إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4

Summary

وقد تم قياس مساهمة إعادة عرض لونين ACF عامل إلى موت الخلايا التي يسببها E4orf4. أن البروتوكول تضمن مجموعة من الحيوانات المستنسخة الخلية التي الدوكسيسيكلين العلاج يدفع الشرطي ضربة قاضية للAcf1 مفارز ACF وSNF2h، واستخدام الفحص دابي لقياس E4orf4 التي يسببها موت الخلايا في خطوط الخلايا محرض.

Abstract

تعطيل وظيفية في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أمر بالغ الأهمية لدراسة مساهمة بروتين التي تهم ^1،2 مسارات مختلفة. ومع ذلك، هناك حاجة ضربة قاضية المشروطة في التعبير الجيني في الحالات التي لا يمكن تحمله من قبل خلايا التأسيسي ضربة قاضية لفترة طويلة من الزمن ^3-5. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد خطوط الخلايا السماح المشروط ضربة قاضية من مفارز من إعادة عرض لونين ACF عامل. هذه خطوط الخلايا تسهيل تحديد مساهمة ACF لتحريض موت الخلايا من البروتين اتش E4orf4 ^6. والمستنسخة متواليات ترميز الرناوات دبوس الشعر القصير للمفارز Acf1 وSNF2h من إعادة عرض لونين ACF عامل بجوار المروج الدوكسيسيكلين-محرض في البلازميد التي تحتوي على الجين أيضا لالنيوميسين الجينات المقاومة. وقد تم اختيار استنساخ الخلية مقاومة للالنيوميسين في وجود G418 ومعزولة. وقد حثت على خطوط الخلايا الناتجة منالدوكسيسيكلين العلاج، ومرة ​​واحدة أو Acf1 تم تخفيض مستويات التعبير SNF2h، وتقاس الخلايا مع ترميز البلازميد E4orf4 أو متجه فارغة. لتأكيد الأثر المحدد للبنيات shRNA، تم استعادة مستويات البروتين Acf1 أو SNF2h إلى مستويات WT بواسطة cotransfection مع Acf1 البلازميد أو التعبير عن SNF2h التي صدرت مقاومة للshRNA بواسطة إدخال الطفرات الصامتة. تم تحديد قدرة E4orf4 للحث على موت الخلايا في عينات مختلفة من الفحص دابي، والتي تم قياس تواتر ظهور نواة الأشكال التضاريسية مع أفكارك في عدد السكان الخلية بالنقل ^7-9.

ويمكن استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتينات مختلفة لتحريض من قبل الشركاء موت الخلايا البروتين في الحالات التي قد يكون ضربة قاضية التأسيسي الخلية القاتلة.

