנה פולשנית מיקרוסקופיה, היכולת הפיך שוב ושוב לשנות את סביבת השורש, ויכולת תצפית רציפה של רקמות מוסמכת מבחינה התפתחותית ובריא מבחינה פיזיולוגית על פני תקופה של מספר ימים. בעבר, שתילים גדלו בצורה אנכית על התקשורת תסרוקת והועברו מערכת טפטוף מיד לפני הניסוי, אשר אפשרה רק מדידה שורשים בודדים בכל פעם ^8. כלים microfluidic שימשו במשך ארבידופסיס, אבל ברמה נמוכה אינטגרציה ⁹ או ללא שליטה זלוף ^10. RootChip משלב רמה גבוהה של אינטגרציה עם היכולת להפוך ניסויים באמצעות הדרכה תזרים מדויק. יתרון נוסף של הפלטפורמה הזו, האופיינית כל התקנים microfluidic ^11, הוא רק כמויות מזעריות של נוזל נדרשים לספק את השורש עם אגוז צורךrients, גם עבור ניסויים פורש מספר ימים. RootChip מיועד כיום כאמצעי יחיד לשימוש, אבל מאז עלויות הייצור של שבבי נמוכות, את כמויות קטנות של חומרים כימיים צרכו עושה את השבב עדיין מאוד חסכונית.

ישנם מספר שלבים קריטיים כמה שיש לנקוט כדי להבטיח את בריאותם של שתילים את:

נפח את גביעי פלסטיק רק μl 3-4, אשר יתחיל להתייבש כאשר נחשף לאוויר. לכן זה קריטי, כי את הקונוסים מועברים על גבי שבב במהירות והלחות נשמרת גבוהה עד השורשים הגיעו לתאי תצפית, אשר יספק להם מספיק מים. צעדים 4.2 ל 4.5 יש לבצע במהירות וללא הפסקה כדי למנוע התייבשות של השתילים.

צעדים 3.5 - 3.8 לתאר את הדגירה של השבב בתקשורת נוזלי שבמהלכו השורשים לצמוח לתאי תצפית. שלב זה ניתן לדלג על ידי הרכבה שבב לתוך גarrier מיד החל טפטוף מתמיד עם צמיחה בינונית. עם זאת, אנו ממליצים על השריית במדיום הגידול בין לילה, שכן יש כמה יתרונות: 1) הוא יוצר סביבה לחה כל כך את השתילים נוטים פחות להיות מיובש כאשר הם גדלים לתוך חדר תצפיות, 2) שבב ספוגה בנוזל, כך degassing (שלב 6.4) יהיה מהיר יותר.

חשוב להשתמש במדיה עם ריכוז המומס נמוך. תמיסות מרוכזות יותר עלולה לעורר ולסתום את הערוצים, במיוחד אם השבב משמש על פני כמה ימים.

ברגע שהמכשיר מחובר לקו לחץ האוויר, זרם בינוני נשלטת על ידי שינוי הלחץ ההידראולי של השסתומים. כדי להבטיח את סגירת נכון של השסתומים micromechanical, חשוב לבחור שליטה בלחץ כי הוא בערך פי שלושה מאחוז לחץ הזרימה. לחץ זרימת לא יעלה על 15 psi כמו נוזל יהיה דחף מתוך פתחי הכניסה שורש. לחצים גבוהים יותר מאY גם לגרום delamination של השבב, אשר הופך לא שמיש שבב.

הגבלה של RootChip היא PDMS הוא נקבובי הידרופובי. אמנם החומר הוא אינרטי מעשית תמיסות מימיות, הוא עלול לספוג תרכובות אורגניות ^12. זה יכול להפריע חילופי מהירה של פתרונות כמו תרכובות אורגניות עלול לדלוף מן החומר גם כאשר האספקה ​​של מתחם זה כבר עצר כניסת. עקב נקבוביות, שימוש בממסים אורגניים עלולה לגרום לנפיחות של PDMS ^12.

אנו ממשיכים לייעל את RootChip ולהרחיב השירות שלה, למשל עם שורשים של צמחים הצומח. אנו מאמינים כי על ידי שיפור הגישה שורש עבור טיפולים תצפית, כלי microfluidic כמו RootChip תפתח מימדים חדשים של מחקר השורש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
פריטים	מקור	מידע
הספק השבבים, התוכנה וכל מידע אחר.	מכון קרנגי - DPB	CAD ו CNC קבצים עבור ייצור המוביל, תוכנה בקר ומידע נוסף זמינים להורדה מאתר האינטרנט של http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS מובילים יכול להיות גם הורה מאתר זה.
RootChip	סטנפורד יציקה	עיצובים מסכת ופרוטוקולים ייצור זמינים על פי דרישה. מוכן לשימוש RootChips ניתן להזמין http://www.stanford.edu/group/foundry/
שבב בקר	ביתי מובנה	מערכת אוטומטית בקר שסתום פותחה במקור על ידי רפאל גומז-Sjöberg, המעבדה הלאומית לורנס ברקלי. הדרכה מפורטת כיצד לבנות בקר שסתום מופעלים שלך ניתן למצוא בכתובת https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers