تحقيقات بشأن التعديلات من وظيفة الدائرة الحصين عقب معتدل إصابات في الدماغ

Summary

وأوضح نهج متعدد الأوجه لتحقيق التغييرات الوظيفية لدوائر قرن آمون. ويرد وصف تقنيات الكهربية جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإصابة، والاختبار السلوكية والإقليمية طريقة تشريح. يمكن تطبيق مزيج من هذه التقنيات بطريقة مماثلة لمناطق أخرى من الدماغ والأسئلة العلمية.

Abstract

إصابات الدماغ الرضية (TBI) يصيب أكثر من 1.7 مليون شخص في الولايات المتحدة كل عام ومعتدل حتى TBI يمكن أن يؤدي إلى ضعف العصبية المستمرة ^1. ويعتقد أن اثنين من الأعراض انتشارا وتعطيل يعاني منها الناجون TBI، والعجز الذاكرة وانخفاض في الاستيلاء على عتبة، على أن بوساطة TBI التي يسببها ضعف قرن آمون ^2،3. من أجل شرح كيفية تغير وظيفة قرن آمون الدائرة يؤثر سلبا على السلوك بعد TBI في الفئران، ونحن توظيف الوحشي إصابة قرع السائل، وهذا نموذج الحيوان شيوعا من TBI الذي يجسد العديد من الميزات من TBI الإنسان بما في ذلك فقدان الخلايا العصبية، دباق، واضطراب الأيونية ^{4 - 6.}

هنا علينا أن نبرهن طريقة اندماجي للتحقيق في TBI التي يسببها ضعف قرن آمون. نهجنا يتضمن تقنيات متعددة فيفو السابقين الفسيولوجية جنبا إلى جنب مع تحليل سلوك الحيوان والكيمياء الحيوية، وذلك لتحليلبعد TBI التغييرات في قرن آمون. نبدأ مع النموذج التجريبي إلى جانب إصابة التحليل السلوكي المعرفي لتقييم العجز بعد TBI. المقبل، ونحن تضم ثلاثة فيفو السابقين تقنيات متميزة التسجيل: خارج الخلية تسجيل الميدانية المحتملة، تصور خلية كاملة التصحيح، تحامل، والجهد التسجيل صبغة حساسة. وأخيرا، فإننا يبرهن على وجود طريقة لتشريح إقليميا المناطق دون الإقليمية في قرن آمون التي يمكن أن تكون مفيدة لتحليل مفصل للتعديلات الكيميائية العصبية والتمثيل الغذائي في مرحلة ما بعد TBI.

وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة التعديلات في الدوائر قرن آمون بعد TBI وللتحقيق في التغييرات المتعارضة في وظيفة دائرة الشبكة التي تحدث في التلفيف المسنن وCA1 المناطق دون الإقليمية في قرن آمون (انظر الشكل 1). القدرة على تحليل التغييرات بعد TBI في كل المنطقة دون الإقليمية أمر ضروري لفهم الآليات الأساسية التي تسهم في TBI التي يسببها السلوكية والمعرفية دeficits.

النظام المتعدد الأوجه المذكورة هنا يسمح المحققين لدفع توصيف الظواهر الماضية من الناجم عن حالة المرض (في هذه الحالة TBI) وتحديد آليات المسؤولة عن الأمراض المرتبطة TBI المرصودة.