Protocol

1. جيل من خطوط الخلايا محرض

1. قبل التجربة يحتاج المرء للبحث عن تركيز الحد الأدنى من G418 المخدرات التي تقتل كل الخلايا المستخدمة لإعداد خطوط الخلايا المطلوب. لهذا الغرض، لوحة الخلايا المفضل في لوحات مكررة عدة في confluency 70٪ في المتوسط ​​التي سيتم استخدامها أثناء التجربة وإضافة زيادة تركيزات G418 (0-1،000 ميكروغرام لكل مل). رصد الخلايا اليومية لتحديد الحد الأدنى من تركيز G418 الذي يقتل الخلايا بكفاءة. لوحظ موت الخلايا في غضون 3-7 أيام.
2. قبل جيل من خطوط الخلايا فمن المستحسن للتحقق من المقايسات ترنسفكأيشن عابرة أن البلازميد معربا عن shRNA يمكن أن تقلل إلى حد التعبير بعض من الجين قيد الدراسة. ويمكن أن يتم ذلك في أي خط الخلية التي يمكن تقاس كفاءة.
3. لوحة T-REX-293 خلايا في مناطق ذات كثافة حوالي 5x10 ⁶ خلايا في طبق 10 سم في 8 مل من DMEM المتوسطة (تحتوي على 10٪ تيت سيFBS الجذعية المعتمدة، 2mm والجلوتامين L-، 100 وحدة في البنسلين مل و 0.1 ملغ لكل مل الستربتوميسين، 5 ميكروغرام لكل blasticidin مل). احتضان لوحات ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2.
4. في اليوم التالي، تغيير المتوسطة والمتوسطة مل 8 الطازجة قبل ترنسفكأيشن.
5. بالنقل الخلايا باستخدام 10 ميكروغرام من GFP البلازميد + pSuperior.neo Acf1 الترميز (الشكل 1) أو shRNA SNF2h يقودها المروج H1-التتراسيكلين محرض، وكذلك الجينات المقاومة النيوميسين تنصهر لGFP ويقودها المروج PGK التأسيسي. إضافة DNA إلى 500 ميكرولتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. إضافة كاشف jetPIE إلى آخر قسامة من 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 150 ملم في 2 ميكرولتر لكل DNA ميكروغرام. إضافة إلى حل jetPIE DNA وتخلط جيدا بواسطة vortexing. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة بلطف المجمعات DNA على لوحات تحتوي على 10 سم الخلايا متموجة 70-80٪. العودة إلى لوحات الحاضنة.
6. في اليوم التالي مع استبدال المتوسطة وسيلة انتقائية (DMEM المتوسطة كماالمذكورة أعلاه تحتوي على 500 ميكروغرام لكل إضافية G418 مل).
7. لالاسبوعين المقبلين رصد الخلايا واستبدال المتوسطة انتقائية مع وسيط جديدة مماثلة كل 3-4 أيام حتى تظهر المستعمرات ويمكن تصور دون المجهر.
8. قبل عزل المستعمرات، وإعداد 24 لوحات جيدة مع متوسط ​​انتقائية.
9. تحديد المستعمرات بالعين، ووضع علامة موقعها في الجزء السفلي من لوحة باستخدام علامة ملونة. تحقق تحت المجهر التي تكون مفصولة جيدا المستعمرات.
10. في غطاء محرك السيارة العقيمة، نضح المتوسطة من لوحة، وشطف بلطف مع PBS الحارة ونضح جيدا في جميع السائل المتبقي. إضافة 3 ميكرولتر من التربسين 0.25٪ / EDTA واحدة على لوحة مستعمرة. ماصة للالتربسين بشكل متكرر إلى أن الخلايا فصل وإضافتها إلى واحدة من الآبار في 24 لوحة جيدا. كرر هذا لعدد آخر من المستعمرات على لوحة.
11. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ حتى ملء البئر. أدى ذلك إلى انقسام الخلايا المشتقة منكل من المستعمرات الأصلية إلى ثلاث آبار، كل في لوحة منفصلة 12-جيدا، واحتضان بين عشية وضحاها.
12. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة في لوحة واحدة مع المتوسط ​​تحتوي على 1 ميكروغرام لكل مل الدوكسيسيكلين من محلول المخزون أعد نقرا مزدوجا الماء المقطر (1-5 ملغ لكل مل). استبدال المتوسطة في لوحة التحكم مع وسيط وبدون الدوكسيسيكلين. احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2.
13. الحصاد من الخلايا المعالجة غير المعالجة بشكل جيد وواحد من كل خلية استنساخ لإعداد مستخلصات البروتين وتحليل لطخة غربية لتحديد كفاءة Acf1 أو ضربة قاضية SNF2h. استخدام أجسام مضادة لAcf1 أو SNF2h وكذلك الأجسام المضادة لتويولين ألفا، يخدم كعنصر تحكم التحميل. غادر استخدام الخلايا في الثلث أيضا، غير المعالجة، لتوسيع استنساخ الخلية المحددة التي أدت إلى الدوكسيسيكلين بالإضافة إلى ذلك الحد لا يقل عن 50٪ في مستوى البروتين قيد الدراسة. تجميد هذه الخلايا مأخوذة في DMSO 90٪، 10٪ FBS لاستخدامها مرة أخرى.

