Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Zusammenfassung

Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Zusammenfassung

Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugetierzellen ist für die Untersuchung der Beitrag eines Proteins von Interesse, um verschiedene Bahnen ^1,2. Jedoch wird bedingten Knockdown der Genexpression in Fällen erforderlich, wenn konstitutive Knockdown nicht durch Zellen für einen langen Zeitraum ^3-5 toleriert. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Zelllinien erlaubt bedingten Knockdown Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor. Diese Zelllinien erleichtern die Bestimmung des Beitrags von ACF, um die Induktion des Zelltodes durch das Adenovirus-Protein E4orf4 ^6. Sequenzen, die für kurze Haarnadel RNAs und für die Acf1 SNF2h Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor wurden neben einer Doxycyclin-induzierbaren Promotors in einem Plasmid auch ein Gen enthält, das für Neomycin-Resistenz-Gen kloniert. Neomycin-resistente Zellklone wurden in Gegenwart von G418 und getrennt ausgewählt. Die resultierenden Zelllinien wurden durch induzierteDoxycyclin-Behandlung, und einmal Acf1 oder SNF2h Expressionsniveaus wurden reduziert, wurden die Zellen mit einem Plasmid E4orf4 oder einem leeren Vektor transfiziert. Um die spezifische Wirkung der shRNA Konstrukte zu bestätigen, wurden Acf1 oder SNF2h Proteinniveaus zu WT Ebenen durch Kotransfektion mit einem Plasmid exprimieren Acf1 oder SNF2h die gegen das shRNA gemacht wurden durch Einführen stiller Mutationen wiederhergestellt. Die Fähigkeit von E4orf4 zum Zelltod in den verschiedenen Proben zu induzieren, wurde durch eine DAPI-Assay, in dem die Häufigkeit des Auftretens von Keimen mit apoptotischen Morphologien in der transfizierten Zellpopulation ^7-9 gemessen wurde.

Die hier beschriebene Protokoll kann zur Bestimmung der funktionellen Beitrag verschiedener Proteine, um die Induktion des Zelltods durch ihre Proteinpartner in Fällen verwendet werden, wenn konstitutive Knockdown-Zelle tödlich sein kann.