Protocol

1. الإصابات الجانبية السوائل قرع

1. تخدير الماوس باستخدام مزيج من الكيتامين والغشاء البريتونى زيلازين معين. ثم يعد رئيس الماوس، لشق باستخدام فرك اليود.
2. إجراء قطع القحف فوق منطقة الجداري الأيمن باستخدام 3 مم (خارج القطر) منقب.
3. آمنة محور إبرة الأنبوب-LOC (داخل القطر مم 3) على قطع القحف باستخدام الاكريليك cyanoarylate والأسنان.
4. 24 ساعة في وقت لاحق، تخدير باستخدام الماوس isoflurane عن طريق الاستنشاق.
5. استئناف التنفس الطبيعي مرة واحدة، ولكن قبل الماوس يصبح حساسة للتحفيز، تسليم 20 ميللي ثانية نبض المالحة في الجمجمة عن طريق الجهاز قرع إصابة السوائل.
6. مباشرة بعد الإصابة إزالة المحور، reanaesthetize باستخدام الماوس isoflurane، وخياطة فروة الرأس مغلقة.
   وسوف تعمل الضوابط الشام تلقي الإجراء خطوة مماثلة مع 1،5 حذفها.

2. تحليل السلوكية - مكيفة التركيب الخوفonse

1. التعامل مع الفئران في يومين متتاليين قبل استجابة الخوف مكيفة (CFR) التدريب.
2. الماوس مكان في الغرفة لمدة 3 دقائق تكييف قبل بالإدارة 1،5 مللي أمبير صدمة الكلمة لمدة 2 ثانية. ترك الماوس في غرفة لثانية 30 إضافية.
3. بعد فترة تأخير (عادة 24 ساعة)، والعودة إلى غرفة تكييف الماوس لمدة 5 دقائق. تقييم تجميد ثانية على فترات 5.
   تحليل يتكون من مقارنة القيمة النسبية لتجميد الوقت في اثنين من السكان، في حالتنا الدماغ المصاب الفئران والضوابط التي تديرها الشام. انخفاض معدلات التجمد (مقارنة التحكم) إلى عدم القدرة على الاحتفاظ العلاقة بين السياق والصدمة الكلمة، مؤشرا على ضعف الذاكرة وضعف الادراك.

3. إعداد شرائح الحصين الحاد

* ملاحظة: لا يمكن إلا أن التخدير باستخدام الناقوس الزجاجي تنفذ إجراءات لمحطة (مثل تشريح الدماغ الموصوفة هنا).

1. بعد 7 أيامإصابة، وجعل 1 L من السوائل الاصطناعية الشوكي الدماغي (ACSF) و 250 مل حل السكروز القطع.
2. استخدام الثلج لضمان بتحرر جميع الصكوك والحلول المستخدمة أثناء إعداد شريحة الدماغ الباردة الجليد.
3. تخدير الماوس باستخدام isoflurane. بسرعة وبلطف إزالة الدماغ من الماوس ومكان في السكروز.
4. تقليم الدماغ ومكان على سطح القطع على قطرة من superglue أمام كتلة أجار.
5. قطع 350 ميكرون سميكة شرائح الاكليلية، يجب أن تكون قادرا على الحصول على 4 أو 5 شرائح مع الدائرة الكهربائية للقرن آمون سليمة.
6. احتضان لمدة لا تقل شرائح 1 ساعة عند 37 ° C.

4. تسجيل خارج الخلية الميدانية المحتملة

1. سحب أسلاك الزجاج البورسليكات ل2-5 MΩs باستخدام مجتذب العمودي.
2. شريحة مكان في الغرفة وعلى إدراج القطب الكهربائي حامل.
3. انخفاض القطب محفزة في شريحة في الجهاز محور عصبي مثل المسار الثاقب أو الضمانات شيفر. انخفاض تسجيل القطب الكهربائيفي الموقف في حين خرج آثار الرصد للتأكد من أن الأقطاب الكهربائية هي في مستوى زي نفسه (العمق). عندما يتم التوصل إلى استجابة القصوى، وعقد على مستوى التحفيز الحالية ثابتة، هي الأقطاب الكهربائية على مستوى زي واحد.
4. تتبع الناتجة يتكون من ثلاثة عناصر هي: وابل من الألياف قبل المشبكي، مجال المحتملة بعد المشبكي خارج الخلية (fEPSP)، وارتفاع عدد السكان بعد المشبكي. قد تتداخل المكونات مؤقتا في بعض الأعمال التحضيرية، مما يجعل التحليل أكثر صعوبة. إذا كان هناك غموض سواء بين الاستجابات قبل المشبكي أو بعد المشبكي، يمكن إضافة وAPV CNQX إلى الحمام لمنع انتقال مثير، وجميع الإشارات المتبقية ستكون من أصل قبل المشبكي.
5. بروتوكولات تحفيز تختلف لإنتاج ثلاثة أنواع متميزة التجربة: الإدخال / الإخراج منحنيات والتسجيلات نبض إرفاقها، والتجارب اللدونة على المدى الطويل.
   تحليل يتكون عادة من القياسات مقارنة المنحدر من fEPSP عبر في الفئران الدماغ المصاب على حد سواء والشامالتي تديرها الضوابط، والسيطرة للقوة الإدخال عن طريق قياس كرة الألياف.