2. تحريض ضربة قاضية وترنسفكأيشن

1. لوحة الخلايا في المتوسط ​​انتقائية في لوحات 10 سم. إضافة الدوكسيسيكلين في 1 ميكروغرام لكل مل لوحات النصف واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ ل48-72 ساعة (انظر الشكل 4).
2. بعد 48-72 ساعة، يعرض للتريبسين الخلايا من كل مجموعة من الخلايا، عد لهم، وصفيحة 1.5x10 ⁶ خلايا في لوحة 6 سم في المتوسط ​​نفسه، مع أو بدون الدوكسيسيكلين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ ₂ CO بين عشية وضحاها. خطة بحيث كل مجموعة لوحات من القسم 2.1 تزويد الخلايا لمدة اثني عشر لوحات الطول 6، بينهم اثنان من التكرارات لفحص دابي لكل نقطة، وكذلك لوحة واحدة للتحليل لطخة غربية من كل عينة (انظر الشكل 4).
3. في اليوم التالي بالنقل الخلايا في لوحات 6 سم مع المجموعات التالية من البلازميدات: 1 ميكروغرام من البلازميد فارغة أو كمية مماثلة من الترميز البلازميد E4orf4، جنبا إلى جنب مع 4 ميكروغرام من ناقلمعربا عن GFP-Acf1 أو SNF2h GFP-المقدمة مقاومة للshRNA في استنساخ الخلية عن طريق إدخال الطفرات الصامتة، أو 3 ميكروغرام من ناقلات الفارغة المقابلة و1 ميكروغرام بلازميد معربا عن GFP (الشكل 4). استخدام كاشف jetPIE كما هو موضح أعلاه (10 ميكرولتر لكل DNA ميكروغرام 5) لإعداد مزيج ترنسفكأيشن. لكل عينة، وإعداد مزيج لمدة ثلاث لوحات ترنسفكأيشن.
4. بعد 15 دقيقة من الحضانة DNA مع كاشف jetPIE في درجة حرارة الغرفة، ماصة بلطف كميات متساوية من المجمعات DNA من كل مزيج ترنسفكأيشن على ثلاث لوحات 6 سم واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ ₂ CO بين عشية وضحاها.

3. دابي الفحص في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل

1. في اليوم التالي، واستخراج البروتينات من لوحة واحدة لكل عينة للتحليل لطخة غربية لتحديد التي تم Acf1 أو SNF2h طرقت إلى أسفل وبكفاءة أن أعرب عن E4orf4 على قدم المساواة في عينات مختلفة.
2. نضح المتوسطة من لوحات مخصصة للدابيمقايسة، تغسل الصحون بلطف مع PBS وإضافة 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ يحضر في برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا. ينبغي أن يتم إعداد بارافورمالدهيد الحل والعلاج من الخلايا مع هذه المادة الكيميائية في غطاء الكيميائية. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز.
3. نضح في بارافورمالدهيد ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في كل مرة. إضافة الإيثانول 80٪ الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية واحتضان -20 درجة مئوية في مدة لا تقل عن 1 ساعة. يمكن أن تظل لوحات تحت الإيثانول في -20 درجة مئوية لمدة عدة أيام طالما مغلقة بشكل جيد لمنع التبخر والتجفيف الإيثانول.
4. نضح في الإيثانول وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع PBS-BT (PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.05٪ توين 20)، هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في كل مرة.
5. لمنع غير محددة وملزمة الأجسام المضادة، منع الخلايا في 1 عازلة PBS-BT مل تحتوي على 10٪ مصل الماعز لمدة 20 دقيقة في حين تعصف في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل رانه الخلايا مرتين في PBS-BT، 5 دقائق كل غسل.
6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (جسم مضاد E4orf4 محددة في حالتنا) في 1 مل PBS-BT: 1 ساعة بينما تعصف في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرتين في PBS-BT ومرة ​​واحدة في PBS تحتوي على 0.1٪ BSA، 5 دقائق كل غسل.
7. احتضان الخلايا في 1 مل من BSA PBS-0.1٪ يحتوي على الأجسام المضادة المناسبة الثانوية fluorescently-صفت و0.5 ميكروغرام لكل مل تركيز النهائي من دابي لمدة 40 دقيقة في حين تعصف في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم تغسل مع PBS لمدة 5 دقائق، تجف بشكل جيد من قبل تطلع والحفاظ على لوحات رأسا على عقب لمدة ساعة إضافية ليلة وضحاها لتحقيق التجفيف الكامل. ثم تحميل الشرائح غطاء على الخلايا، وذلك باستخدام Fluoromount-G الحل. الحفاظ على لوحات في 4 في الظلام C ° حتى على استعداد لحساب نوى أفكارك.
8. أسأل الزميل لتحديد لوحات الأرقام الجديدة المختلفة عن طريق، عد ذلك نوى أفكارك في العينات المختلفة ويمكن أن يتم بطريقة غير متحيزة.
9. تصور الخلايا تحت شالمجهر الفلورسنت pright في التكبير 400X من (في الهواء) أو 630X (الغمر في النفط). تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل التي الملون لمختلف البروتينات التي أعرب عنها في كل عينة، وحساب عدد النوى المختصرة أو مجزأة تصور من تلطيخ دابي بين السكان الخلية بالنقل. رصد العديد من المجالات والاعتماد على ما لا يقل عن 200 خلية بالنقل.
10. حساب النسبة المئوية من نوى مع مورفولوجيا أفكارك بين السكان الخلية بالنقل. تكرار التجربة، مع التكرارات، 2-3 مرات لحساب الدلالة الإحصائية بين التغيرات عينات مختلفة.