Protokoll

Ein. Generation der induzierbaren Zelllinien

1. Vor dem Experiment muss man die minimale Konzentration des Wirkstoffs G418, die alle Zellen zur Herstellung der gewünschten verwendeten Zelllinien tötet finden. Hierzu Platte, die Zellen der Wahl in mehreren doppelten Platten bei 70% Konfluenz in dem Medium, das während des Experiments verwendet wird und fügen steigenden Konzentrationen von G418 (0-1.000 pg pro ml). Überwachen Sie die Zellen täglich die minimale G418-Konzentration, die die Zellen abtötet effizient zu bestimmen. Zelltod wird innerhalb von 3-7 Tagen beobachtet.
2. Vor der Erzeugung von Zelllinien es empfehlenswert, durch transiente Transfektion Assays zu überprüfen, dass das Plasmid Exprimieren des shRNA kann in gewissem Maße die Expression des Gens in Untersuchung zu reduzieren. Dies kann in jeder Zelllinie, die transfiziert werden können effizient durchgeführt werden.
3. Platte T-Rex-293 Zellen in einer Dichte von etwa 5x10 ⁶ Zellen pro 10 cm Platte in 8 ml DMEM-Medium (enthaltend 10% Tet syStamm zugelassenen FBS, 2mM L-Glutamin, 100 Einheiten pro ml Penicillin und 0,1 mg pro ml Streptomycin, 5 ug pro ml Blasticidin). Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO _2.
4. Am folgenden Tag, ändern Sie die mittel-bis 8 ml frisches Medium vor der Transfektion.
5. Transfizieren die Zellen unter Verwendung von 10 ug pSuperior.neo + GFP-Plasmid (Abbildung 1) bzw. kodierenden Acf1 SNF2h shRNA durch ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor H1 sowie das Neomycin-Resistenz-Gen fusioniert an GFP und angetrieben durch einen konstitutiven Promotor PGK angetrieben. Fügen Sie die DNA zu 500 ul 150 mM NaCl. Fügen Sie den jetPIE Reagenz zu einem anderen Aliquot von 500 ul 150 mM NaCl bei 2 ul pro ug DNA. Fügen Sie den jetPIE Lösung der DNA und gut mischen durch Vortexen. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. Gently pipettieren DNA-Komplexe auf die 10 cm-Platten mit 70-80% konfluenten Zellen. Bringen Sie die Platten in den Inkubator.
6. Am nächsten Tag ersetzt des Mediums mit einem selektiven Medium (DMEM Mediumoben beschrieben mit einer zusätzlichen 500 ug pro ml G418).
7. Für die nächsten zwei Wochen zu überwachen, die Zellen und ersetzen die selektive Medium mit einem ähnlichen frisches Medium alle 3-4 Tage bis Kolonien erscheinen und kann ohne Mikroskop sichtbar gemacht werden.
8. Vor der Isolierung von Kolonien, bereiten 24-Well-Platten mit selektivem Medium.
9. Identifizieren Kolonien durch Auge und markieren ihre Lage an der Unterseite der Platte mit einer farbigen Markierung. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Kolonien gut getrennt sind.
10. In der sterilen Haube, saugen das Medium von der Platte, sanft mit warmem PBS spülen und absaugen auch alle restliche Flüssigkeit. Add 3 ul von 0,25% Trypsin / EDTA, um eine Kolonie auf dem Teller. Pipettieren Sie die Trypsin wiederholt, bis die Zellen lösen und fügen Sie sie in einem der Brunnen in der 24-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für einige andere Kolonien auf der Platte.
11. Wachsen die Zellen bei 37 ° C, 5% CO _2, bis sie die gut zu füllen. Dann teilen Sie die Zellen, abgeleitet ausjedes der ursprünglichen Kolonien in drei Vertiefungen, die jeweils in einem separaten 12-Well-Platte, und über Nacht inkubieren.
12. Am folgenden Tag, ersetzen Sie das Medium in einer Platte mit Medium mit 1 g pro ml Doxycyclin aus einer Stammlösung in doppelt destilliertem Wasser (1-5 mg pro ml) hergestellt. Ersetzen des Mediums in einer Steuerplatte mit Medium ohne Doxycyclin. Inkubieren der Zellen für 72 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.
13. Ernte Zellen von einer behandelten und unbehandelten auch ein jedes Zellklon zur Herstellung von Protein-Extrakten und Western-Blot-Analyse, um die Effizienz bzw. Acf1 SNF2h Knockdown bestimmen. Verwenden Antikörper gegen Acf1 oder SNF2h sowie Antikörper gegen alpha-Tubulin, dient als Ladekontrolle. Mit den Zellen in der dritten Wanne, unbehandelt, zum Ausbau der ausgewählten Zellklone, in denen Doxycyclin neben mindestens 50% ige Reduktion im Niveau des Proteins unter Studie führte. Einfrieren Aliquots dieser Zellen in 90% FBS, 10% DMSO zur weiteren Verwendung.

2. Induktion von Knockdown und Transfektion

1. Platte Zellen in dem selektiven Medium in 10 cm-Platten. Fügen Doxycyclin bei 1 ug pro ml, die Hälfte der Platten und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 48-72 h (siehe Abbildung 4).
2. Nach 48-72 h, trypsinieren die Zellen aus jeder Gruppe von Zellen, die zähle, und die Platte 1.5x10 ⁶ Zellen pro 6 cm Platte in dem gleichen Medium, mit oder ohne Doxycyclin. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht. Planen Sie so, dass jede Gruppe von Platten aus Abschnitt 2.1 werden die Zellen für zwölf 6 cm Platten, darunter zwei Duplikate für die DAPI-Assay für jeden Punkt als auch eine Platte für Western-Blot-Analyse jeder Probe (siehe Abbildung 4) liefern.
3. Am folgenden Tag transfizieren die Zellen in 6 cm Platten mit den folgenden Kombinationen von Plasmiden: 1 ug eines leeren Plasmid oder eine identische Menge des Plasmids kodiert E4orf4 zusammen mit 4 g eines Vektorsexprimieren Acf1-GFP oder SNF2h-GFP resistent gemacht zur shRNA in der Zellklone durch Einführen stiller Mutationen oder 3 ug des entsprechenden leeren Vektor und 1 ug Plasmid GFP exprimieren (Abbildung 4). Verwenden des jetPIE Reagenz, wie oben beschrieben (10 ul pro 5 ug DNA), die Transfektionsgemisch vorzubereiten. Für jede Probe, bereiten eine Transfektion Mix für drei Platten.
4. Nach einer 15 min Inkubation mit dem DNA jetPIE Reagenz bei Raumtemperatur sanft pipettieren gleiche Mengen an DNA-Komplexe aus jeder Transfektion Masse auf drei 6 cm Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht.