5. تصور التصحيح، المشبك تسجيل

1. إعداد شرائح، الأقطاب الكهربائية، وتلاعب لتسجيل كما هو موضح سابقا أعلاه حتى الخطوة 4.2.
2. سوف ينظر فقط الخلايا من 80 ميكرومتر أعمق في الأنسجة والخلايا أقرب إلى السطح يكون ميتا و / أو خفضت الاتصال. الاقتراب من الخلية مع الضغط الإيجابي على القطب لضمان أن لا يحصل انسداد وهو يتحرك إلى أسفل من خلال الأنسجة. عندما تلامس بلطف القطب الخلية تطبيق الضغط السلبي من أجل إنشاء "gigaseal 'بين القطب وغشاء البلازما.
3. تطبيق رشقات نارية قصيرة من الضغط السلبي من أجل تمزق الغشاء plama تحت القطب وتحقيق خلية كاملة التكوين.
4. القضاء على العابرين السعة باستخدام مكبر للصوت والتعويض عن المقاومة السلسلة. تعويض للمقاومة سلسلة من الخلية ضروري لضمانccurate القياسات.
5. لا يمكن أن يؤديها وضعين التسجيلات خلية واحدة: المشبك الحالي (قياس الجهد غشاء) والمشبك الجهد (قياس التيار المار من خلال القنوات الأيونية في الغشاء).
   أنواع التحليل ممكن عديدة ولكن في حالتنا تتكون في معظمها من التحليل الكمي البيوفيزيائية معدل وحجم التيارات متشابك عفوية في الفئران الدماغ المصاب على حد سواء والضوابط التي تديرها الشام.

6. الجهد الحساسة صبغ التصوير (VSD)

1. إعداد شرائح وتلاعب لتسجيل كما هو موضح سابقا أعلاه حتى الخطوة 4.2.
2. إعداد الأوراق المالية عن طريق خلط الصبغة 1 ملغ دي-3-ANEPPDHQ إلى 50 ميكرولتر الإيثانول؛ الاستغناء 2 ميكرولتر مأخوذة في أنابيب ملفوفة احباط، مخزن في -20 ° C. جعل العمل اليومي محلول الصبغة، من خلال تمييع 1:200 في ACSF.
3. احتضان شريحة على ورق الترشيح المبلل ACSF وصمة عار مع 90 ميكرولتر من صبغة لمدة 16 دقيقة؛ شطف مع ACSF ومكان في واجهة غرفة تسجيل.
4. ضبط الضوء stimulatioوتتركز كثافة ن حتى الاستجابة في منتصف نطاق الكاميرا. عادة يتم الحصول على الصور بمعدل 500-1،000 لقطة في الثانية.
5. مصراع الزناد لضوء ميللي ثانية 200 التحفيز قبل التحفيز الكهربائي للسماح photobleaching السريع الأولي لتحقيق الاستقرار. المحاكمات اكتساب بالتناوب بين كهربائيا حفز، وحفز غير كهربائيا، في وقت لاحق للسماح الطرح غير حفز الخلفية. سجل شدة الضوء يستريح (القراءة مضان مع مصراع مغلق) قبل فتح مصراع. وكل محاكمة VSD يكون بكسل × بكسل من ذ ب "فيلم" وقت قراءات مضان. سجل 10 حتي 12 VSD المحاكمات في كل حالة اختبار.
6. يتم تنفيذ جميع القياسات على التغيير داخل بكسل مضان قبل تطبيع التحفيز الكهربائية، DF / F، والذي يحسب على النحو التالي:
   طرح شدة الضوء يستريح من المحاكمة الخام VSD المكتسبة. لكل بكسل في كل محاكمة، وتطبيع وفقا لقيمة ما قبل التحفيز الكهربائي، يعني لذلكمحاكمة، وطرح الوحدة. نفعل ذلك لحفز كل من المحاكمات كهربائيا وغير كهربائيا على حفز. إنشاء المتوسط ​​"مضان الخلفية" محاكمة من محاكمات غير كهربائيا حفز، وطرح هذه المحاكمة الخلفية من التجارب حفز كهربائيا. عادة يتم تنفيذ مزيد من التحليل في المتوسط ​​من 10 - 12 مثل هذه المحاكمات، التي تمت تصفيتها أيضا عادة في المكان والزمان لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.