4. ممثل النتائج

كفاءة المستعمرات الحصول على ضربة قاضية التي المشروط في التعبير الجيني كان ناجحا هو متغير، اعتمادا على الجينات المعنية. في أيدينا، حصلنا على 7 المستعمرات ناجحة من أصل 12 اختبار Acf1 و 6 من أصل 18 لSNF2h. الشكل 2 SHOWS لوحة ممثل استنساخ الخلية المحددة (الشكل 2A)، وكذلك مستعمرة واحدة (الشكل 2B). ويبين الشكل 3 وصمة عار ممثل أعدت مع البروتينات المستخرجة من خلايا مختلفة من الحيوانات المستنسخة التي تزرع في وجود أو عدم وجود الدوكسيسيكلين لمدة 72 ساعة. وصمة عار تلطخ مع الأجسام المضادة لSNF2h وتويولين ألفا، يخدم كعنصر تحكم التحميل. وأظهرت اثنين من الحيوانات المستنسخة (عدد 4 و 5) انخفاض في مستويات قوية SNF2h على تحريض الدوكسيسيكلين. تجدر الإشارة إلى أنه بالرغم من أن pSuperior.neo + GFP البلازميد (الشكل 1) تستخدم لتوليد خطوط الخلايا بترميز بروتين GFP الانصهار الجدد، ومضان أخضر في خطوط الخلايا مستقرة ومنخفضة جدا والتعبير عن غيرها من البروتينات الانصهار GFP ويمكن إدخال هذه الخلايا في عابر الكشف بسهولة فوق خلفية خضراء مضان.

أجري التمثيل التخطيطي للتجارب في استنساخ الخلية لشركة طيران الشرق الأوسطتأكد يظهر تأثير Acf1 أو SNF2h ضربة قاضية على موت الخلايا التي يسببها E4orf4 في الشكل. 4. يمكن الوقت اللازم لضربة قاضية في التعبير الجيني عن طريق العلاج الدوكسيسيكلين تختلف تبعا للاستقرار مستويات البروتين التي ينبغي تخفيض. لAcf1 وSNF2h، كانت هناك حاجة إلى علاج 72 للساعة ضربة قاضية على مستوى كفاءة البروتين.

ويبين الشكل 5 مثال على الخلايا معربا عن GFP E4orf4 وتمر موت الخلايا وتتجلى بظهور دابي الملطخة نوى مع التشكل المكثف أو مجزأة. الشكل 6 يبين نتائج تجربة تدل على أن ممثل الدوكسيسيكلين التي يسببها Acf1 ضربة قاضية أدت إلى زيادة في E4orf4 في حفز موت الخلايا (الشكل 6A). لم هذه الزيادة لا تنجم عن زيادة في مستويات E4orf4 (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، تضاءلت استعادة Acf1 إلى الخلايا التي يسببها الدوكسيسيكلين الزيادة في E4orf4 إلى مستويات سمية لوحظ في خلايا uninduced (الشكل 6).

الشكل 1. خريطة للGFP البلازميد + pSuperior.neo. وتظهر الخارطة المروج H1-التتراسيكلين محرض القيادة shRNA التعبير والتعبير المروج PGK الدافعة للبروتين GFP الانصهار الجدد. تم تعديل الخريطة من دليل pSuperior OligoEngine.

الشكل 2. تحديد النيوميسين مقاومة للمستعمرات. صور من لوحة تحتوي على المستعمرات (A) ومستعمرة واحدة (B) أظهرت و. تم الحصول على المستعمرات بواسطة زراعة الخلايا لمدة 14 يوما في المتوسط ​​تحتوي على النيوميسين انتقائية.

YS ">
الشكل 3. كانت مطلية فحص كفاءة ضربة قاضية في المستعمرات المحدد. خلايا من عدة مستعمرات في تحديد وجود النيوميسين في الآبار مكررة. كان المستحث واحد من كل عينة بشكل جيد من قبل الدوكسيسيكلين (+) وبئر واحد وتركت دون علاج (-). تم استخراج البروتينات 72 ساعة بعد الاستقراء وونيا على SDS-PAGE. وملطخة طخة غربية على التوالي مع الأجسام المضادة لSNF2h وتويولين ألفا (العامل بوصفه عنصر تحكم التحميل) ويظهر مستويات SNF2h في الخلايا المستحثة والسيطرة عليها.