3. DAPI Assay in transfizierten Zellen

1. Am nächsten Tag extrahieren Proteinen aus einer Platte pro Probe für die Western Blot-Analyse, um zu bestimmen, dass Acf1 oder SNF2h wurden effizient abgerissen und daß E4orf4 wurde gleichmäßig in den verschiedenen Proben exprimiert.
2. Absaugen Medium aus den Platten für die DAPI bestimmtAssay, waschen Sie die Platten vorsichtig mit PBS und 1 ml 4% Paraformaldehyd in PBS hergestellt, um die Zellen zu decken. Herstellung der Paraformaldehydlösung und Behandlung der Zellen mit diesem chemischen sollte in einer chemischen Haube erfolgen. Inkubation: 15 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln.
3. Saugen Sie die Paraformaldehyd und dreimal mit PBS, Schütteln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min. Fügen Sie 80% Ethanol bei -20 ° C und inkubieren bei -20 ° C für mindestens 1 h gehalten. Die Platten können unter Ethanol bei -20 ° C für einige Tage solange sie gut zu Ethanol Eindampfen und Trocknen verhindern abgedichtet gehalten.
4. Absaugen Ethanol und wäscht die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und einmal mit PBS-BT (PBS mit 0,5% BSA und 0,05% Tween-20), Schütteln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min.
5. Um unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, blockiert die Zellen in 1 ml PBS-BT-Puffer enthaltend 10% Ziegen-Serum für 20 min unter Schütteln bei Raumtemperatur. Dann waschen ter die Zellen zweimal in PBS-BT, jeweils 5 min waschen.
6. Inkubieren der Zellen mit dem primären Antikörper (ein E4orf4-spezifischen Antikörpers in unserem Fall) in 1 ml PBS-BT während 1 h Schütteln bei Raumtemperatur. Dann zweimal waschen in PBS-BT und einmal in PBS, enthaltend 0,1% BSA, jeweils 5 min waschen.
7. Inkubieren der Zellen in 1 ml PBS-BSA 0,1% mit der entsprechenden sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper und 0,5 ug pro ml Endkonzentration von DAPI für 40 min unter Schütteln bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dann mit PBS für 5 min waschen, trocknen und durch Absaugen und halten die Platten auf den Kopf für eine weitere Stunde bis über Nacht, um eine vollständige Trocknung zu erzielen. Dann montieren Deckgläser auf die Zellen, unter Verwendung Fluoromount-G-Lösung. Halten Platten bei 4 ° C im Dunkeln, bis bereit, den apoptotischen Kernen rechnen.
8. Stellen Sie eine Kollegin, die verschiedenen Platten durch neue Zahlen zu identifizieren, so zählen apoptotischer Kerne in den verschiedenen Proben können in eine unvoreingenommene Weise geschehen.
9. Visualisieren Sie die Zellen unter einem upright Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von 400X (in Luft) oder 630X (in Immersionsöl). Identifizieren transfizierten Zellen, die für die verschiedenen Proteine ​​in jeder Probe, ausgedrückt gefärbt sind, und die Anzahl der kondensierten oder fragmentierte Kerne visualisiert durch DAPI-Färbung innerhalb der transfizierten Zellpopulation. Überwachung mehrerer Felder und zählt insgesamt mindestens 200 transfizierten Zellen.
10. Der prozentuale Anteil von apoptotischen Kernen mit Morphologie innerhalb der transfizierten Zell-Population. Wiederholen des Versuchs, mit Dubletten, um 2-3 mal berechnen die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den verschiedenen Proben.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Effizienz der Gewinnung Kolonien in dem bedingte Knockdown der Genexpression erfolgreich gewesen ist variabel, abhängig von dem Gen beteiligt. In unseren Händen, erhalten wir 7 erfolgreiche Kolonien von 12 für Acf1 und 6 von 18 für SNF2h getestet. Abbildung 2 shows einen Vertreter Platte des ausgewählten Zellklone (2A) als auch einer einzelnen Kolonie (2B). Abbildung 3 zeigt eine repräsentative Blot mit Proteinen aus Zellen verschiedener Klone in Gegenwart oder Abwesenheit von Doxycyclin für 72 Stunden gezüchtet extrahiert hergestellt. Der Blot wurde mit Antikörpern gegen SNF2h und alpha-Tubulin angefärbt, die als eine Ladesteuerung. Zwei der Klone (Nr. 4 und 5) zeigte eine starke Verringerung SNF2h Ebenen auf Doxycyclin Induktion. Es sollte angemerkt werden, dass obwohl die pSuperior.neo + GFP-Plasmid (Abbildung 1) zur Erzeugung von den Zellinien kodiert ein neo-GFP-Fusionsprotein verwendet, war das grüne Fluoreszenz in den stabilen Zelllinien sehr gering und Expression von anderen GFP-Fusionsproteine transient in diese Zellen eingeführt konnte leicht über dem Hintergrund grüne Fluoreszenz detektiert werden.