7. تشريح الإقليمية للتحليلات كيميائية حيوية

1. إزالة الدماغ من الماوس كما هو موضح سابقا.
2. إعداد شرائح باستخدام المروحية الأنسجة.
3. وضع القسم مسطحة، microdissect المنطقة CA1 وDG.
4. تزج فورا في مثبط البروتياز تحلل العازلة التي تحتوي على. تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

8. ممثل النتائج

وعادة ما تبدأ تجاربنا مع البيانات السلوكية لتأكيد نتوقعإد العجز المعرفي التي توجد في الدماغ المصاب الفئران. نحن توظيف السياقية استجابة الخوف مكيفة الاختبار كما هو السلوك قرن آمون التابعة التي يمكن الاعتماد عليها، ويتطلب واحد فقط دورة تدريبية ودورة واحدة الاختبار. البيانات المصورة في الشكل 2 يمثل اختبار لقياس الذاكرة السلوكية تقدمي، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم اختبار لقياس الذاكرة إلى الوراء إذا تم تنفيذ الدورة التدريبية قبل وقوع الإصابة.

يتم قياس الحقل إمكانات بعد المشبكي مثير (fEPSPs) لتحديد مدى فعالية صافي متشابك من عدد كبير من الخلايا (الشكل 3A). نحن توظيف عادة ثلاثة أنواع مختلفة من أنماط التحفيز، وتكفل كل النتائج والاستنتاجات الخاصة بها. أولا، عن طريق زيادة كثافة التحفيز من خلال سلسلة من الخطوات، ونحن خلق منحنى الإدخال / الإخراج (الشكل 3B / C).

المقبل، من خلال تقديم التحفيز 2 من نفس كثافة منفصلةد من تأخير قصيرة (عادة 50 ميللي ثانية) ونحن التحقيق في التعديلات المحتملة في حويصلة متشابك احتمال الافراج؛ بالإضافة إلى ذلك، فإننا غالبا ما تؤدي على المدى الطويل التقوية (LTP) التجارب. بعد إنشاء خط الأساس استجابة، قصيرة التحفيز عالية التردد (100Hz عادة) في نفس كثافة يتم تسليم، مما تسبب في سلسلة الخلايا التي تؤدي إلى استجابة متشابك potentiated عندما يتم استئناف التحفيز الطبيعي.