الشكل 4. تخطط لتجربة نموذجية مقايسة ضربة قاضية-دابي. تظهر الخطوات المتعاقبة من التجربة، بما في ذلك العلاج الدوكسيسيكلين لتحقيق Acf1 أو ضربة قاضية SNF2h، وهو ترنسفكأيشن لاستعادة Acf1 أو SNF2h التعبير أو إدخال خطة الإدارة البيئيةTY ناقلات وإدخال E4orf4 أو ناقلات الفارغة المقابلة في الخلايا، وتحليل النتائج. وتظهر لوحات الدوكسيسيكلين المعالجة باللون الأحمر (دوكس) ويتم وضع علامة لوحات التحكم في الزرقاء. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5. تم إصلاح الكشف عن موت الخلايا التي يسببها E4orf4 بواسطة الفحص دابي. خلايا التي خضعت لعلاجات مختلفة وصفها في الشكل 4 وملطخة E4orf4 محددة الأجسام المضادة ودابي لتصور نوى الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. لقد التقطت هذه الصورة محددة من العينة التي تحتوي على E4orf4 والبروتين GFP السيطرة. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) دابي. (D) الصور المدمجة. الأسهم البيضاء علامة GFP وE4orf4-بالنقل الخلايا التي تحتوي على نواة الأشكال التضاريسية مع أفكارك. السهام الحمراءبمناسبة النوى ذات الأشكال غير النظامية التي لا تحصى كما نوى أفكارك. العلامات النجمية أو علامة نوى نوى الإنقسامية التي قسمت فقط.

الشكل 6. Acf1 ضربة قاضية يعزز E4orf4 التي يسببها موت الخلايا. (A) وقد حثت خلايا من خط خلية T-REX-293-مشتقة معربا عن Acf1-shRNA من المروج التتراسيكلين، الدوكسيسيكلين مع محرض (+ دوكس) أو تركت دون علاج (دوكس). بعد ثلاثة أيام، وتقاس الخلايا مع البلازميدات التعبير عن E4orf4 (+ E4orf4) أو متجه فارغة (-E4orf4) جنبا إلى جنب مع ناقلات الفارغة أو Acf1 بلازميد معربا عن GFP الموسومة، والتي صدر مقاومة للshRNA من خلال إدخال الصمت الطفرات. تم إصلاح الخلايا أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن والملون مع الأجسام المضادة لE4orf4 ومع دابي. وقد تم قياس تحريض موت الخلايا عن طريق الفحص دابي المذكورة أعلاه ونسبة سو تم تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع نوى المختصرة أو مجزأة. A التجربة مع ممثل ثلاث مكررات يظهر، وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. (B) الخلايا تم حصادها من لوحات موازية للتحليل لطخة غربية. وصمة عار تلطخ مع الأجسام المضادة لE4orf4، GFP، وAcf1. يتم عرض Acf1 الذاتية وAcf1 GFP في فريقين منفصلين.

Discussion

ضربة قاضية للتعبير جين معين هو مدخلا مهما لتحقيق مساهمة بروتين لمسارات التنظيمية. منذ ضربة قاضية التأسيسي للتعبير عن الجينات الأساسية يؤثر سلبا على تكاثر الخلايا، قد تتطلب دراستهم إما مقدمة من siRNAs عابرة أو تطبيق أنظمة مستقرة ضربة قاضية الشرطي. جيل من خطوط الخلايا مس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
ارتفاع الجلوكوز DMEM	Gibco	41965
تيت النظام المعتمد FBS	Clontech	631106
الجلوتامين L-	Gibco	25030
القلم بكتيريا	Gibco	15140
0.25٪ التربسين EDTA-	Gibco	25200
T-REX-293 الخلايا	إينفيتروجن	R710-07
G418	سيجما	A1720
blasticidin	Invitروجن	R210-01
+ GFP البلازميد pSuperior.neo	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus ترنسفكأيشن	101-40
الدوكسيسيكلين	سيجما	D9891
بارافورمالدهيد	علوم المجهر الإلكتروني	15710
4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي)	سيجما	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01