Eine schematische Darstellung der durchgeführten Versuche in der Zellklone meadass die Wirkung der Acf1 oder SNF2h Knockdown auf E4orf4-induzierten Zelltod ist in Abb. 4. Die Zeit für Knockdown der Genexpression durch Doxycyclin Behandlung erforderlich kann variieren in Abhängigkeit von der Stabilität des Proteins, dessen Pegel reduziert werden sollte. Für Acf1 und SNF2h wurde eine 72 h Behandlung für effiziente Knockdown auf Proteinebene erforderlich.

Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für Zellen, die GFP und E4orf4 und durchläuft Zelltod durch das Auftreten von DAPI-gefärbten Kerne mit einem kondensierten oder fragmentierte Morphologie manifestiert. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments zeigen, dass Doxycyclin-induzierte Acf1 Knockdown an eine LED Erhöhung E4orf4-stimulierten Zelltod (Figur 6A). Dieser Anstieg nicht von einer Erhöhung der E4orf4 Ebenen (6B) führen. Ferner vermindert Wiederherstellung Acf1 den Doxycyclin-induzierte Zellen die Steigerung E4orf4 Toxizität für den Pegeln beobachtet in nicht induzierten Zellen (Abb. 6).

Abbildung 1. Karte der pSuperior.neo + GFP-Plasmid. Die Karte zeigt das Tetracyclin-induzierbaren H1-Promotor, der shRNA Expression und den PGK-Promotor die Expression eines neo-GFP-Fusionsprotein. Die Karte wurde von der OligoEngine pSuperior manuelle angepasst.

Abbildung 2. Identifizierung von Neomycin-resistente Kolonien. Bilder einer Platte mit Kolonien (A) und einer einzelnen Kolonie (B) gezeigt. Die Kolonien wurden durch Kultivierung der Zellen für 14 Tage in einem selektiven Medium, das Neomycin erhalten.

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Abbildung 3. Untersuchung der Effizienz Knockdown in ausgewählten Kolonien. Zellen von mehreren Kolonien in Gegenwart von Neomycin selektiert wurden in zwei Vertiefungen ausplattiert. Ein gut jeder Probe wurde durch Doxycyclin (+) induziert und eine Vertiefung wurde unbehandelt gelassen (-). Proteine ​​wurden 72 Stunden nach der Induktion entnommen und chromatographiert auf SDS-PAGE. Der Western-Blot wurde nacheinander mit Antikörpern gegen SNF2h und alpha-Tubulin (dient als Ladungskontrolle) gefärbt und zeigt SNF2h Ebenen induzierten und Kontrollzellen.