فرضت التصحيح النشاط الكهربائي من خلية كاملة يمكن تسجيلها الخلايا في وضعين. في وضع المشبك الجهد، والجهد مجرب تسيطر على غشاء الخلية من التصحيح فرضت في إشارة إلى حمام، عن طريق برامج الكمبيوتر المرتبطة مكبر للصوت. في هذه الحالة يتم تسجيل الأحداث التيارات الوساطة بعد المشبكي، وتوفير المعلومات حول الافراج تردد قبل المشبكي، عدد مستقبلات بعد المشبكي تنشيط وتركيز حويصلي العصبي (الشكل 4A). في الوضع الحالي المشبك المجربحقن يتلاعب الحالية ويقيس استجابة الجهد. وهذا يمكن أن يكون مفيدا لتحديد خصائص العمل المحتملة، مثل عتبة العمل المحتملة ونصف العرض. هذه الخصائص تسمح لتصنيف وظيفي للخلايا العصبية المثبطة ومثير أو استنادا إلى أنماط عملها اطلاق المحتملة (الشكل 4B). من أجل التحقق من هوية الخلوية نوصي ملء الخلايا مع الأصفر لوسيفر بعد التسجيل والهوية مؤكدا بصريا من خلال وجود أو عدم وجود العمود الفقري شجيري. (الشكل 4C، D).

وصفت مثالا على النتائج من تجربة تستخدم صبغة حساسة الجهد لقياس التغيرات في التيار الكهربائي غشاء في الشكل 5. في هذه الحالة، تم وضع القطب الكهربائي محفزة في مسار ضمانات شيفر ويتم تحليل النشاط العصبي في منطقة الناتجة CA1. صبغة حساسة الجهد لا يعلم القيم المطلقة من الجهد الغشاء، ولكن بدلا رانه تغيير في التيار الكهربائي من حالة خط الأساس دون التحفيز. ومع ذلك، يمكن استخدام التحليلات المقارنة بين اثنين من شروط (مثل إصابة الدماغ تعمل مقابل الشام) لتحديد المعلمات الزمانية المكانية من التعديلات الفسيولوجية التي لا يمكن قياسها باستخدام fEPSPs أو خلية كاملة التصحيح، المشبك تسجيل.

الشكل 1. الحصين مخطط الرسم البياني. قسم الأفقي من خلال الحصين. يتم عرض الممرات الرئيسية عن طريق الحصين في الصفراء. محاور عصبية من الخلايا العصبية في القشرة المخية الأنفية الداخلية عن طريق مشروع مسار الثاقب في التلفيف المسنن تشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع التشعبات من الخلايا الحبيبية التلفيف المسنن. مشروع الحبيبية محاور عصبية الخليوي عبر مسار الألياف المطحلب لCA3 حيث تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع التشعبات من CA3 الخلايا العصبية. محاور عصبية من الخلايا العصبية CA3 المشروع عبر الممر الجانبي شيفر على أن dendritوفاق من الخلايا الهرمية CA1. محاور عصبية من الخلايا الهرمية CA1 المشروع من خلال مرفد الحصين. ملاحظة: يوجد أيضا في تصور CA3 الهرمي الضمانات محوار الخلية إلى إسقاط الحصين المقابل عبر الخمل. (CA1: قرن آمون 1، CA2: قرن آمون 2، CA3: قرن آمون 3، DG: التلفيف المسنن، خط متقطع يدل على طبقة الخلايا الجسم، خط متصل يشير الحدود الهيكلية.)

الشكل 2. البيانات السلوكية ممثل A:. البيانات السلوكية التي تصور الفرق في معدلات تجميد الدماغ المصاب بين الفئران (FPI) والشام التي تديرها عناصر التحكم (الشام) في نموذج الخوف استجابة مشروطة. حدث التدريب على إصابة ^عشرة يوم 6 التالية، مع فترة الاختبار التي تحدث 24 ساعة في وقت لاحق. (** يدل على p <.01.)

الشكل 3. ممثل تسجيل البيانات خارج الخلية A:. مثال على إمكانية الميدان بعد متشابك مثير (fEPSP) في منطقة تسجيل CA1. 1 الانحراف نحو الانخفاض هو الأداة التحفيز، تليها تسديدة الألياف قبل المشبكي وfEPSP أخيرا. B: الإدخال / الإخراج منحنيات تصور انخفاض في صافي متشابك فعالية في CA1 إصابة قرع السائل التالية (FPI). C: الإدخال / الإخراج منحنيات تصور زيادة في صافي متشابك فعالية في التلفيف المسنن (DG) بعد FPI. (* تشير إلى P <.05). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4. ممثل خلية كاملة التصحيح، المشبك البيانات A:. مثال عفويةإثاري الحالي بعد المشبكي (sEPSC) من خلية الهرمية CA1. B: أمثلة من القطارات عمل محتمل من خلية الهرمية CA1 (التتبع العليا) وارتفاعه بسرعة CA1 عصبون (أقل التتبع). شغل مثال لوسيفر صفراء CA1 عصبون المثبطة: C. لاحظ عدم وجود العمود الفقري شجيري (اللوحة العليا). مثال لشغل صفراء لوسيفر CA1 الخلايا العصبية الهرمية: D. ملاحظة وجود العمود الفقري شجيري (اللوحة العليا). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5. الجهد الحساسة ممثل بيانات التصوير صبغ A:. ماوس شريحة الحصين الاكليلية عرض لاظهار التشريح. (DG: التلفيف المسنن، CA1: قرن آمون 1) B: أصفر أحمر إلى بكسل تمثل النشاط مثير في منطقة CA1 14 ميللي ثانية بعد ارد التحفيز ضمانات شيفر. الأحمر فيdicates أكثر إزالة الاستقطاب بينما الأصفر يشير إلى إزالة الاستقطاب أقل، ولكن لا تزال كبيرة. C: بكسل الأزرق تمثل مواقع النشاط المثبطة في المنطقة CA1 56 ميللي ثانية بعد نفس ارد التحفيز ضمانات شيفر تظهر باللون الأزرق يشير إلى أكثر قتامة B. فرط الاستقطاب.

Discussion

كل تقنية المبينة أعلاه يسهم في فهم أفضل لآلية الكامنة يسبب العجز الملحوظ السلوكية. من خلال الجمع بين المعلومات الفريدة المكتسبة من كل أسلوب ونحن قادرون على دراسة الآليات البيولوجية بمزيد من الدقة.

fEPSPs قياس مفيد لقياس فعالية صافي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم المعدات	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
Axopatch 200B مكبر للصوت	الجزيئية الأجهزة	AXOPATCH 200B	المشبك التصحيح تلاعب
Digidata 1322A التحويل الرقمي	الجزيئية الأجهزة		المشبك التصحيح تلاعب
MP-225 مياداة مجهرية	سوتر	MP-225	المشبك التصحيح تلاعب
DMLFSA المجهر	لايكا		المشبك التصحيح تلاعب
Multiclamp مكبر للصوت 700B	الجزيئية الأجهزة	MULTICLAMP 700B	متعددة الأغراض (حقل)تلاعب
Digidata 1440 التحويل الرقمي	الجزيئية الأجهزة		Multipurpos (حقل) تلاعب
MPC-200 مياداة مجهرية	سوتر	MPC-200	متعددة الأغراض (حقل) تلاعب
BX51WI المجهر	OLYMPUS	BX51WI	متعددة الأغراض (حقل) تلاعب
Axoclamp مكبر للصوت 900A	الجزيئية الأجهزة	AXOCLAMP 900A	VSD تلاعب
Digidata 1322 التحويل الرقمي	الجزيئية الأجهزة		VSD تلاعب
القميص الأحمر كاميرا CCD-SMQ	القميص الأحمر	NCS01	VSD تلاعب
VT 1200S Vibratome	لايكا	14048142066
P-30 مجتذب الكهربائي	سوتر	P-30 / P
استكمال البروتيني المثبط	روش	11697498001