Abbildung 4. Planen Sie einen typischen knockdown-DAPI-Assay Experiments. Aufeinanderfolgende Schritte des Experiments gezeigt, einschließlich Doxycyclin Behandlung Acf1 oder SNF2h knockdown, eine Transfektion Acf1 oder SNF2h Ausdruck wiederherzustellen oder um eine emp einzuführen erreichenty Vektors und E4orf4 oder ihrer entsprechenden leeren Vektor in die Zellen eingeführt, und die Analyse der Ergebnisse. Doxycyclin-behandelten Platten werden in rot dargestellt (Dox) und Betätigungsplatten sind blau markiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 5. Nachweis von E4orf4-induzierten Zelltod durch die DAPI-Assay. Zellen, die die verschiedenen Behandlungen in 4 beschrieben unterzogen wurden fixiert und mit Antikörpern E4orf4 und DAPI, um die Kerne von transfizierten Zellen sichtbar zu machen. Diese spezifische Bild wurde aus einer Probe, die der Steuerung und E4orf4 GFP-Proteins entnommen. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Zusammengeführte Bilder. Die weißen Pfeile markieren GFP-und E4orf4-transfizierten Zellen mit Kernen mit apoptotischen Morphologien. Rote Pfeilemarkieren Kerne mit unregelmäßigen Formen, die nicht als apoptotischen Kernen gezählt. Sternchen markieren mitotischen Kerne oder Kerne, die gerade geteilt haben.

Abbildung 6. Acf1 Knockdown verbessert E4orf4-induzierten Zelltod. (A) Zellen der T-Rex-293-abgeleitete Zelllinie Acf1-shRNA von einem Tetracyclin-induzierbarer Promotor wurden mit Doxycyclin (+ Dox) oder unbehandelt (-Dox) induziert. Drei Tage später wurden die Zellen mit Plasmiden, E4orf4 (+ E4orf4) oder einen leeren Vektor (-E4orf4) zusammen mit einem leeren Vektor oder ein Plasmid, die GFP-markierten Acf1, die resistent gegen die shRNA wurde gemacht durch die Einführung stiller transfiziert Mutationen. Die Zellen waren vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion fixiert und mit Antikörpern gegen E4orf4 und mit DAPI fixiert. Induktion des Zelltods wurde durch das DAPI oben beschriebenen Test und dem Prozentsatz o gemessenf transfizierten Zellen mit kondensierten oder fragmentierte Kerne bestimmt. Ein repräsentatives Experiment mit drei Wiederholungen gezeigt und Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. (B) Zellen von parallelen Platten wurden für Western Blot-Analyse geerntet. Der Blot wurde mit Antikörpern gegen E4orf4, GFP und Acf1 angefärbt. Die endogene Acf1 und Acf1-GFP in zwei getrennten Platten gezeigt.

Diskussion

Knockdown der Genexpression ist ein wichtiger Ansatz zur Untersuchung des Beitrags von einem Protein zu Regulationswege. Da konstitutive knockdown der Expression von essentiellen Genen wirkt sich negativ auf Zellproliferation, können ihr Studium erfordern entweder vorübergehende Einführung von siRNAs oder Anwendung von stabilen bedingte knockdown Systeme. Erzeugung stabiler Zelllinien mit der Fähigkeit zur Arzneimittel-induzierter Expression von shRNAs hier beschrieben, bietet einen Vorteil gegenüber transienten Tr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
DMEM high glucose	Gibco	41965
Tet-System zugelassenen FBS	Clontech	631106
L-Glutamin	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200
T-REx-293-Zellen	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
Blasticidin	Invitrogen	R210-01
pSuperior.neo + GFP-Plasmid	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus Transfektion	101-40
Doxycyclin	Sigma	D9891
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710
4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01